專利名稱：一株高效轉(zhuǎn)化黃姜中皂苷生產(chǎn)薯蕷皂苷元的菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株層出鐮孢proliferatum')WX12及利用該菌高效轉(zhuǎn)化黃姜中皂苷生產(chǎn)薯蕷皂苷元的方法。
背景技術(shù)：
薯蕷皂苷元是生產(chǎn)留體激素類藥物的重要基礎(chǔ)原料。留體激素具有很強(qiáng)的抗感染、抗過敏、抗病毒和抗休克的藥理作用，是治療風(fēng)濕、心血管、淋巴白血病、細(xì)胞性腦炎、皮膚病、抗腫瘤和搶救危重病人的重要用藥，是僅次于抗生素的第二大類藥物。目前大概有超過一千種留體激素類藥物是由薯蕷皂苷元合成或者半合成的，中國是薯蕷皂苷元最重要的生產(chǎn)國之一。薯蕷皂苷元通常是用酸解的方法從黃姜(盾葉薯蕷)中提取出來，但是這種方法帶來了非常嚴(yán)重的環(huán)境污染，用微生物轉(zhuǎn)化法結(jié)合酶解法生產(chǎn)薯蕷皂苷元被普遍認(rèn)為是未來薯蕷皂苷元生產(chǎn)的趨勢，成為當(dāng)前清潔生產(chǎn)領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一。很多研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)木霉屬和曲霉屬的一些微生物能將黃姜中的皂苷轉(zhuǎn)化為薯蕷皂苷元，雖然生物轉(zhuǎn)化法條件溫和，環(huán)境友好，但是這些微生物的轉(zhuǎn)化效率低，副產(chǎn)物多，并不能真正的進(jìn)入工業(yè)生產(chǎn)。由于黃姜中的皂苷成分復(fù)雜，而且多數(shù)是脂溶性化合物，水溶性很低，因此轉(zhuǎn)化過程中底物投料濃度和轉(zhuǎn)化效率都非常低，這些問題都是薯蕷皂苷元用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)中的難題。因此篩選一株高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)薯蕷皂苷元的微生物具有非常重要的意義，而目前關(guān)于層出鐮孢用于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)薯蕷皂苷元的研究未見報(bào)道，其生產(chǎn)薯蕷皂苷元的高收率更是工業(yè)生產(chǎn)的一大優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)薯菌阜苷元的層出鐮孢/7r0/i/ferateffi)WX12，以及利用該菌株轉(zhuǎn)化生產(chǎn)薯蕷皂苷元的方法，可達(dá)到高產(chǎn)物得率的要求。本發(fā)明的發(fā)明人從實(shí)驗(yàn)室保存的真菌中篩選到一株轉(zhuǎn)化生產(chǎn)薯蕷皂苷元的微生物，該菌于2012年3月13日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 5901。應(yīng)用上述微生物轉(zhuǎn)化黃姜中的皂苷生產(chǎn)薯蕷皂苷元的方法，其步驟如下
(I)采用保藏號(hào)為CGMCC No. 5901的層出鐮孢prol i feratum) W12為生產(chǎn)菌種，按照常規(guī)方法進(jìn)行活化培養(yǎng)得到種子液，將該種子液涂布到查氏培養(yǎng)基上。(2)制備層出鐮孢/Tro/i/eratefi ) WX12菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物挑取步驟(I)的查氏固體培養(yǎng)基上的層出鐮孢WX12菌株一環(huán)，接種于已滅菌的裝有20-60 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，培養(yǎng)溫度為25-40°C，置搖床上以120-220 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)22-26 h至對(duì)數(shù)生長中期，即得到層出鐮孢proliferatum) WX12菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。 (3)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(2)中制備好的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以4-8% (w/w)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為500 mL錐形瓶中裝50-100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25-40°C，在120-220 r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)20-24 h，得發(fā)酵液。(4)生物轉(zhuǎn)化精確稱取適量黃姜皂苷，投入步驟(3)中的菌體發(fā)酵液，使其終濃度為3-5 g/L，在轉(zhuǎn)化溫度30°C，200-220 r/min的轉(zhuǎn)速下轉(zhuǎn)化144-168 h，即得轉(zhuǎn)化液。(5)產(chǎn)物檢測將步驟(4)的轉(zhuǎn)化液在8000-12000 r/min下離心5-10 min，沉淀用與轉(zhuǎn)化液同體積的60 0C _90°C石油醚抽提2次，合并抽提液后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋至有晶體出現(xiàn)，乙腈復(fù)溶晶體并通過0. 22 um的有機(jī)膜過濾除雜，濾液利用高效液相色譜法分析薯蕷皂苷元的含量。其中步驟(I)中所述的PDA培養(yǎng)基的成分及配比為蔗糖30 g/L，硝酸鈉3 g/L,磷酸氫二鉀I g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，氯化鉀0. 5 g/L，七水硫酸鐵0.01 g/L，水1000 mL,自然pH。在121°C高壓蒸汽下滅菌20min ;步驟(2)所述種子培養(yǎng)基的成分及配比為蔗糖20 g/L，硫酸銨2 g/L，硝酸鈉2 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸氫二鉀I g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，氯化鉀0.5 g/L，七水硫酸鐵0.01 g/L，水1000 mL，自然pH，在121°C高壓蒸汽下滅菌20 min;步驟(3)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為蔗糖20 g/L，硫酸銨2 g/L，硝酸鈉2 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸氫二鉀I g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，氯化鉀0. 5 g/L，七水硫酸鐵0.01 g/L，黃姜皂苷3 g/L，，水1000 mL，自然pH，121°C高壓蒸汽下滅菌20 min。本發(fā)明所述的層出鐮孢/Tro7i/erate )WX12菌株首次發(fā)現(xiàn)可轉(zhuǎn)化生成薯蕷皂苷元，并且能達(dá)到高產(chǎn)物得率的要求，是一株極具開發(fā)研究價(jià)值的生產(chǎn)菌株。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I酶解法得到黃姜皂苷。稱取100 g干黃姜粉，加入2000 mL水中，煮沸I h，冷卻，調(diào)整pH為6. 5，加入中溫淀粉酶0. 4 mL, 65 °C溫育I h。冷卻后調(diào)整pH為6. 0，加入耐高溫淀粉酶0. 4 mL, 80 V溫育I h。冷卻，調(diào)整pH為5. 5，加入液體糖化酶I mL，60 °C溫育8 h。冷卻，4000 rpm離心20 min，取沉淀，60°C烘干至恒重，稱重。實(shí)施例2利用層出鐮孢(/7W1SariWffiWX12轉(zhuǎn)化產(chǎn)生薯菌阜苷元。(I)制備層出鐮孢(/7W1SariWffi proHferaturn) WX12菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。挑取固體查氏培養(yǎng)基上的層出鐮孢WX12菌株一環(huán),接種在裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30°C下，置于搖床上以200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)20-24 h至對(duì)數(shù)期，即制得層出鐮孢proliferatum) WX12菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為蔗糖20 g/L，硫酸銨2 g/L，硝酸鈉2 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸氫二鉀I g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，氯化鉀0. 5 g/L，七水硫酸鐵0. 01 g/L,水1000 mL ,pH自然，121°C高壓蒸汽下滅菌20 min。(3)搖瓶發(fā)酵將上述層出鐮孢(/7W1SariWffiWX12菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以4-8%(w/w)的接種量接種在裝有已滅菌的30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30-40°C條件下，置于搖床上以120-200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，發(fā)酵20-24 h，菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)中后期。(4)生物轉(zhuǎn)化精確稱取適量黃姜皂苷，投入步驟(3)中的菌體發(fā)酵液，使黃姜皂苷終濃度為5 g/L，在轉(zhuǎn)化溫度30°C，200-220 r/min的轉(zhuǎn)速下轉(zhuǎn)化144-168 h。實(shí)施例3石油醚提取轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的薯蕷皂苷元。
8000-12000 r/min離心轉(zhuǎn)化液10 min,取沉淀,加入石油醚(沸點(diǎn)60 °C 90 °C )20 mL超聲提取兩次，每次4 h，合并提取液，80 °C濃縮至15 mL左右。所得即是薯蕷皂苷元的石油醚溶液，其薯蕷皂苷元的濃度約為0. 25 mg/mL，純度>40%。
權(quán)利要求
1.一株高效轉(zhuǎn)化黃姜中阜苷生產(chǎn)薯菌阜苷元的菌株,該菌株為層出鐮孢proliferatum) WX12,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏號(hào)為CGMCC No. 5901，保藏日期為2012年3月13日。
2.利用層出鐮孢(/7W1Sariiffl /7ro7i/e_raiw )WX12轉(zhuǎn)化生產(chǎn)薯菌阜苷元的方法,其特征為500 mL三角瓶裝50-100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量按體積比為4-8%，培養(yǎng)溫度25-40°C，搖床轉(zhuǎn)速180-220 r/min，培養(yǎng)24 h后投入一定量的底物黃姜皂苷，繼續(xù)培養(yǎng)168 h ;所用發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下:葡萄糖 20-50 g/L, NaNo3 O. 1-2 g/L，(NH4)2SO4 O. 1-2 g/L，NaCl 1-5g/L, K2HPO4 0. 1-1. 0 g/L, MgSO4 0. 1-1 g/L, FeSO4*7 H2O 0. 01-0. 10 g/L, pH 6. 5-7. 5，121。。高壓蒸汽下滅菌20 mirio
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及高產(chǎn)薯蕷皂苷元菌株的篩選及其在黃姜皂苷轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。本發(fā)明篩選到了一株高產(chǎn)薯蕷皂苷元的層出鐮孢(FusariumProliferatum)WX12，該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCCNo.5901，具有生長快，轉(zhuǎn)化效率高的特點(diǎn)，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)薯蕷皂苷元，具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)率高，生產(chǎn)成本低，環(huán)境友好等特點(diǎn)，且產(chǎn)品后處理過程方便快捷，無需使用大量酸或堿。
文檔編號(hào)C12R1/77GK102703329SQ20121016713
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月28日
發(fā)明者史勁松, 張佳佳, 張旦旦, 李會(huì), 李恒, 許正宏 申請(qǐng)人:江南大學(xué)