專利名稱：一種β-葡萄糖苷酶活性快速測定試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種試劑盒及其檢測方法，尤其涉及一種β -葡萄糖苷酶活性快速測定試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase)是一類水解酶(EC 3. 2. 1.21),廣泛存在于各種生物體內，在生物體的生理、代謝過程中起著重要作用。近年來，人們對其催化機理、分子結構、基因序列等方面都進行了深入的研究。β -葡萄糖苷酶用途廣泛，已被應用于食品、化工、生物等諸多工業生產中，取得了巨大的經濟效益。目前，β -D-葡萄糖苷酶活性檢測方法有以下幾種一是Barush和Swiain法，以水楊苷為酶反應底物，酶解產物用4-氨基安替比林作顯色劑，使釋放出來的水楊醇顯色，再用分光光度計比色測定，或者用DNS試劑測定生成的還原糖量來計算酶的活力；二是熒光法，利用傘形酮(7-羥基香豆素)與4-甲基傘形酮具有強烈熒光的特點，可以計算酶活力；三是比色法，以對-硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)為底物進行酶解，底物水解后釋放出來的對-硝基苯酚可用分光光度計比色測定。目前，微生物和植物中糖苷酶活性分析檢測以對硝基苯酚-D-葡萄糖苷為酶底物的比色法應用最為廣泛和普遍，且該方法操作簡單，快速，靈敏度高，重現性好。如何將上述的測定原理通過對吸收波長，緩沖液類型、pH值，反應溫度和時間等進行優化，制造出一種機構簡單、使用方便的β_葡萄糖苷酶活力測定試劑盒是技術人員要解決的問題。

發明內容
本發明需要解決的技術問題是提供了一種β -葡萄糖苷酶活性快速測定試劑盒及其檢測方法，旨在解決上述問題。一種β -葡萄糖苷酶活性定量檢測試劑盒，包括Rl、R2、R3和R4試劑，其中Rl試劑100-300mmol/L醋酸鈉緩沖液pH5_6 ；R2試劑10-20mmol/L對硝基苯基-β -D-葡萄糖苷(pNPG)水溶液；R3試劑200-400mmol/L碳酸鈉溶液；R4試劑10-30mmol/L對硝基苯酚儲備液。其中所述的生色劑為對硝基苯酚；所述的緩沖液為醋酸緩沖液。所述的β -葡萄糖苷酶活性定量檢測試劑盒在檢測β -葡萄糖苷酶發酵液酶活性中的應用。其中，利用β -葡萄糖苷酶活性定量檢測試劑盒檢測β -葡萄糖苷酶的活性，包括的步驟如下I)樣品制備將發酵液通過3000 5000rpm離心10 20min，所獲得的上清液既是或將精制固體酶碾碎定容。2)標準曲線的繪制
依次移取一定量的對硝基苯酚標準貯備液，用碳酸鈉溶液定容至100_200mL，配成相應濃度的對硝基苯酚標準工作液；吸取l_3mL對對硝基酚標準溶液于試管中，加入l-3mL醋酸鈉緩沖液；對照的空白試管中加入l_3mL醋酸鈉緩沖液；在所有的試管中加入5-10mL碳酸鈉溶液，振蕩，在405nm處測定吸光度OD值；繪制標準曲線圖。3)樣品的檢測向制備好的發酵液或精制固體酶制劑樣品溶液加入20-40 μ L Rl緩沖液混勻并加20-30 μ L入蒸餾水，在40-60°C下孵育，隨即加入20-40 μ L R2試劑，在40-60C下進行酶促反應，最后加入預冷的試劑100-200 μ L R3終止反應，并將反應產物在酶標儀或分光光度計上進行檢測；酶活性單位U定義在上述反應條件下，每分鐘釋放出I μ mo I的對硝基酚所需的酶量定義為一個酶活性單位；樣品中β -葡萄糖苷酶活性(
權利要求
1.一種3 -葡萄糖苷酶活性快速定量檢測試劑盒，其特征在于，包括Rl、R2、R3、R4試齊U，其中Rl試劑為100-300mmol/L醋酸鈉緩沖液pH5_6 ；R2試劑為10-20mmol/L對硝基苯基-0 -D-葡萄糖苷(pNPG)水溶液；R3試劑為200-400mmol/L碳酸鈉溶液；R4試劑為10-30mmol/L對硝基苯酚儲備液。其中所述的生色劑為對硝基苯酚，所述的緩沖液為醋酸緩沖液。
2.權利要求I所述的3-葡萄糖苷酶活性定量檢測試劑盒在檢測3 -葡萄糖苷酶發酵液酶活性中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于包括如下步驟 1)樣品制備 將發酵液通過3000 5000rpm離心10 20min，所獲得的上清液既是或將精制固體酶碾碎定容。
2)標準曲線的繪制 依次移取一定量的對硝基苯酚標準貯備液，用碳酸鈉溶液定容至100-200mL，配成相應濃度的對硝基苯酚標準工作液；吸取l_3mL對對硝基酚標準溶液于試管中，加入l_3mL醋酸鈉緩沖液；對照的空白試管中加入l_3mL醋酸鈉緩沖液；在所有的試管中加入5-10mL碳酸鈉溶液，振蕩，在405nm處測定吸光度OD值；繪制標準曲線圖。
3)樣品的檢測 向制備好的發酵液或精制固體酶制劑樣品溶液加入20-40ii L Rl緩沖液混勻并加20-30 u L入蒸餾水，在40-60°C下孵育，隨即加入20-40 u L R2試劑，在40_60°C下進行酶促反應，最后加入預冷的試劑100-200 UL R3終止反應，并將反應產物在酶標儀或分光光度計上進行檢測； 酶活性單位U定義在上述反應條件下，每分鐘釋放出I U mol的對硝基酚所需的酶量定義為一個酶活性單位； 樣品中葡萄糖苷酶活性
全文摘要
本發明公開了一種β-葡萄糖苷酶活性快速定量檢測試劑盒及其檢測方法，β-葡萄糖苷酶活性定量檢測試劑盒包括R1試劑和R2試劑；R1試劑包括一下含量的組分90-110mmol/LpH6.8-7.0緩沖液、1.0-3.0U/L葡萄糖氧化酶、1.0-2.5U/L過氧化酶和0.01-0.1％防腐劑；R2試劑包括以下含量的組分90-11mmol/L pH6.8-7.0緩沖液、100-115mmol/L生色劑、70-100mmol/L麥芽糖、0.2-1.0mmol/L 4-氨基安替比林和0.01-0.1％防腐劑。本發明還公開了該β-葡萄糖苷酶活性定量檢測試劑盒在快速檢測β-葡萄糖苷酶活性中的應用。本發明僅采用兩種液體試劑，試劑種類和用量都減少了許多；才用分光光度法或酶標法，大大縮短了反應時間；簡化了反應步驟，節省了試劑，自動化，規模化檢測，在提高檢測結果準確性和可靠性的同時，大大提高了檢測效率。
文檔編號C12Q1/34GK102660633SQ201210177689
公開日2012年9月12日 申請日期2012年6月1日 優先權日2012年6月1日
發明者劉逸寒, 柏桐, 王盛楠 申請人:天津銘恒科技發展有限公司