專利名稱：辣椒疫霉的pcr檢測(cè)引物、含有該引物的試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及辣椒疫霉的檢測(cè)，具體地說(shuō)，涉及辣椒疫霉的PCR檢測(cè)引物、含有該引物的試劑盒及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物病原卵菌是一類重要的植物病原菌，可侵染危害多種植物，導(dǎo)致多種植物的毀滅性病害，如致病疫霉(Phytophthora infestans)、辣椒疫霉(P. capsici)、大豆疫霉 (P. sojae)、寄生疫霉(P. parasitic)、樟疫霉(P. cinnamomi)及冬生疫霉(P. hibemalis)分別引起馬鈴薯、辣椒、大豆、煙草、樟樹(shù)及柑橘的重要疫病，嚴(yán)重年份乃至絕產(chǎn)。該類病菌主要以菌絲體或卵孢子在病殘?bào)w或土壤中渡過(guò)不良環(huán)境而作為初侵染源，在適宜條件下，菌絲體或卵孢子均可萌發(fā)產(chǎn)生孢子囊-釋放游動(dòng)孢子，再借助雨水或氣流進(jìn)行傳播、侵染而導(dǎo)致植物病害。因此，對(duì)該類病菌的初侵源或侵染寄主早期進(jìn)行適時(shí)監(jiān)控，利于控制病害的發(fā)生，傳統(tǒng)的病害防控策略主要依靠品種、栽培、化防和生態(tài)調(diào)控等防治措施，這些防控措施主要在病害爆發(fā)乃至產(chǎn)生明顯危害時(shí)才實(shí)施，忽視了對(duì)初侵染源或侵染寄主早期適時(shí)采取綜合防控和高效治理措施，因而事倍功半，防效甚微，最終很難控制病害的發(fā)生與流行。辣椒疫霉(P. capsici)是我國(guó)常見(jiàn)辣椒病害種類，多在高溫高濕的環(huán)境下侵染辣椒，如朝天椒(Capsicum annnuum)、小米辣(C. frutescens),造成疫病,而使作物大幅度減產(chǎn)甚至絕收。辣椒疫霉在國(guó)內(nèi)也有侵染香蕉樹(shù)(Hevea brasiliensis)、木瓜(Chaenomelessinensis)、胡椒(Piper nigrum)、扁葉香果蘭(Vanilla planifolia)等作物的報(bào)道，因此開(kāi)發(fā)辣椒疫霉的早期快速檢測(cè)技術(shù)，對(duì)相關(guān)作物生產(chǎn)中的病害防控和無(wú)公害化具有重要的意義。近年來(lái)，PCR技術(shù)及其相關(guān)分子檢測(cè)技術(shù)已廣泛用于植物病原菌消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的分子檢測(cè)與預(yù)警，主要利用核糖體rDNA/ITS序列設(shè)計(jì)特異性引物來(lái)對(duì)植物致病菌進(jìn)行快速檢測(cè)。然而針對(duì)大豆疫霉、致病疫霉、辣椒疫霉、寄生疫霉、冬生疫霉的分子檢測(cè)技術(shù)研究結(jié)果表明，部分疫霉種間ITS序列差異很小，分辨度不高。Enl基因是烯醇化酶(enolase)編碼基因，它廣泛存在于真核生物中，目前尚無(wú)針對(duì)該靶基因設(shè)計(jì)的特異性辣椒疫霉檢測(cè)引物的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)辣椒疫霉的特異性引物及含有該引物的試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供上述引物及試劑盒在檢測(cè)辣椒疫霉中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的PCR檢測(cè)引物，其包括正向引物Enl4s :5’ -TGAAGTTCACGGCCAAGGTG-3’ 和反向引物Enlla :5’ -TGAACGTGTCCTCCGTCTCA-3’。
本發(fā)明還提供含有上述PCR引物的用于檢測(cè)辣椒疫霉的試劑盒，其中所述試劑盒包括引物ENL4s和ENLlS。前述試劑盒中還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。更優(yōu)選地，前述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。本發(fā)明進(jìn)一步提供上述PCR引物或試劑盒在檢測(cè)辣椒疫霉中的應(yīng)用，包括步驟I)提取樣品中的DNA ；2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)分析PCR產(chǎn)物，即對(duì)上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果判定樣品中是否含有辣椒疫霉。其中，PCR反應(yīng)體系以50 ill計(jì)為
模板 DNA2^ilIOmMdNTPs4^il10|iiM 引物 ENL4s1.5^il
10|iiM$*ENLla1.5^il
5U/|iil Taq DNA聚合酶0.5pl 10 x PCR反應(yīng)緩沖液50
0. IM Mg2+I^il
ddH20補(bǔ)足至500。PCR反應(yīng)條件為95°C 3分鐘；94°C 40秒，54°C 50秒，72°C I分鐘，共35個(gè)循環(huán)；72 0C 10 分鐘。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，若電泳檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)約200bp的DNA條帶，則該樣品含有辣椒疫
霉病菌。本發(fā)明分析了辣椒疫霉和其他疫霉菌在Enl和Ypt基因序列上的差異，發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)高度特異且只存在于辣椒疫霉中的位點(diǎn)，共設(shè)計(jì)出四對(duì)辣椒疫霉特異性引物Enl2s/Enl3a、Enl4s/Enlla、Ypt2s/Ypt3a和 Ypt2s/Ypt5a,從中選定靈敏性最強(qiáng)的 Enl4s/Enlla 引物對(duì)，并在此基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)辣椒疫霉的PCR體系。四對(duì)辣椒疫霉特異性引物的堿基序列如表I所示表I本發(fā)明涉及的辣椒疫霉特異性引物序列
權(quán)利要求
1.辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)的PCR檢測(cè)引物,其特征在于,其包括 正向引物 Enl4s :5’ -TGAAGTTCACGGCCAAGGTG-3’ 和反向引物 En I I a : 5 ’ -TGAACGTGTCCTCCGTCTCA-3，。
2.含有權(quán)利要求I所述引物的用于檢測(cè)辣椒疫霉的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括引物ENL4s和ENLlS。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。
5.權(quán)利要求I所述引物或權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述試劑盒在檢測(cè)辣椒疫霉中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟 1)提取樣品中的DNA； 2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 3)分析PCR產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于，PCR反應(yīng)體系以50計(jì)為模板 DNA2^il IOmMdNTPs4^il10|iiM 引物 ENL4s1.5^il 10|iiM$*ENLla1.5^il 5U/|iil Taq DNA聚合酶0.5pl 10 x PCR反應(yīng)緩沖液50 0. IM Mg2+I^ilddH20補(bǔ)足至500。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為95°C3分鐘；94°C40秒，54°C 50秒，72°C I分鐘，共35個(gè)循環(huán)；72°C 10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供辣椒疫霉的PCR檢測(cè)引物，所述引物包括ENL4s和ENL1a(如Seq ID No.1和2所示)。本發(fā)明基于辣椒疫霉和其他疫霉菌的Enl和Ypt基因的序列差異，共獲得四對(duì)可快速檢測(cè)辣椒疫霉病菌的特異性引物Enl2s/Enl3a、Enl4s/Enl1a、Ypt2s/Ypt3a和Ypt2s/Ypt5a，其中Enl4s/Enl1a靈敏度最高。在此基礎(chǔ)上建立PCR檢測(cè)體系，可從發(fā)病植物組織及土壤中復(fù)雜的病原菌環(huán)境快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出辣椒疫霉。根據(jù)該方法構(gòu)建的檢測(cè)試劑盒操作簡(jiǎn)便，特異性好，靈敏度高，可對(duì)辣椒疫霉的各種形態(tài)的繁殖體如菌絲、卵孢子和游動(dòng)孢子等進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)辣椒疫霉疫情的早期預(yù)警、疫區(qū)的病原監(jiān)測(cè)等方面具有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102643903SQ20121009349
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者孫翔, 郭良棟 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所