專利名稱：長穗偃麥草基因組特異分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于作物遺傳育種領域，具體涉及長穗偃麥草基因組特異分子標記及其應用。
背景技術：
I、小麥育種目標和其野生近緣種小麥是世界上種植面積最大、總產量僅次于玉米的糧食作物。近半個世紀來，世界小麥的總產量已經增加了兩倍多，其中，優良的小麥品種對提高小麥產量發揮了決定性的 作用。目前小麥育種研究主要集中在四個方面提高小麥產量，降低生產成本；分子標記輔助育種；小麥抗逆性育種；小麥營養品質(何中虎等，2006)。為完成以上育種目標，小麥本身的遺傳資源已經明顯不夠，而與小麥具有近緣關系的許多野生物種中卻存在著大量小麥中所沒有的有利遺傳資源。因此，利用小麥近緣野生種中的優良基因資源培育小麥新品種已經成為小麥育種的目標之一。普通小麥(AABBDD，2n=42)是異源六倍體植物，屬于禾本科小麥屬普通小麥種(Triticum aestivum L.),與小麥屬關系比較近的屬有大麥屬(Hordeum)、披堿草屬(Elymus)、帽草屬(Asperella)、細坦麥屬(Sitanion)、新麥草屬(Psathyrostachys)、棱軸草屬(Crithopsis)、帶芒草屬(Taeniatherum)、冰草屬(Agropyron)、簇毛麥屬(Haynaldia)、黑麥屬(Secale)、異形花屬(Heteranthelium)、無芒草屬(Henrardia)、旱麥草屬(Eremopyrum)、山羊草屬(Aegilops)。這些野生近緣種植物中蘊含著大量優良基因，是一個巨大的具有潛在利用價值的遺傳基因庫。該基因庫的優良基因如得到利用，對小麥遺傳改良將具有重要的價值，不僅能提高其產量、改良品質，更能將豐富的抗病、抗逆基因轉入小麥中，改良小麥的抗病性和抗逆性。目前已經與小麥進行雜交的種屬有黑麥屬(Sando et al, 1953)、族毛麥屬(Sears et al, 1953; Hyde et al, 1953)、偃麥草屬(Dvordket al, 1974)、山羊草屬(Sears et al, 1956; Chapmna et al, 1970)、大麥屬(Kruse etal, 1973; Islam et al, 1975)等。這些遠緣雜交的成功為近緣野生種的抗旱、耐鹽堿以及抗病蟲害的優良基因向小麥基因組進行轉移奠定了堅實的基礎，使得從小麥近緣種屬中尋找或開拓新的重要基因資源成為可能。隨著現代分子生物學的發展，分子標記與作物育種相結合，它不僅彌補了作物育種中傳統的選擇準確率低的缺點，而且加快了育種進程。2、小麥的赤霉病抗性小麥生產中倍受關注的病害為小麥赤霉病(Fusarium head blight, FHB),它是全球性致使小麥產量降低和品質下降的主要病害之一，也是影響中國小麥生產的主要病害(陸維忠等，2001)。赤霉病大流行年份病穗率達50% 100%，減產高達10% 40% (姚金保等，2000)。該病由多種鐮刀菌引起，病原菌侵染小麥籽粒后產生多種真菌毒素，這些毒素對人畜有害(Bottalico et al, 1998),特別是其中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)毒素，在50mg/kg的濃度下，就可以抑制人類T細胞80%的活性，嚴重威脅著人類和家畜的健康(宋鳳英等，2005)。我國長江中下游冬麥區是小麥赤霉病的多發區和重災區，近年來黃淮麥區和關中麥區小麥赤霉病發生也日趨嚴重，影響著國內小麥主產區的糧食安全。隨著全球性氣候變暖和玉米-小麥輪作制度的增加，近10多年來小麥赤霉病在北美和歐洲也大面積發生，造成嚴重的產量和經濟損失(Bai et al，2004)。因此，國內外很多學者都圍繞小麥赤霉病開展了廣泛的研究工作。我國從上世紀70年代中期開始對小麥赤霉病進行研究，研究結果認為小麥赤霉病抗性具有遺傳基礎，并且培育出一批抗性較強的優質高產小麥新品種，其中蘇麥3號目前已成為全世界公認的赤霉病高抗品種(姚金寶等，2000)。多年的小麥抗赤霉病育種研究表明，小麥種內抗赤霉病的資源很少，而且已經發現的抗性資源在小麥育種實際中也難以有效利用。從小麥近緣物種中開拓新的赤霉病抗源是小麥抗赤霉病育種中的重要策略，并且進行了大量的相關研究。如小麥赤霉病抗源，現已成功地進行了小麥與大賴草(Leymus racemosus)、長穗偃麥草(Lophopyrum eIongatum) >中間偃麥草(L. intermedium)、黑麥(Secale cereale)、族毛麥(Haynaldia villosa)等多種近緣物種的雜交，并獲得了一些具有赤霉病抗性的材料(Oliver R. E, et al.，2005)。3、長穗偃麥草赤霉病抗性及特異分子標記發展 偃麥草屬(Thinopyrum)是禾本科大麥族(Horseae),小麥亞族(Triticeae)中的多年生草本植物，與普通小麥的親緣關系較近，世界范圍內約有50種，主要分布在溫帶和寒帶地區。該屬適應性和繁殖能力較強，并且具有許多優良基因和性狀，如抗病、抗寒、抗旱、耐鹽堿和穗大多花等，是小麥遺傳改良中極具應用價值的小麥近緣物種之一。自然界中存在3種類型的長穗偃麥草，即二倍體長穗偃麥草(Th. elongatum, 2n=14)、四倍體長穗偃麥草(Th. elongatum, 2n=28)和十倍體長穗偃麥草(Th. ponticum, 2n=70)。二倍體長穗偃麥草具有E染色體組，E染色體組是偃麥草屬多倍體物種的基本染色體組(Dewey etal, 1984)。一整套中國春-長穗偃麥草二體異附加系、代換系的獲得為深入研究長穗偃麥草奠定了很好的基礎(Dvordk J, et al.，1974)。有研究表明在長穗偃麥草的IE (劉登才等，2001 ；Jauhar PP, et al. , 2009)、7E(Somers DJ, et al. , 2003 ；Shen X R, et al. , 2004 ；徐國輝等，2009 ；Zhang X L, et al. ,2011)染色體可能具有良好的赤霉病抗性基因，因此，長穗偃麥草已成為改良普通小麥遺傳基礎、提高赤霉病抗性的重要野生近緣物種之一(王黎明等，2005)。目前小麥赤霉病的鑒定方法主要有自然誘發感病、室內人工離體接種鑒定、田間人工接種鑒定等，但對于赤霉病抗性的鑒定，研究者使用的方法和表示參數各不相同，而且抗性鑒定結果受環境條件的影響比較大，建立穩定可靠的赤霉病接種方法和鑒定標準是評價品種抗病性最關鍵的問題。為了使抗性鑒定更加準確，研究者將目標轉移到分子標記。分子標記輔助選擇(Marker Assisted Selection, MAS)是將分子標記應用于作物品種改良過程中進行選擇的一種輔助手段(Ribaut et al, 1998) 0其基本原理是利用與目標基因緊密連鎖或表現共分離的分子標記對選擇個體進行目標以及全基因組篩選，從而減少連鎖累贅，獲得期望的個體，達到提高育種效率的目的。分子標記輔助選擇是分子標記技術用于作物改良的重要領域，是傳統育種技術和現代生物技術相結合的產物。隨著20世紀80年代中后期PCR技術的誕生和人類基因組計劃及之后的水稻等多種作物基因組計劃的相繼推動下，分子標記輔助選擇技術的研究和應用得到迅速發展。通常，目前所指的分子標記就是DNA標記，在不同植物中利用不同的方法發展分子標記用于研究已經成為重要的遺傳研究內容。
赤霉病抗性比較復雜，人工鑒定結果受環境的影響較大，因此利用分子標記進行輔助選擇將是有效途徑。在長穗偃麥草向小麥轉移優良的抗赤霉病基因的研究中，已有部分研究進行了長穗偃麥草染色體特異分子標記研究.長穗偃麥草IE和3E染色體的3個特異的RAPD標記0PE-0513(i(i、0PF-037(i(i和0PF-154(|(|，可以用來快速鑒定IE和3E染色體(劉樹兵等，1998)。利用SSR分子標記技術，建立了一個偃麥草E染色體組特異的微衛星分子標記，該標記也可以作為E染色體的特異SSR標記(尤明山等，2003)。Shen等(2004)通過分布在第7連鎖群的52對SSR引物進行特異擴增，發現5對引物在7E上表現出特異性。陳國躍等(2007)利用已知植物抗病基因編碼氨基酸保守區域設計了簡并引物，應用RGAP分子標記技術構建了一套完整的長穗偃麥草IE 7E染色體的特異RGAP標記。張麗等(2008)利用AFLP引物篩選出28個長穗偃麥草E組染色體特異分子標記，并將其中5個轉化為STS標記，可用于小麥背景中長穗偃麥草遺傳物質的檢測。然而，以上發展的長穗偃麥草染色體特異分子標記不但數量少，遠遠滿足不了小麥抗性育種實際的需要，而且染色體特異性 及穩定性還不理想，發展更多的覆蓋相關染色體的分子標記，進一步研究這些分子標記與抗病，抗逆基因的連鎖關系，在小麥抗逆，抗病育種實際中利用這些標記進行輔助選擇是非常重要和迫切需要的。4、分子標記技術的發展4. I基于分子雜交技術的分子標記限制性片段長度多態性(RestrictionFragment LengthPolymorphism, RFLP) 1974年Grodzicker等創立了限制性片段長度多態性(RFLP)技術,用作腺病毒溫度敏感突變的遺傳標記(Grodzicker et al，1974)，它是一種以DNA-DNA雜交為基礎的第一代遺傳標記。利用特定的限制性內切酶切割不同的基因組DNA，得到大小不等的DNA片段，通過凝膠電泳分離出不同帶，然后與克隆DNA探針進行Southern雜交和放射顯影，即獲得反映個體特異性的RFLP圖譜。4. 2基于PCR技術的分子標記4. 2. I 隨機擴增多態性 DNA(Random Amplified Polymorphism DNA, RAPD) 1990 年由Williams等人利用PCR技術發展的檢測DNA多態性的方法(Williams et al, 1990)。它利用隨機引物(一般為flObp)通過PCR反應非定點擴增DNA片段，然后用凝膠電泳分析擴增產物DNA片段的多態性。擴增片段多態性便反映了基因組相應區域的DNA多態性。但是RAPD受反應條件影響較大，因而其檢測的重復性較差。4. 2. 2 序列標簽位點(Sequence Tagged Sites, STS) 1989 年 Olson 等提出，是對以特定對引物序進行PCR特異擴增的一類分子標記的統稱。通過設計特定的引物，使其與基因組DNA序列中特定結合位點結合，從而可用來擴增基因組中特定區域，分析其多態性。4. 2. 3 簡單重復序列(Simple Sequence Repeat, SSR)也稱微衛星 DNA (Tautz etal, 1989; Love et al, 1990),是一類由I 6個堿基組成的基序(motif)串聯重復序列,其中最常見是雙核苷酸重復和三核苷酸重復，如(CA)n、(AT)n, (TG)n, (GGC)n, (GAT)n等。每個微衛星DNA的核心序列結構相同，重復單位數目一般為10飛0，它們廣泛分布于絕大多數真核生物基因組中，其高度多態性主要來源于串聯重復數目的不同。微衛星序列兩側一般是相對保守的單拷貝序列，根據保守序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛星片段，由于核心序列串聯重復數目不同，因而能夠擴增出不同長度的PCR產物，將擴增產物進行凝膠電泳，根據分離片段的大小決定多態性。SSR標記一般檢測到的是單一的多等位基因位點，而且呈共顯性遺傳，故可鑒別雜合子和純合子。但是，傳統的SSR分子標記開發方法工作量大，需花費大量人力、物力，而且效率較低。4. 2. 4 簡單重復序列間區(inter-simple sequence repeat, ISSR)Zietkeiwitcz等于1994年提出的一種以微衛星為基礎的分子標記，它檢測的是兩個SSR之間的一段短DNA序列上的多態性。由于SSR序列廣泛分布于高等生物的基因組中，所以ISSR具有很強的多態性。目前，ISSR標記已廣泛應用于多種植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性等研究中，但在長穗偃麥草中沒有進行研究.4. 2. 5 反轉座子位點間擴增多態性(inter-retrotransposon amplifiedpolymorphism, I RAP)其原理是根據反轉錄轉座子中LTR的保守序列設計引物，這些引物在PCR過程中可以與LTR序列退火，從而擴增出相鄰的同一家族的反轉錄轉座子成員間的片段。也可以根據反轉錄酶基因的相對保守序列設計引物進行擴增(Kalendar et al. 1999)。目前，IRAP 分子標記技術已應用于大麥(Kalendar et al, 1999;Kalendar etal, 2000; Leigh et al, 2003)、柑橘(Bretoet al, 2001)、網茅(Yannic et al, 2004)、馬鈴薯等植物的遺傳研究中。4. 2. 7 反轉座子微衛星擴增多態性(retrotransposon microsatelliteamplified polymorphism, REMAP) 一種基于反轉錄轉座子的標記技術(Kalendar etal, 1999)。REMAP技術原理是根據反轉錄轉座子的LTR保守序列和微衛星序列設計引物，然后進行PCR，擴增出反轉錄轉座子與鄰近的微衛星間的片段，從而檢測出反轉錄轉座子與鄰近簡單重復序列之間的多態性。4. 3基于限制性酶切和PCR技術的DNA標記擴增片段長度多態性(AmplifiedFragment Length Polymorphism, AFLP)AFLP是1993年荷蘭科學家Zbaeau和Vos發展起來的一種檢測DN A多態性的新方法(Zbaeauet al, 1993)。AFLP是RFLP與PCR相結合的產物，先利用限制性內切酶將基因組DNA切割成不同大小的DNA片段，再使雙鏈人工接頭與酶切片段相邊接，作為擴增反應的模板DNA，然后以人工接頭的互補鏈為引物進行預擴增，最后在接頭互補鏈的基礎上添加f 3個選擇性核苷酸作引物對模板DNA基因再進行選擇性擴增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測獲得的DNA擴增片段，根據擴增片段長度的不同檢測出多態性。隨著技術的不斷完善和發展，AFLP技術已廣泛應用于植物種質鑒定(Thomas et al, 1995)、遺傳圖譜構建(Margueset al, 1998)、目的基因定位及遺傳多態性檢測(Pakniyat et al, 1997)等方面。4. 4基于DNA芯片技術的分子標記4. 4. I 單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) Lander 于 1996年提出的第三代DNA遺傳標記，是指在基因組水平上由于單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態性，其多態性頻率大于1%。從分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測。4. 4. 2 多樣性微陣列技術(Diversity arrays technology, DArT) Jaccoud等(2001)開發了一種新的分子標記技術多樣性微陣列技術(Diversity arraystechnology, DArT),并成功應用于水稻研究中。DArT技術是依賴芯片雜交的方法來區分基因組中座位多態性的差異。將待檢測的不同樣本的基因組DNA等量混合后經相關限制性內切酶處理，根據電泳結果選擇回收不同大小DNA片段及一系列DNA操作而達到基因組復雜性減少，該部分DNA即為基因組代表(Genomic representation),并通過相關過程將該部分DNA固定到玻片上形成點陣列的芯片。以不同樣本單獨經同樣內切酶處理所獲的基因組代表為探針，并組成相應的探針組合對芯片進行雜交，由于不同樣本的基因組DNA序列有差異，因而與芯片上同一點序列雜交的效率不一致，芯片上只有與探針DNA互補的點才具有雜交信號，通過掃描儀可識辨不同顏色雜交信號的強弱或有無來確定待檢測樣本的遺傳差別。DArT技術已在大麥、擬南芥、小麥和高梁等植物中得到應用。

發明內容
本發明利用運用抑制消減雜交(Suppressionsubtractive hybridization, SSH)技術(Diachenko L, et al. , 1996)去除實驗組(二倍體長穗偃麥草)及對照組(普通小麥中國春)兩個基因組DNA之間的同源序列，富集差異序列，獲得長穗偃麥草特異的DNA片段，并根據特異片段發展長穗偃麥草基因組特異分子標記，這些特異標記可跟蹤長穗偃麥草的
染色體或染色質，可用于抗赤霉病基因的連鎖分析，可用于分子標記輔助選擇，從而提高小麥抗赤霉病和抗逆性育種的效率。本發明利用SSH技術，獲得長穗偃麥草基因組特異的分子標記36個；所述的長穗偃麥草基因組特異分子標記，它是下列36對引物之一第I 對MEG-1303L: 5，-TGGATGGTGGCTGCTGAT-3， R: 5 ’ -CCGTTATGCTGCCCGATT-3，第2 對MEG-1258L: 5，-ACCAGCGGTAGCCCAGTCT-3’R: 5 ’ -ATCTGTGCGATTTCCCTA-3’第3 對=MEG-I253L: 5，-CCAGCGGTAACCCAGTCT-3 ’R: 5，-AGTGCGATTTCCCTGACG-3，第4 對=MEG-I211L: 5，-GCTCATCAACAGCCTACC-3，R: 5，-TGTGACTTTCCCACCATT-3，第5 對MEG-I242L: 5，-GAAAGGCTCCGAGAACAC-3 ’R: 5，-GTCAAAGGCTTAGCAATC-3 ’第6 對=MEG-I177L: 5，-TTGGGCTCAAGAACATTA-3’R: 5，-GGCAGGTACGACACCTAT-3，第7 對MEG-2301L: 5，-TTGGGCTCAAGAACATTA-3’R: 5，-TGGAACGGATGAAGACCC-3 ’第8 對MEG-2249 L: 5，-GCCGACTCAGGAGGTGTT-3’
R: 5 ’ -TTGCATCCGTTGGTATTG-3 ’第9 對MEG-2304L: 5，-TGTCCCACCATTGAGCAG-3，R: 5 ’ -CCGGGCAGGTTAGACTATA-3’第10 對MEG-2237L: 5，-CAGTGGCTTGTCAGAGTT-3， R: 5，-CGTAGCAGGATGGTTAGA-3 ’第11 對MEG_2422L: 5，-GCTTGCGTCATCTCCTTC-3，R: 5 ’ -TGATATGCCACTTCTCCTC-3，第12 對MEG-2407L: 5 ’ -TTAGTTAGGCAGTAGAGCA-3’R: 5，-CGACAAAGTAAGGTGGTG-3 ’第13 對MEG-2371L: 5，-TGGGTAATGCCCGTCCTC-3，R:5’ -TCTGAATGTTTCCGCTTGT-3’第14 對MEG-3258L: 5，-ATAGGGTTGCCAGTGAGGAG-3’R: 5，-GATTCATCATTTCCCATAGAG-3，第15 對MEG_3273L: 5 ’ -TTTACAAGGTGAAGGTCT-3 ’R: 5 ’ -CATTGCGGACTATGATTT-3 ’第16 對MEG-3236L: 5，-AGTGGCTTGTCAGAGTTG-3 ’R: 5，-CGTAGCAGGATGGTTAGA-3 ’第17 對MEG-3239L: 5，-TGCGATTTCCCTGTCATT-3 ’R: 5，-TCCCAGCCAGATCAAGAG-3’第I8 對MEG_3254 L: 5，-ATCTGTGCGATTTCCCTG-3，R: 5，-GCGGTAGCCAAGTCTGGT-3 ’第19 對MEG-3253L: 5，-CCAGCGGTAACCCAGTCT-3 ’R: 5 ’ -AGTGCGATTTCCCTGACG-3，第20 對MEG-3293L: 5 ’ -TGTTCACTCAGCCATCTC-3’R: 5，-ATCAACTTCAGCATCTTTA-3，第21 對MEG-3267L: 5，-AGGGGCAACAAGGATAAG-3，〔0103Ur °3-GCAGGTTCTTCCACCATTAI3.〔0104〕 llsx4:MEG-4i
〔0105Ur°3iqottgcgtcatctccttc-3 .
〔0106Ur °3-TTCGGTCATAGTTGCTCTTCI3.〔0107〕 H 27 迓sEG-r。
〔0108Ur°3-CCGTCTGTTACTCCATCGI3.
〔01 Osr °3-CTCTGAAGCGGCGTCTGC-3.
〔oils H 28 X4 :MEG-r3
〔0111ur°3-CCTTGTGAGCCCAGTTATI3.
I--iO112U R :°3-GCAGGTTCTTCCACCATTAI3.
〔0113〕 H 29 X4seg-4483
I--iO114I——IL :°3-ATCCCAATCTCAAATCAAG-3.
I--iO115I——IR :°3-TCAAATACTCAGCACGAAT-3.
〔0116〕 n30x4:MEG-53g
I--iO117I——IL :°3-CCCCAGGCAGAGGAACTA-3.
I--iO118U R :°3-CCCGGGCAGGTACATCTCI3.
〔0119〕鋮 31X4SEG-5I
〔012Sr°3_o>>tctcggagccatcat-3 .
I--iOI 21I——IR :°3-GGCCAGGTTCACATAAGG-3.
〔0122〕 H 32x4:MEG-5i
〔0123Ur°3-CATCTTCAGCGGTCTTGCI3.
〔0124I——Ir °3-CGAGCGTGTTGGGTAAGT-3.
〔0125〕鋮 33x4:meg-53
〔0122r°3-AAGTCAAGGCTGTCCCATA-3.
〔0127Ur °3-acttttcccatgctcaca—3 .
〔0128〕 H 34X4SEG-5I
〔0129Ur°3-ATTGAGCCTGCCGTAGAGI3.
11
R: 5，-GTCATTGAGCGTATCCTGTT-3’第35 對MEG_5456L: 5，-TCGCTGTCGTGCTTATCT-3，R: 5 ’ -TGTATTTGGTGTTCCCTCC-3，第36 對MEG_5333L: 5 ’ -TTTGTGACGAAGAGGAGCAT-3，R: 5，-GCCCGTAGACAGGAGAAGT-3，。本發明還公開了上述長穗偃麥草基因組特異分子標記在小麥抗赤霉病基因的連 鎖分析中的應用。本發明所獲長穗偃麥草染色體特異標記在不同材料和不同世代間表現穩定，可用于小麥背景中長穗偃麥草染色質的鑒定，可用于抗性基因的連鎖分析，也可作為特異分子標記用于小麥抗赤霉病育種中進行輔助選擇。由此本發明還公開了所述長穗偃麥草基因組特異分子標記用于分子標記輔助選擇，在提高小麥抗赤霉病和抗逆性育種的應用。本發明所采用的分子標記發展技術在其他植物中已經應用，但在長穗偃麥草中沒有應用，本發明所獲長穗偃麥草基因組特異分子標記來自植物本身，對環境影響較小。并且這些標記可用于長穗偃麥草向小麥轉移染色體片段過程中的易位系鑒定，可用于抗赤霉病基因的連鎖分析，可作為特異分子標記鑒定長穗偃麥草染色質而用于小麥抗赤霉病和抗逆性育種中。本發明的分子標記重復性好，擴增穩定，操作簡便，成本低廉，為SSH技術在植物領域的應用提供了成功案例。


圖I :酶切片段與接頭的連接效率1、3 PCR primer I 和 18s_254F ;2、4 :18s_254F 和 18s_254R。圖2兩輪PCR的擴增片段I:消減后第一輪 PCR (PCRprimer I) ；2:未消減第一輪 PCR (PCRprimer I) ；3:消減后第二輪 PCR (Nest primer I 和 2) ；4:未消減第二輪 PCR (Nest primer I 和 2)。圖3消減雜交的效率檢測I 5 :消減后2輪PCR產物;6 10 :未消減2輪PCR產物.1、6 :18循環;2、7 23循環;3、8 :28循環;4、9 :33循環;5、10 :38循環。圖4消減文庫的克隆I 14:不同的克隆。圖5基因組特異分子標記在不同材料中的擴增(引物MEG_23Q1)IDA1E;2:DA2E;3:DA3E4:DA4E5:DA5E;6:DA6E;7:DA7E;8:EE;9:CS;10:Y158;11:Y16;12:N13;13:0425;14:Y14。圖6 :長穗偃麥草染色體特異標記的穩定性I 2 :DS3E(3D) X 安農 8455 的 Fl 代；3 20 :Y16XDS3E(3A)的 F2 代。圖7 :長穗偃麥草染色體特異標記的穩定性I 2 :Y16XDS7E(7A)的 Fl 代；3 20 :Y16XDS7E(7A)的 F3 代。
具體實施例方式實施例I實驗材料和PCR弓I物序列(I)實驗材料普通小麥中國春(CS)，二倍體長穗偃麥草(EE)，中國春-長穗偃麥草二體附加系DA1E、DA2E、DA3E、DA4E、DA5E、DA6E、DA7E (以上材料由加拿大農業部的Dr. Fedax惠贈，材料原始文獻為((Disomic and ditelosomic additions of diploid Agropyron elongatumchromosomes to Triticum aestivum》);揚麥158 (Y158,由江蘇省里下河地區農科所利用揚麥4號/ST1472 / 506育成，品種登記號為GS02001-1997),揚麥16 (Y16，即揚0-126是江蘇里下河地區農科所用揚91F138和揚90-30雜交育成)，寧麥13 (N13,即寧0078，國審麥2006004,由江蘇省農科院糧食作物研究所從寧麥9號系選育)，揚麥14(Y14，即揚0-139， 江蘇里下河農科所用揚麥158和揚麥6號雜交育成)，上述材料有江蘇省里下河農科所提供，均有市售；安農8455 (An8455，可從安徽華韻生物科技有限公司購買)。(2)引物設計根據NCBI公布的18s rRNA基因的核苷酸序列(GenBank HQ870412. 1)，在兩個Rsa I 位點間序列設計引物，18s-254F :GCTCTGGATACATTAGCATG GGATA (SEQ ID No. I)；18s-254R TCGGCATCGTTTATGGTTGAG (SEQ ID No. 2)。其擴增片段長度為 254bp,引物18S-254F和18S-254R所擴增片段可在構建文庫時檢測連接效率和消減效率。依據試劑盒(PCR-SeIect cDNA Subtraction Kit, Clontech 公司)中提供的接頭 I (adaptor I)和接頭 2R(adaptor 2R)序列設計以下三個引物。PCRprimer I CTAATACGACTCACTATAGGGC(SEQID No. 3) ；Nest primer I TCGAGCGGCCGCCCGGG CAGGT (SEQ ID No. 4) ；Nest primer 2 AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT (SEQ ID No. 5)。實施例2基因組DNA的提取供試材料生長至兩葉一心期，以SDS法提取基因組DNA。其步驟如下(I)取幼嫩葉片(約0. lg)，剪碎裝入2ml的離心管中，置于液氮中冷卻，用研磨棒碾碎至粉末狀；(2)離心管放置于室溫稍冷卻，加入700 U I的緩沖液A，輕輕混勻，然后65°C水浴20min,期間每隔5min上下顛倒混勻一次；緩沖液A:NaCl29. 2gIM Tris-HCl100mlEDTA18. 6gSDS15gddH20定容至IL滅菌后用。(3)取出稍冷卻至室溫，加入苯酚和氯仿各350 iU，上下顛倒，充分混勻，抽提5min ；(4) 12000rpm，離心lOmin，將上清液吸取到一個新的離心管中；(5)加入約750ii I氯仿,上下顛倒,充分混勻,抽提5min ；(6) 12000rpm，離心lOmin，將上清液吸取到一個新的離心管中；(7)加入約560 U I異丙醇，輕慢混勻，室溫放置lOmin，可見絮狀沉淀；
(8) I2OOOrpm,離心 lOmin,棄去上清液；(9)加500 u I 70%的乙醇溶液洗滌兩次，每次2_3min.室溫晾干；(10)晾干的DNA溶解于20iil TER中，37°C溫浴45min. _20°C保存備用。實施例3抑制消減雜交文庫的構建利用抑制消減雜交(SSH)技術構建雜交文庫，具體步驟如下
(I)DNA酶切和連接及效率檢測。通過Rsa I酶(Clontech公司)對長穗偃麥草、中國春的DNA進行酶切，酶切反應總體積50ii L，37°C孵育24h，中間補加一次RsaI 1.5iiL。長穗偃麥草的酶切產物分別與接頭I、接頭2R進行連接。連接反應后對連接產物進行連接效率檢查，連接產物進行2輪雜交、2輪PCR擴增，相關操作按PCR-Select cDNASubtraction Kit說明進行。長穗偃麥草和中國春基因組DNA經Rsa I酶切后的電泳結果顯示未消化的基因組DNA位于凝膠加樣孔的頂端，表明提取的基因組DNA沒有發生降解，質量較好。而消化后的基因組DNA則表現為小于2500bp彌散的片段，酶切后DNA片段集中在200bp-2000bp，和預期結果一致。將酶切后的實驗組DNA片段與接頭I和接頭2R進行連接后得到實驗組-I和實驗組-2。以18s rRNA作為參照基因，利用18s rRNA基因特異性引物18S-254F和18S-254R，在長穗偃麥草和中國春中擴增出長度為254bp的片段，而具有接頭的片段利用PCRprimer I和18s_254F可擴增出850bp左右的片段，2種長度片段的亮度比較就可反映連接效率。以實驗組-I和實驗組-2為模板，用引物18S-254F和PCR primerI獲得850bp左右的片段，表明連接成功。該產物的亮度相當于18S-254F和18s_254R擴增所得產物的亮度的1/4，這表明酶切產物與接頭的連接效率滿足要求(圖I)。(2)消減雜交。第一輪消減雜交是將具有接頭I和接頭2R連接的長穗偃麥草RsaI酶切基因組DNA分別與中國春Rsa I酶切基因組DNA (IOOng U L-I)混合，雜交完成后立即進入第二輪。在PCR管中加入變性后的中國春Rsa I酶切基因組DNA和第一輪雜交產物，68°C維持24h，加入200ii L稀釋液，然后68°C 7min終止非特異性雜交，雜交產物貯存于-20°C保存。(3)抑制性PCR擴增。取稀釋后的第二輪消減雜交產物、未消減雜交對照DNA加至無菌PCR管中進行第一輪抑制性PCR。第一輪PCR首先在72°C作用5min以補平接頭，立即進行如下循環94°C，2min ；94°C 40s,66°C 40s, 72°C I. 5min，28 個循環；72°C 5min。取第一輪PCR產物稀釋10倍后作為第二輪PCR的模板。反應體系中除Nest Iprimer和Nest 2primer (10 u M)替換 PCR primer I 外，其他成分相同。第二輪 PCR 程序94°C 2min ；94°C 45s, 68°C 45s, 72°C I. 5min, 15個循環；72°C 5min。2%的瓊脂糖電泳檢測。其余樣品儲存于_20°C。以長穗偃麥草和中國春基因組DNA經消減雜交的產物和未經消減雜交的產物為模板分別進行PCR，PCR產物呈現連續的彌散型條帶(圖2)。由圖可見消減產物主要分布在150bp 2000bp的范圍內，與酶切產物的片段大小相近。經過消減雜交的模板在彌散的條帶中有一些較集中的條帶，應為實驗組中特有的差異片段。經第二輪PCR擴增，其產物濃度高于第一輪PCR。說明經過二次PCR使得差異片段特異性擴增，從而得到富集。(4)消減雜交效率。取稀釋10倍后的消減雜交與未消減雜交對照的二輪PCR產物，加入引物 18s-254F 和 18s-254R 進行 PCR。PCR 程序94°C 45s, 58°C 40s, 72°C lmin, 12循環結束后從每管取出5 PCR產物，剩余的樣品繼續進行4個循環后再分別取出5 ULPCR產物。每4個循環重復一次，直至28個循環結束。以2%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR結果(圖3)。從圖中可以看出，未消減組在18個循環即出現254bp的特異性條帶，而消減組在23個循環才表現254bp的特異性條帶，說明消減效率較高。(5)消減片段的連接反應。將經過消減后的第二輪PCR產物與pMD18/19-T載體(TaKaRa, Code:D102A)連接。連接產物轉化感受態大腸桿菌(E. coli)，藍白斑篩選構建抑制消減雜交文庫。實施例4感受態大腸桿菌的制備和轉化氯化鈣法制備感受態細胞(Bio Basic, No. BS525)(I)取少量凍存菌株大腸桿菌(E. coli)DH5 a，在LB平板培養基上進行劃線培養，恒溫培養箱(37 °C )中培養16 20h。(2)挑取一個單菌落，接種于含2ml SOB培養液中，恒溫搖床(37 °C，250rpm/min) 上培養12 16h。(3)接種Iml的培養物到500ml錐形瓶中(內含100ml SOC培養液)，恒溫搖床(37 0C，250rpm/min)上培養至 OD600 0. 35。(4)迅速將培養物置于冰浴中20min，期間緩慢搖勻使內容物充分均勻冷卻。同時將2個50ml離心管置于冰上預冷，為下一步做準備。(5)將細菌轉移至預冷的離心管中，4°C,4000rpm離心15min,棄去上清。(6)用16ml的溶液A小心的懸浮細菌，冰上放置15min。(7) 4°C, 4000rpm 離心 15min,收集菌體。(8)用4ml溶液B重新懸浮細菌，分裝，80iil/管，液氮速凍，_70°C保存。(9)用于轉化時，將IOOpg到IOng DNA加到感受態細胞(冰上溶解)中。(10)細胞和DNA混合物冰上放置30min，然后37°C培養5min或42°C培養90s，然后再次冰上放置2min。(11)加入Iml SOC培養基，37°C溫和搖動培養lh。(12)在選擇性培養基上涂布培養細胞，恒溫培養箱(37°C )中培養12 16h。實施例5菌落PCR與測序將菌種接種到固體LB培養基上進行藍白斑篩選，挑取白色單菌落進行菌落PCR。在96孔培養板孔中加入含有氨芐青霉素的2XYT液體培養基30iU/孔，用滅菌槍頭從轉化平板上挑取一個白色菌落，在培養液中輕輕吹打幾下，確保槍頭上的菌體吹入培養液中，將培養板置于37°C培養箱30min。配制PCR反應母液，在另一塊96孔板中，順序加入預先準備的菌落液0.5 ill和PCR反應母液9.5 iil，將PCR板混勻離心后進行反應。最后PCR產物用2%的瓊脂糖電泳檢測。根據菌落PCR的結果，選擇適合大小的陽性克隆進行測序。PCR具體反應體系及反應程序見表I和表2。表I菌落PCR反應體系
權利要求
1.一種長穗偃麥草基因組特異分子標記，它是下列36對引物之一第1 對=MEG-I303L: 5’ -TGGATGGTGGCTGCTGAT-3’R: 5’ -CCGTTATGCTGCCCGATT-3’第 2 對=MEG-I258L: 5’ -ACCAGCGGTAGCCCAGTCT-3’R: 5’ -ATCTGTGCGATTTCCCTA-3’第 3 對=MEG-I253L: 5’ -CCAGCGGTAACCCAGTCT-3’R: 5’ -AGTGCGATTTCCCTGACG-3’第 4 對=MEG-I211L: 5’ -GCTCATCAACAGCCTACC-3’R: 5’ -TGTGACTTTCCCACCATT-3’第 5 對=MEG-I242L: 5’ -GAAAGGCTCCGAGAACAC-3’R: 5， -GTCAAAGGCTTAGCAATC-3’第 6 對=MEG-I177L: 5’ -TTGGGCTCAAGAACATTA-3’R: 5’ -GGCAGGTACGACACCTAT-3’第 7 對MEG-2301L: 5’ -TTGGGCTCAAGAACATTA-3’R: 5， -TGGAACGGATGAAGACCC-3，第 8 對MEG-2249L: 5’ -GCCGACTCAGGAGGTGTT-3’R: 5’ -TTGCATCCGTTGGTATTG-3’第 9 對MEG-2304L: 5’ -TGTCCCACCATTGAGCAG-3’R: 5’ -CCGGGCAGGTTAGACTATA-3’第 10 對MEG-2237L: 5’ -CAGTGGCTTGTCAGAGTT-3’R: 5， -CGTAGCAGGATGGTTAGA-3，第 11 對MEG-2422L: 5’ -GCTTGCGTCATCTCCTTC-3’R: 5’ -TGATATGCCACTTCTCCTC-3’第 12 對MEG-2407L: 5， -TTAGTTAGGCAGTAGAGCA-3，R: 5， -CGACAAAGTAAGGTGGTG-3，第 13 對MEG-2371L: 5’ -TGGGTAATGCCCGTCCTC-3’R: 5- -TCCCAGCCAG>TCMG>G-:rH 15 IGI3IL:°3-ATCTGTGCGATTTCCCTG-TR: 5、 IGCGGTAGCCAAGTCTGGT-:rH 15smG-31L:°3-CCAGCGGTAACCCAGTCTI:rR: 5、 -AGTGCGATTTCCCTGACG-Tm20 smG_3iL: 5、 ITGTTCACTCAGCCATCTC-:r匁°3—ATCAACTTCAGCATCTTTA—r鋮 21 lolcoiL: 5- ι>οοοοο ο οο>^ οιω.R: 5、 ITACACTACCGACGAGCAG-:rm22 L:°3-ATGAGCCCAGTTGAGTTGTTTI:rR: 5、 ITACTATGGTTGACCACCTAAAGAG-:rm23 1013 ㈢L:°3-GCTCATCMCAGCCT>cc-:rR:°3ITGTGACTTTCCCACCATT-:rm 24 L:°3-TMCGCCGACACTTAGGA-TR: 5、-GGMACCCAGGGACATCAI:rm25 X4smG-41L: 5、 -CCTTGTGAGCCCAGTTATI:rR:°3-GCAGGTTCTTCCACCATTA—rM 26 SlfL: 5、 IGCTTGCGTCATCTCCTTC-:r 3R: 5’ -TTCGGTCATAGTTGCTCTTC-3’第 27 對MEG-4280L: 5’ -CCGTCTGTTACTCCATCG-3’R: 5’ -CTCTGAAGCGGCGTCTGC-3’第 28 對MEG-4353 L: 5’ -CCTTGTGAGCCCAGTTAT-3’R: 5’ -GCAGGTTCTTCCACCATTA-3’第 29 對MEG-4483L: 5’ -ATCCCAATCTCAAATCAAG-3’R: 5’ -TCAAATACTCAGCACGAAT-3’第 30 對MEG-535QL: 5’ -CCCCAGGCAGAGGAACTA-3’R: 5’ -CCCGGGCAGGTACATCTC-3’第 31 對MEG-5385L: 5’ -CAATCTCGGAGCCATCAT-3’R: 5， -GGCCAGGTTCACATAAGG-3’第 32 對MEG-5260L: 5’ -CATCTTCAGCGGTCTTGC-3’R: 5’ -CGAGCGTGTTGGGTAAGT-3’第 33 對MEG-5377L: 5’ -AAGTCAAGGCTGTCCCATA-3’R: 5’ -ACTTTTCCCATGCTCACA-3’第 34 對MEG-5254L: 5’ -ATTGAGCCTGCCGTAGAG-3’R: 5’ -GTCATTGAGCGTATCCTGTT-3’第 35 對MEG-5456L: 5’ -TCGCTGTCGTGCTTATCT-3’R: 5’ -TGTATTTGGTGTTCCCTCC-3’第 36 對MEG-5333L: 5’ -TTTGTGACGAAGAGGAGCAT-3’R: 5， -GCCCGTAGACAGGAGAAGT-3，。
2.權利要求I所述長穗偃麥草基因組特異分子標記在小麥抗赤霉病基因的連鎖分析中的應用。
3.權利要求I所述長穗偃麥草基因組特異分子標記用于分子標記輔助選擇，在提高小麥抗赤霉病和抗逆性育種的應用。
全文摘要
本發明屬于作物遺傳育種領域，具體為根據NCBI公布的18srRNA基因的核苷酸序列，在兩個RsaⅠ位點間序列設計引物，運用抑制消減雜交技術去除兩個基因組DNA之間的同源序列,富集差異序列，獲得長穗偃麥草特異的DNA片段并進行測序,依據與小麥無同源性的序列重新設計引物而獲得長穗偃麥草基因組特異的分子標記36個。這些標記可用于長穗偃麥草向小麥轉移染色體片段過程中的易位系鑒定,可用于抗赤霉病基因的連鎖分析,可作為特異分子標記鑒定長穗偃麥草染色質而用于小麥抗赤霉病和抗逆性育種中。
文檔編號C12Q1/68GK102676515SQ20121017824
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月1日 優先權日2012年6月1日
發明者葛江燕, 陳士強, 陳建民, 高勇 申請人:揚州大學