專利名稱：一種microRNA定量檢測方法
技術領域：
本發明涉及核酸檢測領域，具體來說是ー種microRNA三步定量檢測方法。該方法主要應用于microRNA表達譜分析、microRNA臨床診斷、microRNA研究檢測和microRNA相關藥物研究以及篩選。
背景技術：
microRNA (miRNA)是ー類長度約為20-24個核苷酸(nt)的具有調控功能的非編碼RNA。miRNA主要參與基因轉錄后水平的調控。miRNA基因首先在細胞核內轉錄成前體轉錄本(primary transcripts miRNA, pri-miRNA),在一種核糖核酸酶Drosha的作用下剪切形成約60-70nt的miRNA前體(pre-miRNA);轉運到細胞質后，另ー種核糖核酸酶Dicer將 其剪切成約為22nt的miRNA:miRNA雙鏈。這種雙鏈miRNA很快被引導進入RNA誘導沉默復合體(RISC)中，其中一條單鏈miRNA被降解，另一條成熟的單鏈miRNA分子通過與靶基因互補配對而促進其降解或抑制其翻譯。相同的miRNA分子在不同種屬、不同組織器官以及不同細胞之間具有相似的調控功能，因此其具有保守性。但不同組織器官、不同細胞以及細胞發育的不同階段，其miRNA的表達譜并不相同。這ー細胞及“時空”特異性使其可以作為某些組織器官、不同細胞以及細胞發育不同階段的特異性分子標志。miRNA已經成為近年來的研究熱點，利用芯片及qPCR技術可以對其定量并分析。目前采用qPCR技術對miRNA進行定量檢測的方法主要有三種(I)在常規引物延伸技術(PE)的基礎上建立的引物延伸定量PCR法(PE-qPCR)，即先通過ー個加尾的miRNA特異性引物(GSP)將miRNA反轉錄成加尾cDNA,然后利用ー個鎖核酸(Locked nucleicacid, LNA)修飾的miRNA特異性反向引物(RP)和一個與加尾序列一致的通用引物(UP)進行PCR擴增。由于在DNA轉錄過程中，miRNA的3’端序列產生的多樣化現象，使得目前市場上qPCR兩步檢測法的準確性受到很大影響。(2)利用莖-環狀引物反轉錄miRNA，稱為stem-loop RT-qPCR檢測法, -環狀反轉錄引物中除含有一段與miRNA互補的特異性序列外，還含有一段較長的共有序列，與靶miRNA退火反轉錄后，能得到一個較長的反轉錄擴增子(cDNA)，共有序列提供了ー個通用引物結合位點，然后通過ー個與miRNA序列特異的引物和ー個通用引物進行PCR擴增。深度測序結果表明，miRNA的3’末端多發生降解，莖環結構反轉錄引物擴增中存在潛在的擴增靈敏度問題。(3)三步檢測法，先用polyA聚合酶(PAP)處理總RNA，使miRNA的3’端加上一段polyA尾巴，然后用5’端含有接頭序列的PolyT引物進行反轉錄，使第一鏈cDNA加上一段接頭，為隨后的PCR擴增提供通用反向引物序列，再利用一條miRNA序列特異性正向引物就可實現PCR擴增。然而，常規三步檢測法的特異性和靈敏度都相對較差。

發明內容
為了克服現有技術中miRNA定量檢測方法存在的問題，本發明對常規的miRNA三步定量檢測法進行了改進，建立了一種新的miRNA三步定量檢測法，該方法可以對miRNA的表達進行定量檢測和分析，大大提高了現有檢測方法的特異性、靈敏性和重復性。發明人分析了 miRNA數據庫中的1600多條人類miRNA和900多條小鼠的miRNA序列后設計了獨特的接頭序列，其序列不與庫中的任意一條miRNA發生錯配或形成ニ聚體，在提高檢測靈敏性的同時保證了擴增的特異性。另ー方面，反向引物還采取了雙引物混搭的特殊設計，長度不同的兩條反向引物均能夠以加尾反轉錄處理得到的帶有接頭序列的cDNA為模板進行擴增，長引物充分保證擴增的特異性，短引物則大大提高擴增的靈敏性。本發明提供了ー種miRNA定量檢測方法，包括如下步驟(I)提取樣本的總RNA ；
(2)用polyA聚合酶處理總RNA，使miRNA的3’端加上一段polyA尾巴；(3)用5’端含有接頭序列的oligo (dT)反轉錄引物進行反轉錄，使得到的第一鏈cDNA加上一段接頭；(4)使用待測miRNA序列特異性正向引物和與所述接頭序列互補的通用反向引物進行定量實時PCR擴增；其中，所述通用反向引物是長度不同的兩種反向引物的混合物；長反向引物由3’部分和5’部分組成，其中，3’部分與步驟(3)中反轉錄得到的第一鏈cDNA的接頭5’端的部分序列互補，5’部分不與所述第一鏈cDNA的接頭互補；短反向引物是長反向引物的片段，其缺少長反向引物3’端的部分序列。在ー個特定的實施方案中，步驟(I)中，提取樣本總RNA之前先在樣本中加入External Control-1,以監控樣本中RNA的提取質量。優選地,所述External Control-I的序列為 5’-CAACCTCCTAGAAAGA-3’ (SEQ ID NO:I)。在ー個特定的實施方案中，步驟(2)中，加polyA反應體系中加入ExternalControl-2,以監控miRNA的加尾及反轉錄質量。優選地,所述External Control-2的序列為 5’ -TGAGCAACGCGAACAA-3’ (SEQ ID NO :2)。在ー個特定的實施方案中，所述接頭序列為5’ -AGGCAGAGCTATGAACGCAGTCTGC-3’(SEQ ID NO :3);反轉錄引物序列為 5’ -AGGCAGAGCTATGAACGCAGTCTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’ (SEQ ID NO 4)(其中，V 為 A 或 C 或 G，N 為 A 或 T 或 C 或 G);所述短反向引物和長反向引物的序列分別為5’-CTACCACTGCTCAGCACAGGCAAGGCA-3’ (SEQ ID NO :5)和 5’ -CTACCACTGCTCAGCACAGGCAAGGCAGAGCTATGAACGCAGTCTGC-3’ (SEQID NO :6)。優選地,通過測定定量實時PCR擴增過程中樣本中待測miRNA及兩種ExternalControl的Ct值來計算樣本中待測miRNA的相對含量。以 似的方式表示樣本中待測miRNA的水平，其中Λ Ct為待測miRNA與External Control-1的Ct值之差。將樣本中待測miRNA的相對含量與正常樣本中同樣miRNA的相對含量進行比較，即可看出樣本中待測miRNA表達量的變化。本發明的有益效果(I)準確性高在DNA編輯過程中，miRNA 3’端序列經常會出現退化(degeneration)現象,這種退化的發生使得目前市場上qPCR兩步檢測法的準確性受到影響。而本發明的三步檢測法因加入了 oligo(dT)和接頭序列極大地提高了檢測的敏感性。(2)可重復性外源miRNA標準品比傳統的U6以及Ul基因作為標準更加可靠，可以更加準確的監控整個流程，同時也可以更加準確地對樣品進行定量。
(3)敏感性本發明獨特設計的反向長短引物共同使用極大地增強了樣品檢測的敏感性。


圖I本發明的microRNA三步定量檢測方法的流程圖。圖2Hsa-miR_103a擴增產物的熔解曲線。
具體實施例方式實施例I血清中Hsa-miR_103a含量的檢測Hsa-miR-103a 的序列為 5，-AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA-3’ (SEQ IDNO :7)。 I.血清中總RNA的提取抽取兩個成人各2ml血液，凝血后進行離心，最后取上層血清Iml置于I. 5ml的RNase/DNase-free 離心管中。使用RNA提取試劑盒(北京曠博生物技術有限公司)自血清中提取總RNA，每250 μ I 血清中加入 1μ I (20ηΜ)序列為 5’ -CAACCTCCTAGAAAGA-3’ (SEQ ID NO :1)的External Control-1 (上海生エ生物工程技術有限公司合成)來監控血清中RNA的提取質量。提取的總RNA使用Thermo NanoDrop 2000c測定濃度。2.三步法定量檢測血清中的HSA-miR_103a(I)加 polyA 尾:i.在無RNA酶的PCR管(Axygen公司，200 μ I)中配制加polyA尾的反應液,體系為 20 μ I。姆 20 μ I 體系中加入 I μ I (20ηΜ)序列為 5’ -TGAGCAACGCGAACAA-3’ (SEQ IDNO 2)的External Control-2 (上海生エ生物工程技術有限公司合成)來監控miRNA的加
尾及反轉錄質量。
組分加入Μ:(μ1)
External Control-2 (20nM)I
E.Coli polyA polymerase0.5
E.Coli polyA polymerase IOxBiiffer2dATP (IOmM)2
RNAχ
RNase - free water14-x
RNase Inhibitor0.5
總體積20(注加入的RNA體積由RNA的濃度確定，x=500ng/RNA濃度，本實驗所使用的酶均為北京曠博生物技術有限公司的產品。)ii.將裝有配置好反應液的PCR管放入PCR儀(Thermo)中37°C孵育I小時。(2 ) RT-PCR 得到 cDNA 單鏈i.向(I)得到的反應液中加入 0. 5 μ I (0. 5ng/ μ I)序列為 5，-AGGCAGAGCTATGAACGCAGTCTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’ (SEQ ID NO :4)的 RT-Primer (上海生エ生物工程技術有限公司合成)，70°C孵育5min，立即放到冰上冰浴至少2min。ii.配制反轉錄反應液
權利要求
1.一種miRNA定量檢測方法,包括如下步驟 (1)提取樣本的總RNA； (2)用polyA聚合酶處理總RNA，使miRNA的3’端加上一段polyA尾巴； (3)用5’端含有接頭序列的oligo(dT)反轉錄引物進行反轉錄，使得到的第一鏈cDNA加上一段接頭； (4)使用待測miRNA序列特異性正向引物和與所述接頭序列互補的通用反向引物進行定量實時PCR擴增； 其中，所述通用反向引物是長度不同的兩種反向引物的混合物；長反向引物由3’部分和5’部分組成，其中，3’部分與步驟(3)中反轉錄得到的第一鏈cDNA的接頭5’端的部分序列互補，5’部分不與所述第一鏈cDNA的接頭互補；短反向引物是長反向引物的片段，其缺少長反向引物3’端的部分序列。
2.根據權利要求I所述的miRNA定量檢測方法，其中在步驟(I)中，提取樣本總RNA之前先在樣本中加入External Control-1,以監控樣本中RNA的提取質量。
3.根據權利要求2所述的miRNA定量檢測方法,其中所述ExternalControl-I的序列如 SEQ ID NO 1 所示。
4.根據權利要求I所述的miRNA定量檢測方法，其中在步驟(2)中，加polyA反應體系中加入External Control-2,以監控miRNA的加尾及反轉錄質量。
5.根據權利要求4所述的miRNA定量檢測方法,其中所述ExternalControl-2的序列如 SEQ ID NO 2 所示。
6.根據權利要求I所述的miRNA定量檢測方法，其中步驟(3)中，所述接頭序列如SEQID NO 3 所示。
7.根據權利要求6所述的miRNA定量檢測方法，其中步驟(3)中，所述反轉錄引物序列如 SEQ ID NO 4 所示。
8.根據權利要求I所述的miRNA定量檢測方法，其中步驟(4)中，所述短反向引物和長反向引物的序列分別如SEQ ID NO :5和6所示。
9.根據權利要求1-8任一項所述的miRNA定量檢測方法，還包括如下步驟 (5)測定定量實時PCR擴增過程中樣本中待測miRNA及兩種ExternalControl的Ct值； (6)以2_Aet的方式表示樣本中待測miRNA的水平，其中ACt為待測miRNA與ExternalControl-I的Ct值之差。
全文摘要
本發明公開了一種microRNA定量檢測方法，包括如下步驟(1)提取樣本的總RNA；(2)用polyA聚合酶處理總RNA，使miRNA的3’端加上一段polyA尾巴；(3)用5’端含有接頭序列的oligo(dT)反轉錄引物進行反轉錄，使得到的第一鏈cDNA加上一段接頭；(4)使用待測miRNA序列特異性正向引物和與所述接頭序列互補的通用反向引物進行定量實時PCR擴增，其中，所述通用反向引物是長度不同的兩種反向引物的混合物。本發明的方法可以對miRNA的表達進行定量檢測和分析，大大提高了現有檢測方法的特異性、靈敏性和重復性。
文檔編號C12Q1/68GK102676677SQ201210153449
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月16日 優先權日2012年5月16日
發明者李啟靖 申請人:北京曠博生物技術有限公司