專利名稱：醛化鵝新鮮紅細胞及其在無細胞百日咳ha試驗中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種無細胞百日咳檢測工藝方法，對無細胞百日咳血凝實驗HA (某此病毒或病毒的血凝素，能選擇性地使某種或某幾種動物的紅細胞發生凝集，這種凝集紅細胞的現象稱為血凝試驗HA)中所采用的鵝新鮮紅細胞進行戊二醛化，以改進鵝新鮮紅細胞質脆易碎、保質期短的問題，與鵝新鮮紅細胞相比，保質期從7天左右提高到90天，減少了采集鵝血的頻率，降低了工作強度。
背景技術：
百日咳(pertussis, whooping cough)是一種兒童急性呼吸道傳染病，典型癥狀為突然陣發性痙咳，并帶有吸氣性尾聲或伴有嘔吐，可持續幾個月，如無并發癥出現，一般無高熱或有輕度發熱。本病最重要的并發癥是繼發感染，癲癇發作，腦病和死亡。百日咳在發病初期傳染力極強，不易診斷，因此進行疫苗接種是預防和控制百日咳最經濟最有效的手段。目前市場上的百日咳疫苗主要有全菌體百日咳疫苗和無細胞百日咳疫苗兩種，后者免疫效果好且副作用低，因此被廣泛使用。在無細胞百日咳發酵培養中，常用的檢測方法是HA試驗(在微量凝集板上，每孔加人生理鹽水50 u L，然后第I孔加入百日咳菌液50 u L，混勻.依次倍比稀釋至第10孔，同時另作生理鹽水對照，之后每孔各加人50 UL 1%新鮮紅細胞懸液。同時振蕩Imin混勻，室溫下靜置15min后觀察結果)。在HA試驗中，需要使用的1%鵝新鮮紅細胞存在質脆易碎，保存期短的缺點。

發明內容
本發明的任務是提供一種醛化鵝新鮮紅細胞及其制備方法和醛化鵝新鮮紅細胞在無細胞百日咳HA試驗中的應用。實現本發明的技術方案是本發明提供的醛化鵝新鮮紅細胞是按以下方法制得的產物步驟一用注射器吸取鵝靜脈血約2 6mL，放入裝有IOmL生理鹽水的離心管中混勻，離心機1500 2000 r/min 4°C，離心8分鐘，棄上清液，得沉淀物；沉淀物加入生理鹽水10mL，混合均勻，再經1500 2000 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜，得沉淀物，沉淀物加入生理鹽水10mL，混合均勻，再經1500 2000r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜后得到的沉淀物即為鵝新鮮紅細胞，將所得鵝新鮮紅細胞于4°C保存備用；步驟二 取鵝新鮮紅細胞lmL，緩慢加入經4°C預冷的I. 25%戊二醛溶液40mL，迅速搖勻，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌，反應40min后取出，得到鵝新鮮紅細胞濃度為
2.5% (體積比mL / mL)的醛化鵝新鮮紅細胞懸液；步驟三將濃度為2. 5% (體積比mL / mL)的醛化鵝新鮮紅細胞懸液用0. 9%無菌氯化鈉溶液稀釋到濃度為0. 8%的醛化鵝新鮮紅細胞懸液。本發明提供的醛化鵝新鮮紅細胞的制備方法，包括以下步驟
步驟一用注射器吸取鵝靜脈血約2 6mL，放入裝有IOmL生理鹽水的離心管中混勻，離心機1500 2000 r/min 4°C，離心8分鐘，棄上清液，得沉淀物；沉淀物加入生理鹽水10mL，混合均勻，再經1500 2000 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜，得沉淀物，沉淀物加入生理鹽水10mL，混合均勻，再經1500 2000r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜后得到的沉淀物即為鵝新鮮紅細胞，將所得鵝新鮮紅細胞于4°C保存備用；步驟二 取鵝新鮮紅細胞lmL，緩慢加 入經4°C預冷的I. 25%戊二醛溶液40mL，迅速搖勻，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌，反應40min后取出，得到鵝新鮮紅細胞濃度為
2.5% (體積比mL / mL)的醛化鵝新鮮紅細胞懸液；步驟三將濃度為2. 5% (體積比mL / mL)的醛化鵝新鮮紅細胞懸液用0. 9%無菌氯化鈉溶液稀釋到濃度為0. 8%的醛化鵝新鮮紅細胞懸液，此醛化鵝新鮮紅細胞懸液置于4 °C冰箱中放置保存,有效期為90天；上述制備方法步驟二中所述的I. 25%戊二醛溶液是按以下方法配制成的溶液將25%戊二醛用0. 9%無菌氯化鈉溶液稀釋成I. 25%戊二醛溶液，置于4°C冰箱中備用。本發明提供的醛化鵝新鮮紅細胞可用于無細胞百日咳HA試驗。實驗資料I、采血用注射器吸取鵝靜脈血約2 6mL，放入裝IOmL生理鹽水的離心管中混勻。2、分離鵝紅細胞將離心管中的血液經離心機4°C，1500 2000 r/min離心8分鐘，棄上清液，沉淀物加入生理鹽水10mL，混合均勻，再經1500 2000 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜。從沉淀物加入生理鹽水至離心移去上清液，此過程重復2次。最后得到的沉淀物即為鵝新鮮紅細胞，將所得鵝新鮮紅細胞于4°C保存備用。3、制備醛化鵝新鮮紅細胞本實驗采用兩種方法進行醛化。第一種方法取沉淀鵝新鮮紅細胞lmL，緩慢加入4°C預冷的I. 25_5%戊二醛溶液40ml,迅速搖勻，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌4(T60min,反應結束后，離心洗漆三次，沉淀加生理鹽水得到醛化鵝新鮮紅細胞懸液。第二種方法用生理鹽水配成5%鵝新鮮紅細胞懸液15mL，緩慢加入I. 25_5%戊二醛生理鹽水溶液15mL，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌4-6h，反應結束后離心洗滌三次，沉淀加生理鹽水得到醛化鵝新鮮紅細胞懸液。通過實驗選擇一種醛化鵝紅細胞的方法，為無細胞百日咳的HA試驗提供有效的試驗試劑,使試驗效果更加準確。本發明實驗從醛化鵝新鮮紅細胞制備方法、工作濃度、保存時間三個方面進行了研究，最終確定上述第一種醛化方法優于第二種醛化方法，第一種醛化方法的具體條件為
I.25%戊二醛醛化40min，醛化鵝新鮮紅細胞工作濃度為0. 8%，用于無細胞百日咳的HA試驗，取得與用0. 8%新鮮鵝紅細胞一致的試驗結果，但本發明以醛化鵝新鮮紅細胞取代新鮮鵝紅細胞后，使鵝紅細胞保存期變長，實驗結果更穩定，克服了現有技術中存在的鵝新鮮紅細胞質脆易碎，保存期短，實驗結果不穩定的缺點。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發明進行進一步的說明，但不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員可以根據上述本發明的內容作出一些非本質的改進和調整。實施例I用前述的第一種醛化鵝新鮮紅細胞方法制備醛化鵝新鮮紅細胞醛化鵝新鮮紅細胞的制備方法，包括以下步驟步驟一用注射器吸取鵝靜脈血約2 6mL，放入裝有IOmL生理鹽水的離心管中混勻，離心機1500 2000 r/min 4°C，離心8分鐘，棄上清液，得沉淀物；沉淀物加入生 理鹽水10mL，混合均勻，再經1500 2000 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜，得沉淀物，沉淀物加入生理鹽水10mL，混合均勻，再經1500 2000r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜后得到的沉淀物即為鵝新鮮紅細胞，將所得鵝新鮮紅細胞于4°C保存備用；步驟二 取沉淀鵝紅細胞lmL，緩慢加入4°C預冷的I. 25-5%戊二醛溶液40mL，迅速搖勻，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌，反應40min后取出20mL混合液，得到醛化40min的醛化鵝紅細胞懸液。反應60min后取出20mL混合液，得到醛化60min的醛化鵝紅細胞懸液。步驟三將濃度為2. 5%的醛化鵝新鮮紅細胞懸液用0. 9%無菌氯化鈉溶液稀釋到濃度為0. 8%的醛化鵝新鮮紅細胞懸液，此醛化鵝新鮮紅細胞懸液置于4°C冰箱中放置保存，有效期為90天；步驟二中所述的I. 25%戊二醛溶液是按以下方法配制成的溶液將25%戊二醛用0. 9%無菌氯化鈉溶液稀釋成I. 25%戊二醛溶液，置于4°C冰箱中備用。實施例2用前述的第二種醛化鵝新鮮紅細胞方法制備醛化鵝新鮮紅細胞步驟一同實施例I步驟二 5%鵝紅細胞懸液15mL緩慢加入2. 5%戊二醛生理鹽水溶液15mL，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌lh，取4mL，用生理鹽水洗滌5次，每次2000 r / min,離心10min，棄去上清液，配成5%的懸液.4°C保存備用，得到醛化Ih的醛化鵝紅細胞。剩余溶液繼續分別攪拌2 h、5h和6h，按照上述方法，取出部分洗滌，配成0.8%的懸液，4°C保存備用。分別得到醛化2h、5h、6h的醛化鵝紅細胞。實施例3無細胞百日咳的HA試驗用實施例I制備的醛化鵝新鮮紅細胞、用實施例2制備的醛化鵝新鮮紅細胞以及用屬于現有技術的0. 8%新鮮鵝紅細胞懸液分別進行無細胞百日咳的HA試驗主要物料和設備百日咳球桿菌(本科室大罐培養)，健康鵝血，25%戊二醛，高速冷凍離心機(Eppendorf),電子天平(梅特勒),96孔板。具體過程
醛化鵝新鮮紅細胞的制備及最佳醛化時間確定第一種醛化方法取沉淀鵝新鮮紅細胞lmL，緩慢加入4°C預冷的I. 25_5%戊二醛溶液40mL,迅速搖勻，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌,反應40min后取出20mL混合液，得到醒化40min的醒化鵝新鮮紅細胞懸液。反應60min后取出20mL混合液,得到醒化60min的醛化鵝紅細胞懸液。兩種2. 5%鵝紅細胞濃度的醛化紅細胞懸液分別稀釋得到0. 8%鵝紅細胞濃度的醛化鵝細胞懸液。第二種醛化方法5%鵝紅細胞懸液15mL緩慢加入2. 5 %戊二醛生理鹽水溶液15mL，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌lh，取4mL，用生理鹽水洗滌5次，每次2000 r / min，離心10 min，棄去上清液，配成5%的懸液.4°C保存備用，得到醛化Ih的醛化鵝紅細胞。剩余溶液繼續分別攪拌2 h、5h和6h，按照上述方法，取出部分洗滌，配成0. 8%的懸液，4°C保存備用。分別得到醛化2h、5h、6h的醛化鵝紅細胞。兩種方法同時用0. 8%鵝新鮮紅細胞懸液做對照，用三批大罐培養百日咳桿菌菌液(批號分別為:201111Z088-YD2; 201111Z090-YD2; 201111Z092-YD2)重復做血凝試驗，評價出最優的醛化鵝新鮮紅細胞時間。醛化鵝紅細胞的優化試驗溶血性觀察將新鮮鵝紅細胞懸液與醛化后的鵝紅細胞懸液分別放置4°C保存，每日觀察并記錄鵝紅細胞保存期內的溶血現象。 不同戊二醛濃度醛化鵝紅細胞及不同醛化鵝細胞濃度的血凝試驗對比將25%的戊二醛溶液分別1:4 ;1:9 ;1:19稀釋成5%、2. 5%、1. 25%濃度戊二醛生理鹽水溶液三份。第一種醛化方法分別取ImL沉淀鵝紅細胞3份，分別加入到40mL5%、2. 5%、I. 25%濃度戊二醛溶液中反應，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌，醛化反應時間按最佳醛化時間進行，反應結束后，離心洗滌三次，沉淀加生理鹽水分別配制成2%，I. 67%，1%，0. 8%鵝紅細胞濃度的醛化鵝細胞懸液。第二種醛化方法5%、2. 5%、I. 25%濃度戊二醛生理鹽水溶液各40mL分別緩慢加入到40mL5%細胞濃度的紅細胞中反應，醛化反應時間按最佳醛化時間進行，反應結束后，離心洗滌三次，沉淀醛化紅細胞分別配制成2%，I. 67%，1%，0. 8%鵝紅細胞濃度的懸液，兩種方法同時用0.8%新鮮鵝紅細胞懸液做對照，用三批大罐培養百日咳桿菌菌液(批號分別為201111Z088-YD2; 201111Z090_YD2; 201111Z092_YD2)重復做血凝試驗.評價出最優的戊二醛反應濃度及醛化細胞工作濃度。實驗結果I、溶血性觀察結果將新鮮鵝紅細胞于4°C條件下放置保存，7d出現部分溶血.第IOd已經全部溶血，而醛化鵝紅細胞不出現溶血，性質不變。在醛化紅細胞保存的90天中，戊二醛醛化的鵝紅細胞均不出現溶血現象。2、最佳醒化時間確定表I第一種醛化方法醛化鵝紅細胞實驗結果(操作完成后20min后觀察)
權利要求
1.醛化鵝新鮮紅細胞的制備方法，包括以下步驟 步驟一用注射器吸取鵝靜脈血約2 6mL，放入裝有IOmL生理鹽水的離心管中混勻，離心機1500 2000 r/min 4°C，離心8分鐘，棄上清液，得沉淀物；沉淀物加入生理鹽水IOmL,混合均勻，再經1500 2000 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜，得沉淀物，沉淀物加入生理鹽水IOmL,混合均勻，再經1500 2000 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜后得到的沉淀物即為鵝新鮮紅細胞，將所得鵝新鮮紅細胞于4°C保存備用； 步驟二 取鵝新鮮紅細胞lmL，緩慢加入經4°C預冷的I. 25%戊二醛溶液40mL，迅速搖勻，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌，反應40min后取出，得到鵝新鮮紅細胞濃度為2. 5%(體積比mL / mL)的醛化鵝新鮮紅細胞懸液； 步驟三將濃度為2. 5%的醛化鵝新鮮紅細胞懸液用0. 9%無菌氯化鈉溶液稀釋到濃度為0. 8%的醛化鵝新鮮紅細胞懸液。
2.根據權利要求I所述的醛化鵝新鮮紅細胞的制備方法，其特征在于，步驟二中所述的I. 25%戊二醛溶液是按以下方法配制成的溶液將25%戊二醛用0. 9%無菌氯化鈉溶液稀釋成I. 25%戊二醛溶液，置于4°C冰箱中備用。
3.—種醛化鵝新鮮紅細胞，其特征在于按以下方法制得的產物 步驟一用注射器吸取鵝靜脈血約2 6mL，放入裝有IOmL生理鹽水的離心管中混勻，離心機1500 2000 r/min 4°C，離心8分鐘，棄上清液，得沉淀物；沉淀物加入生理鹽水IOmL,混合均勻，再經1500 2000 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜，得沉淀物，沉淀物加入生理鹽水IOmL,混合均勻，再經1500 2000 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜后得到的沉淀物即為鵝新鮮紅細胞，將所得鵝新鮮紅細胞于4°C保存備用； 步驟二 取鵝新鮮紅細胞lmL，緩慢加入經4°C預冷的I. 25%戊二醛溶液40mL，迅速搖勻，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌，反應40min后取出，得到鵝新鮮紅細胞濃度為2. 5%(體積比mL / mL)的醛化鵝新鮮紅細胞懸液； 步驟三將濃度為2. 5%的醛化鵝新鮮紅細胞懸液用0. 9%無菌氯化鈉溶液稀釋到濃度為0. 8%的醛化鵝新鮮紅細胞懸液。
4.根據權利要3所述的醛化鵝新鮮紅細胞，其特征在于，步驟二中所述的I.25%戊二醛溶液是按以下方法配制成的溶液將25%戊二醛用0. 9%無菌氯化鈉溶液稀釋成I. 25%戊二醛溶液，置于4°C冰箱中備用。
5.權利要求I或2所述的方法制備的醛化鵝新鮮紅細胞在無細胞百日咳HA試驗中的應用。
6.權利要求3或4所述的醛化鵝新鮮紅細胞在無細胞百日咳HA試驗中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種醛化鵝新鮮紅細胞及其制備方法和醛化鵝新鮮紅細胞在無細胞百日咳HA試驗中的應用。本發明醛化鵝紅細胞方法的具體條件為1.25%戊二醛醛化40min，醛化鵝紅細胞工作濃度為0.8%，用于無細胞百日咳的HA試驗，取得與0.8%新鮮鵝紅細胞一致的試驗結果，但以醛化鵝紅細胞取代新鮮鵝紅細胞后，鵝紅細胞保存期變長，實驗結果更穩定，克服了現有技術需要使用的1%鵝新鮮紅細胞存在的質脆易碎，保存期短的缺點。
文檔編號C12N5/078GK102703386SQ20121017780
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月1日 優先權日2012年6月1日
發明者朱紅偉, 李新國, 胡業勤, 薛紅剛, 趙偉, 項美娟 申請人:武漢生物制品研究所有限責任公司