專利名稱：大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro及其特異性LAMP引物組合物和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，涉及大豆疫霉的檢測靶標序列A3apix)及其特異性LAMP引物組合物和應用。
背景技術：
大豆疫霉菌(Phytophthorasojae Kaufmann&Gerdemann)侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生產上的毀滅性病害之一，也是我國對外公布的ー類檢疫對象。大豆疫霉根腐病最早于1948年在美國印第安那州被發現[3]，此后，加拿大、巴西、阿根廷等二十多個大豆生產國家相繼報道了該病害的發生[2’6]。蘇彥純[1°]等于1993年首次報道了我國的黑龍江大豆主產區發生大豆疫霉根腐病,此后在我國北方的大豆主產區陸續發現大豆疫霉的危 害。目前每年給全球大豆生產造成的經濟損失超過10億美元[8]。為了阻止大豆疫霉傳播范圍的不斷擴大，使大豆疫霉根腐病得到控制，需要對其進行快速、準確地檢測。傳統的檢測大豆疫霉的方法是進行大豆葉碟誘捕和平板培養或者將二者相結合[ia°]。傳統方法在大豆疫霉檢測中發揮了重要作用，但是費時費カ而且要求操作者具備專業的疫霉分離、形態學鑒定知識和豐富的經驗。隨著核酸相關的鑒定方法的發展，基于PCR的方法已經成功用于檢測大豆疫霉[7]，雖然PCR法在特異性和敏感性上有較大的提高，但是檢測時間仍然比較長，大概4 5h，同時PCR方法依賴精密的溫度循環裝置。其檢測靈敏度比較高，但是檢測過程復雜，不能滿足快速檢測的需求。環介導等溫擴增技術(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)是日本的榮研株式會發明的一種新的核酸擴增技術[4]，因為其操作簡單、快速、特異性高、成本低等優點，成為可以替代PCR的新的核酸擴增技木。它是針對靶基因的6個區域設計4種特異的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環鏈置換反應，60 65°C范圍60min內，大量合成目標DNA的同時伴隨有副產物——白色的焦磷酸鎂沉淀產生。由于LAMP擴增過程依賴識別靶序列6個獨立區域，所以反應特異性很強，并且核酸擴增過程是在恒溫條件下進行，普通水浴鍋或者有穩定熱源的設備就能滿足反應要求，檢測成本大大降低。靶標基因的選擇是LAMP檢測的重要因素之一。以PCR技術檢測大豆疫霉菌是基于核糖體基因序列[7]，但由于核糖體序列沒有足夠多的位點來區分所有的病原菌，因此開發出新的檢測靶標成為檢測的熱點。

發明內容
本發明的目的在于提供ー種大豆疫霉的檢測靶標序列A3apix)。本發明的另ー目的是提供該大豆疫霉的檢測靶標序列A3apix)的其特異性LAMP引物組合物。本發明的又一目的是提供該大豆疫霉的檢測靶標序列A3apix)及其LAMP引物組合物的應用。
本發明的目的可通過如下技術方案實現大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro，核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。所述的大 疫霉的檢測祀標序列A3apro在檢測或鑒定大 疫霉中的應用。針對所述的大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro設計的特異性的LAMP引物組合物，分別為正向內引物FIP :SEQ ID NO. 2，反向內引物BIP :SEQ ID NO. 3，正向外引物F3 :SEQID NO. 4，反向外引物 B3 :SEQ ID NO. 5。所述的針對所述的大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro設計的特異性的LAMP引物組合物在檢測或鑒定大 疫霉中的應用。ー種用于檢測大豆疫霉的LAMP檢測試劑盒，包含所述的特異性的LAMP引物組合物。
所述的用于檢測大豆疫霉的LAMP檢測試劑盒，包含由1.6口11正向內引物？1卩、
I.6μΜ反向內引物ΒΙΡ、0. 2μΜ正向外引物F3、0. 2μΜ反向外引物B3、l. 4mM dNTPs、20mMpH 8.8 的 Tris-HClUOmM KCl、IOmM(NH4)2S04、6mM MgS04、0. I % Triton X_100、8U BstDNApolymerase 320單位、180mM羥基萘酚藍，加入超純水制備成檢測溶液。一種檢測大豆疫霉的方法，提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA為模板，利用所述的特異性的LAMP引物組合物進行LAMP ;擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下檢測結果(羥基萘酚藍不會影響電泳結果)，如果存在特征性梯狀條帶，則證明所檢測的病原為大豆疫霉；輕基萘酹藍(hydroxyl naphthol blue, HNB)屬于金屬離子指示劑的ー種。HNB是Mg2+的滴定劑，其顏色隨溶液pH變化而改變，因此可以通過監測LAMP反應體系中Mg2+濃度的變化及溶液pH而起到顏色指示劑的作用。反應前將HNB加入到反應液中，反應體系呈紫色，反應過程中Mg2+與LAMP反應的副產物P2O74-結合產生大量沉淀，隨著環介導等溫擴增反行的進行，溶液中Mg2+濃度降低，pH發生變化，從而使HNB的顔色由紫色變為天藍色。因此，反應結束后通過反應體系的顏色變化，來判斷大豆疫霉的有無天藍色表示檢測為陽性，存在大 疫霉；紫色表檢測結果為陰性，不存在大 疫霉。所述的檢測大豆疫霉的方法優選提取待檢微生物的DNA，取1μ I DNA溶液，カロ入23 μ I所述的檢測溶液和2μ I滅菌去離子水進行LAMP，LAMP反應程序為60°C 65。C，55 90min,優選 64°C，80min。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下檢測結果(羥基萘酚藍不會影響電泳結果)，如果存在特征性梯狀條帶，則證明所檢測的病原為大豆疫霉；或者以LAMP反應體系的顏色變化做為結果判定標準，天藍色表示檢測為陽性，存在大豆疫霉；紫色表示檢測結果為陰性，不存在大 疫霉。有益效果大豆疫霉的Avr3a無毒基因是Signal peptide-RXLR結構的效應分子[5]。發明人對大豆疫霉Avr3a進行精確定位和克隆的過程中，發現Avr3a座落于ー個疫霉屬非常保守的區域中。在Avr3aATG上游的I. 5kb范圍內有I個300bp的缺失突變(圖I)，將該序列命名為A3apro。將缺失的A3apro的核酸序列(SEQ ID NO. I)進行BLAST比對，發現了其在P. infestans, P. ramorum 和 Hylaperonospora parasitica 的基因組數據庫中的同源性序列，但其序列的同源性較低，適合作為大豆疫霉菌的檢測靶標。本發明分析了大豆疫霉菌的檢測靶標序列A3apro和其他疫霉菌在序列上的差異，設計了四條特異性的LAMP引物，在此基礎上建立了檢測大豆疫霉的LAMP體系。本發明提供的檢測大豆疫霉的LAMP方法克服了現有技術中大豆疫霉的生物學檢測方法所需周期長、費時費力、繁瑣、特異性差的問題及PCR檢測技術需要熱循環儀器，無法快速檢測大豆疫霉菌的問題。本發明檢測方法在64° C等溫條件下，能快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到大豆疫霉菌，不需要復雜儀器，能較好滿足對大豆疫霉菌的現場檢測，為檢疫性病害大豆疫霉菌的檢測提供了新的技術平臺，能較好滿足目前對大豆疫病的現場檢測的迫切需要，用于進出口檢疫、田間檢疫等的現場檢測，易于大范圍推廣應用。


圖I大豆疫霉類轉座子序列示意圖。圖2實施例3LAMP檢測大豆疫霉的特異性結果圖 (a) LAMP檢測大豆疫霉菌的特異性的瓊酯糖凝膠電泳圖。其中，M為IOObp DNA marke。I :標準大豆疫霉菌株P6497 ;2_7 :分別為大豆疫霉生理小種R3、R6、R8、R12、R14、R17 ；8 :陰性對照;9_12 :分別為大豆疫霉生理小種R19、R20、R28、R31 ；13 :陰性對照。(b)顔色判定LAMP檢測大豆疫霉菌的特異性顯色圖。圖中顯示第I 7管以及第9 12管顯天藍色，呈陽性；第8管和第13管顯紫色，呈陰性。其中，I :標準大豆疫霉菌株6497 ;2_7 :分別為大豆疫霉生理小種R3、R6、R8、R12、R14、R17 ；8 :陰性對照；9-12 :分別為大豆疫霉生理小種R19、R20、R28、R31 ；13 :陰性對照。圖3實施例4基于顏色判定通過對疫霉種及其它種的菌株進行LAMP檢測大豆疫霉的特異性。圖中顯示第I管以及第9管顯天藍色，呈陽性；其余各管顯紫色，呈陰性。I :標準大 疫霉囷株6497 ；2 :芒麻疫霉；3 :橡樹疫霉；4 :掘氏疫霉；5 :惡疫霉；6 :瓜類疫霉；7 :致病疫霉；8 :陰性對照；9 :標準大豆疫霉菌株6497 ；10 :終極腐霉；11 :木賊錸刀菌；12 :平頭炭疽菌；13 :稻瘟病菌；14 :立枯絲核菌；15 :大麗輪枝菌；16 :陰性對照。圖4實施例5LAMP檢測大豆疫霉的靈敏度結果圖LAMP擴增不同濃度基因組DNA ;從左到右分別為25 μ L的反應體系中分別含有100ng、10ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg、10fg 大豆疫霉 DNA 的擴增結果。(a) LAMP檢測大豆疫霉菌靈敏的瓊酯糖凝膠電泳圖。LAMP反應能從P. sojae菌株中特異地擴增出梯形狀的條帶。電泳圖表明LAMP反應的靈敏度達到10pg。M為IOObp DNAma rker。(b)顏色判定LAMP檢測大豆疫霉菌的靈敏度顯色圖。25 μ L的反應體系中分別含有lOOng、10ng、lng、100pg、IOpg大豆疫霉DNA的反應管顯天藍色，呈陽性反應，25 μ L的反應體系中分別含有lpg、IOOfgUOfg大豆疫霉DNA的反應管顯紫色，呈陰性反應。顯色結果表明LAMP反應的靈敏度達到10pg。圖5顔色判定從海關進境大豆帶菌土樣中檢測大豆疫霉1-7為海關進境大豆帶菌土樣中大豆疫霉的擴增結果，顯天藍色，表明存在大豆疫霉菌；8為陰性對照，顯紫色，表明不存在大豆疫霉菌。
具體實施例方式實施例I通過全基因測序結果顯示大豆疫霉生理小種R7的Avr3a啟動子區有ー個約300bp的片段缺失和兩個小片段的插入。在大豆疫霉的JGI基因組數據庫中，300bp的缺失序列在大豆疫霉全基因范圍內居然有超過200條的記錄，彼此之間非常保守并且分布在基因組的各個區域。判斷該300bp的片段(SEQ ID NO. I)為轉座子序列，并將其命名為A3apro。通過A3apro (SEQ IDNO. I)作為模板序列使用在線LAMP引物設計軟件primerExplorer V4(http://primerexplorer. jp/elamp4. O. 0/index, html)設計引物。將模板序列上傳后，由系統軟件計算獲得初歩的LAMP引物組合，再通過軟件提供的引物相應的3’端或5’端穩定性及引物ニ聚體等參數對設計出的多對引物進行比較選擇，最終選取ー組最合適的引物，正向內引物FIP:SEQ ID NO. 2，反向內引物BIP :SEQ ID NO. 3，正向外引物F3 :SEQ ID NO. 4,反向外引物B3 =SEQID NO. 5。
實施例2ー種用于檢測大豆疫霉的LAMP檢測試劑盒，包含由1.6口]\1正向內引物？1卩、1.6“] 反向內引物81 、0.24]\1正向外引物？3、0.24]\1反向外引物83、1.41111 dNTPs、20mMpH 8· 8 的 Tris-HClUOmM KCl、IOmM(ΝΗ4) 2S04、6mM MgS04、0. I % Triton X_100、8U BstDNApolymerase 320單位、180mM羥基萘酚藍，加入超純水制備成檢測溶液。實施例3大豆疫霉菌LAMP反應的特異性試驗ー為了驗證LAMP方法的特異性，選擇標準大豆疫霉菌株6497 (購自ATCC，編號為ATCC 16705，下同)以及與大豆疫霉同一種的不同生理小種R3、R6、R8、R12、R14、R17、R19、R20、R28、R31的DNA作為模板，取I μ I DNA溶液，加入23 μ I實施例2所述的檢測溶液和
2μ I滅菌去離子水進行LAMP反應，反應程序為64° C 60min。結果顯示用LAMP引物去擴增大豆疫霉的生理小種的DNA模板吋，都擴增出條帶；而陰性對照沒有能夠擴增出目的條帯。特異性LAMP反應能從供試的大豆疫霉菌株中特異地擴增出梯形狀的條帶，表明該引物組合物具有種的特異性。同時基于反應體系顔色反應判定擴增大豆疫霉的生理小種的DNA模板時，呈現天藍色；陰性對照呈現紫色。這表明本發明建立的LAMP檢測方法具有很好的特異性(圖2)。實施例4大豆疫霉菌LAMP反應的特異性試驗ニ為了驗證LAMP方法的特異性，選擇與大豆疫霉不同種(苧麻疫霉；橡樹疫霉；掘氏疫霉；惡疫霉；瓜類疫霉；致病疫霉)和不同屬的菌(終極腐霉；木賊錸刀菌；平頭炭疽菌；稻瘟病菌；立枯絲核菌；大麗輪枝菌)的DNA作為模板，取I μ I DNA溶液，加入23 μ I實施例2所述的檢測溶液和2 μ I滅菌去離子水進行LAMP反應，反應程序為64° C 60min。結果顯示基于顏色反應判定擴增大豆疫霉的DNA模板時，呈現天藍色；與大豆疫霉不同種、不同屬的菌和陰性對照都呈現紫色(圖3)。實施例5大豆疫霉菌LAMP反應的靈敏度試驗為了確定LAMP檢測方法的靈敏度，將提取的標準大豆疫霉菌株6497DNA用分光光度計測定濃度(I μ g/μ I)后用DEPC水進行10倍比稀釋，-70°C保存作為模板。分別取10倍比稀釋后的各濃度DNA稀釋液I μ L作為模板，加入23 μ I實施例2所述的檢測溶液和
2μ I滅菌去離子水進行LAMP反應，反應程序為64° C 60min。取2 μ L擴增產物上樣，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，結果顯示LAMP方法可以檢測到濃度是IOpg的大豆疫霉的DNA。HNB顯色反應表明LAMP反應的靈敏度也達到IOpg (圖4)。實施例6從海關進境大豆帶菌土樣中檢測大豆疫霉I) 土壤中卵孢子的富集取待檢土壤樣品20 100克，研碎，先后采用200目篩網去處較大土粒，然后經過400,500,800目篩網過濾，同時用3 10升水反復沖洗，從800目篩網上收集卵孢子，用Iml水懸浮。由于卵孢子不能透過800目篩網，這樣處理可以達到使卵孢子富集的效果。
2 )從微量卵孢子中提取DNA 將用無菌水懸浮的卵孢子轉移到I. 5mL的離心管中，在12000r. min-1轉速下離心5分鐘，倒出液體；加入50 μ L CTAB buffer，研磨，再加入 500 μ L CTAB buffer，水浴 30 分鐘；加入等體積氯仿抽提，在12000r. min-1轉速下離心10分鐘，吸取上清；加入I /10體積的3M NaAc，2倍體積的無水冰こ醇，室溫沉淀30分鐘，12000r.min-1轉速下離心10分鐘,倒干液體；カロImL 70% (V/V)こ醇洗漆，12000r. min_l轉速下離心10分鐘,倒干液體,晾干
至無酒精味；加10 μ L無菌雙蒸水溶解，用于LAMP擴增的模板。3 )大豆疫霉LAMP檢測，包括取I μ I DNA溶液，加入23 μ I實施例2所述的檢測溶液和2 μ I滅菌去離子水，總體積為25 μ I ;反應程序為64° C 60min ;以HNB (輕基萘酹藍)作為反應指示劑，擴增結束后LAMP反應體系的顏色呈現天藍色，以此判斷從海關進境大豆帶菌土樣中能夠產生陽性反應含有大豆疫霉菌(圖5)。實施例7感病大豆植物的LAMP檢測采用NaOH堿裂解法提取接種大豆疫霉的大豆植株的DNA，將其作為模板用于LAMP擴增。取IuLDNA溶液，按實施例6的方法，進行LAMP反應。結果顯示接種大豆疫霉的大豆植株組織中進行LAMP，其顔色反應也呈現陽性天藍色；而健康植株和陰性對照呈現紫色。參考文獻I. Canaday, C.，and Schmitthenner, A. 1982. Isolating Phytophthoramegasperma f. sp. giycinea from soil with a baiting method that minimizes Pythiumcontamination.Soil Biology and Biochemistry 14 :67-68.2. Erwin, D.，Ribeiro, 0.，and Shattock，R. 1996. Phytophthora diseasesworldwide. APS press St Paul，MN，USA.3. Kaufmann, M. J.，and Gerdemann, J. 1957. Root and stem rot of soybeancaused by Phytophthora sojae n.sp.University of Illinois at Urbana-しhampaign.4. Notomi，T.，Okayama, H.，Masubuchi，H.，Yonekawa，T.，Watanabe，K.，Amino,N. , and Hase,T. 2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic AcidsResearch 28 :e63_e63.5. Qutob，D.，Tedman-Jones，J.，Dong, S.，Kuflu，K.，Pham, H.，Wang, Y.，Dou，D.，Kale，S.，Arredondo，F.，and Tyler, B. 2009. Copy number variation andtranscriptional polymorphisms of Phytophthora sojae RXLR effector genes Avrlaand Avr3a. PLoS One 4 :5066.6. Schmitthenner, A. 1985. Problems and progress in control ofPhytophthora root rot of soybean. Plant disease69 362.7. Wang, Y.，Zhang, W.，and Zheng, X. 2006. Rapid and sensitive detection ofPhytophthora sojae in soil and infected soybeans by species-specific polymerasechain reaction assays. Phytopathology 96 :1315-1321.8. Wrather, J.，Stienstra, W.，and Koenning，S. 2001. Soybean disease lossestimates for the United States froml996 to 1998.Canadian Journal of PlantPathology 23 :122-131. 9.朱振東，王化波，王曉鳴，常汝鎮，and武小菲.2003.中國大豆疫霉菌分布及毒力多樣性研究.中國農業科學36 :793-799.10.蘇彥純，and沈崇堯.1993.大豆疫霉病菌在中國的發現及其生物學特性的研究.植物病理學報。
權利要求
1.大豆疫霉的檢測靶標序列A3apix)，其特征在于核苷酸序列如SEQID NO. I所示。
2.權利要求I所述的大ii疫霉的檢測祀標序列A3apro在檢測或鑒定大ii疫霉中的應用。
3.針對權利要求I所述的大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro設計的特異性的LAMP引物組合物，其特征在于包含正向內引物FIP :SEQ ID NO. 2，反向內引物BIP :SEQ ID NO. 3，正向外引物F3:SEQ ID NO. 4，反向外引物B3 :SEQ ID NO. 5。
4.權利要求3所述的針對權利要求I所述的大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro設計的特異性的LAMP引物組合物在檢測或鑒定大豆疫霉中的應用。
5.一種用于檢測大豆疫霉的LAMP檢測試劑盒，其特征在于包含權利要求3所述的特異性的LAMP引物組合物。
6.根據權利要求5所述的用于檢測大豆疫霉的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包含由1.611|1正向內引物？1 、1.611|1反向內引物81 、0.211|1正向外引物？3、0.2iiM 反向外引物 B3、l. 4mM dNTPs、20mM pH 8. 8 的 Tris-HCl、IOmM KCl、IOmM(NH4)2S04、6mM MgS04、0. 1% Triton X_100、8U Bst DNA polymerase 320 單位、180mM 羥基萘酚藍，力口入超純水制備成檢測溶液。
7.—種檢測大豆疫霉的方法，其特征在于提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA為模板，利用權利要求3所述的特異性的LAMP引物組合物進行LAMP ； 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下檢測結果，如果存在特征性梯狀條帶，則證明存在大疫霉； 或者以LAMP反應體系的顏色變化做為結果判定標準，天藍色表示檢測為陽性，存在大豆疫霉；紫色表示檢測結果為陰性，不存在大豆疫霉。
8.根據權利要求7所述的檢測大豆疫霉的方法，其特征在于提取待檢微生物的DNA，取Iul DNA溶液，加入23 u I權利要求6所述的檢測溶液和2 u I滅菌去離子水進行LAMP，LAMP 反應程序為60°C 65。C，55 90min，優選 64°C，80min ； 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下檢測結果，如果存在特征性梯狀條帶，則證明存在大疫霉； 或者以LAMP反應體系的顏色變化做為結果判定標準，天藍色表示檢測為陽性，存在大豆疫霉；紫色表示檢測結果為陰性，不存在大豆疫霉。
全文摘要
本發明屬于基因工程領域，涉及大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro及其特異性LAMP引物組合物和應用。大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。針對A3apro設計的特異性的LAMP引物組合物，包括正向內引物FIPSEQ ID NO.2，反向內引物BIPSEQ ID NO.3，正向外引物F3SEQ ID NO.4，反向外引物B3SEQ ID NO.5。所述的特異性的LAMP引物組合物可在檢測或鑒定大豆疫霉中應用。本發明LAMP引物組合物用于檢測大豆疫霉具有良好的特異性靈敏度，擴增快速、高效，且鑒定簡便的優點。
文檔編號C12Q1/68GK102676511SQ201210153468
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月16日 優先權日2012年5月16日
發明者戴婷婷, 王源超, 董莎萌, 鄭小波 申請人:南京農業大學