專利名稱：基于SLAF-seq開發的長穗偃麥草7E染色體特異分子標記及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于作物遺傳育種領域，具體為根據基于新一代測序技術和生物信息學原理而發展的特異性長度擴增片段測序技術(Specific Length Amplified FragmentSequencing, SLAF-seq)對普通小麥和普通小麥-長穗偃麥草附加系的特異片段進行測序，獲得海量普通小麥、長穗偃麥草序列，利用計算機軟件進行序列數據比對分析，獲得大量長穗偃麥草7E染色體特異片段序列，從而開發出大量長穗偃麥草7E染色體特異分子標記。這些標記不僅可用于長穗偃麥草7E染色體的檢測，還可為小麥抗性育種中的分子標記輔助選擇提供重要的理論與標記基礎。此外，基于SLAF-seq技術開發長穗偃麥草特異染色體分子標記的成功，也為該技術應用于其它物種的分子標記開發提供了重要借鑒，為分子育種、 系統進化、種質資源鑒定提供重要的應用基礎。
背景技術：
I小麥育種目標和其野生近緣種
小麥(斤aestivum)是世界上總產量僅次于玉米的第二大糧食作物,是人類的主食之一。隨著人口的急劇增長、耕地面積的減少，提高小麥產量已成為全世界面臨的一個嚴峻問題。目前小麥育種的主要目標仍然是高產、抗逆和優質，分子標記輔助選擇、外源優良基因的應用、多基因聚合是現代小麥育種研究熱點(何中虎等，2006)。在育種過程中頻繁地使用少數幾個親本，使小麥品種的遺傳組成趨向單一化，遺傳變異日益貧乏，某種程度上限制了小麥產量的提高(賈繼增等，2001)。許多小麥野生近緣物種中存在著大量小麥中所沒有的有利遺傳資源，充分開發和利用小麥近緣野生種中的優良基因資源培育小麥新品種，已成為小麥育種的目標之一(呂偉東等，2007)。普通小麥(AABBDD，2n=42)是異源六倍體植物，屬于禾本科小麥屬普通小麥種{Tri ti cum aes ti vum L.),與小麥屬關系比較近的屬有大麥屬{Hordeum、、披堿草屬(Elymus)、帽草屬(Asperella)、細坦麥屬{Si tan ion)、新麥草屬(Psathyrostachys')、棱軸草屬{Crithopsis)、帶芒草屬(Jaeniatherimi)、冰草屬(Agropyron)、簇毛麥屬Qhynaldia)、黑衷鳳(5feca7<9)、異形花屬 Qieteranthelium)、無芒阜M (/fe/zrart/ia)、旱麥草屬、山羊草屬(Aegilops)等。這些野生近緣種植物中蘊含著栽培小麥中所沒有的大量優良基因，是一個巨大的具有潛在利用價值的遺傳基因庫。該基因庫的優良基因如得到利用，對小麥遺傳改良將具有重要的價值，不僅能提高其產量、改良品質，更能將豐富的抗病、抗逆基因轉入小麥中，改良小麥的抗病性和抗逆性。目前已經與小麥進行雜交的種屬有黑麥屬(Sando et al, 1953)、族毛麥屬(Sears et al, 1953; Hyde et al,1953)、値麥草屬(Dvorak et al, 1974)、山羊草屬(Sears et al, 1956; Chapmna et al,1970)、大麥屬(Kruse et al, 1973; Islam et al, 1975)等。這些遠緣雜交的成功為近緣野生種的抗旱、耐鹽堿以及抗病蟲害的優良基因向小麥基因組進行轉移奠定了堅實的基礎，使得從小麥近緣種屬中尋找或開拓新的重要基因資源成為可能。隨著現代分子生物學的發展，分子標記與作物育種相結合，它不僅彌補了作物育種中傳統的選擇準確率低的缺點，而且加快了育種進程。2小麥的赤霉病抗性
'\、茇赤霉病QFusarium head blight，FHB)又叫爛麥頭、紅麥頭、麥穗枯,是主要由禾谷鐮刀菌(Fusariumgrandnearum >c\mQ}oe)引起的一種世界性病害,尤其在溫暖濕潤和半濕潤地區發生嚴重，是影響小麥高產、穩產和品質的重要因素之一(陸維忠等，2001 ；Duveiller %et a7，2008)。赤霉病大流行年份病穗率達50% 100%，減產高達10% 40% (姚金保等，2000)。此外，該病由多種鐮刀菌引起，病原菌侵染小麥籽粒后產生多種真菌毒素，特別是其中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)毒素會嚴重威脅人類和家畜的健康(Bai, ei W，2004 ;宋鳳英等，2005)。我國長江中下游冬麥區是小麥赤霉病的多發區和重災區，近年來黃淮麥區和關中麥區小麥赤霉病發生也日趨嚴重，影響著國內小麥主產區的糧食安全。隨著全球性氣候變暖和玉米-小麥輪作制度的增加，近10多年來小麥赤霉病在北美和歐洲也大面積發生，造成嚴重的產量和經濟損失al, 2004)。國內外小麥遺傳育種家都圍繞小麥赤霉病開展了廣泛的研究工作，培育抗赤霉病品種是減輕小麥赤霉病危害的根本途徑，也是近年來小麥育種的重要目標之一。我國從上世紀70年代中期開始對小麥赤霉病進行研究，研究表明小麥赤霉病抗性具有遺傳基礎，并且培育出一批抗性較強的優質高產小麥新品種，如蘇麥3號、望水白、紅和尚等(姚金寶等，2000)。目前已經發現的具有赤霉病抗性的QTL涉及到小麥基因組中除7D以外的所有20個連鎖群(Bai , et al, 2004 ；Haberle , et al, 2009 ；Holzapfel , et al, 2008 ；Lin , eta7,2006 ；Ma，et a人2006)，在小麥中發現的主效抗性基因有/ 辦7 (Liu ,et al,2008),Fhb2 (Cuthert , et al,2WYO、Fhb4 (Xue , et a7,2010)和 Fhb5 (Xue , et 2011)等。同時，研究表明小麥種內抗赤霉病的資源很少，而且已經發現的抗性資源在小麥育種實際中也難以有效利用。為了進一步提高小麥抗赤霉病育種的效率，擴大抗赤資源的利用范圍，需要從小麥近緣物種中尋找相關的抗病基因(葛江燕等，2012;陳士強等，2012)。現已成功地進行了小麥與大賴草{Leymus、長穗偃麥草ilophopyrum elongaturn) >中間偃麥草 iL. intermedium)、黑復{Secale cereaJe)、族毛麥 Qlaynaldia villosa)等多種近緣物種的雜交，并獲得了一些具有赤霉病抗性的材料(Oliver，ei al.，2005)。其中，大賴草中的/(Qi , et al.，2008)和長穗偃麥草中的 Fhblop (Zhang , et al. ,2011)兩個赤霉病主效抗性基因的發現，使小麥近緣種的赤霉病主效抗性基因的相關研究得到了更大的關注。3長穗偃麥草赤霉病抗性及特異分子標記發展
偃麥草屬(Jhinopyrum)是禾本科大麥族(/forseae),小麥亞族{Triticeae)中的多年生草本植物，與普通小麥的親緣關系較近，世界范圍內約有50種，主要分布在溫帶和寒帶地區。該屬適應性和繁殖能力較強，并且具有許多優良基因和性狀，如抗病、抗寒、抗旱、耐鹽堿和穗大多花等，是小麥遺傳改良中極具應用價值的小麥近緣物種之一(Dvordk. J, etal.，1974 ;呂偉東等，2007 ;王黎明等，2005)。自然界中存在3種類型的長穗偃麥草，即二倍體長穗偃麥草, 2η = 14)、四倍體長穗偃麥草e/oflgaiw , 2n =28)和十倍體長穗偃麥草{Th· ponticum，2n = 70)。二倍體長穗偃麥草具有E染色體組，它是偃麥草屬多倍體物種的基本染色體組(Dewey ei a7，1984)。一整套中國春-長穗偃麥草二體異附加系、代換系的獲得為深入研究長穗偃麥草奠定了很好的基礎(Dvordk J,eta7.，1974)。研究表明，長穗偃麥草具有良好的赤霉病抗性，在長穗偃麥草IE染色體上攜帶赤霉病抗性的主效基因(劉登才等，2001 ； Jauhar PP, et al.，2009 ;英加等，2000)。在長穗偃麥草的7E染色體也具有赤霉病抗性基因，其中抗性基因Fhblop已被定位于7E染色體的長臂上(Somers , et al. , 2003 ；Shen , et al. , 2004 ;徐國輝等，2009 ； Zhang ,et a\.，2011)，因此，長穗偃麥草已成為改良普通小麥遺傳基礎、提高赤霉病抗性的重要野生近緣物種之一(王黎明等，2005 )。現在公認的赤霉病抗性類型有type I (抗侵染)、type II (抗擴展)、type IIK降解毒素的能力)及type IV (耐毒素的能力)等四種，type I和type II是研究最多的兩種類型(Lin，et a7, 2006 ；Comeau，et a7, 2004)。抗侵染反映的是小麥抵抗赤霉菌初侵染的能力，而抗擴展反映的是在赤霉菌侵染后宿主抵御其通過菌絲生長沿著穗軸延伸的能力。目前鑒定小麥赤霉病抗性的方法主要有自然誘發鑒定和人工誘發鑒定兩種。人工誘發鑒定方法包括病麥粒土表接種、噴霧接種、離體葉片接種、單花滴注接種等(薛樹林等，2010)。但對于赤霉病抗性的鑒定，研究者使用的方法和表示參數各不相同，而且抗性鑒定結果受環境 條件的影響比較大，建立穩定可靠的赤霉病接種方法和鑒定標準是評價品種抗病性最關鍵的問題。為了使抗性鑒定更加準確，研究者將目標轉移到分子標記。分子標記輔助選擇(MAS)是將分子標記應用于作物品種改良過程中進行選擇的一種輔助手段(Ribaut et al, 1998)。在長穗偃麥草向小麥轉移優良的抗赤霉病基因的研究中，已有部分研究進行了長穗偃麥草染色體特異分子標記研究，長穗偃麥草IE和3E染色體的3個特異的RAPD標記0PE-0513(ki、0PF-037(i(i和0PF-154(|(|，可以用來快速鑒定IE和3E染色體(劉樹兵等，1998)。利用SSR分子標記技術，建立了一個偃麥草E染色體組特異的微衛星分子標記，該標記也可以作為E染色體的特異SSR標記(尤明山等，2003)。Shen等通過分布在小麥第7連鎖群的52對SSR引物進行特異擴增，發現5對引物在7E上表現出特異性(Shensi a7，2004)。陳國躍等利用已知植物抗病基因編碼氨基酸保守區域設計了簡并引物，應用RGAP分子標記技術構建了一套完整的長穗偃麥草IE 7E染色體的特異RGAP標記(陳國躍等，2007)。張麗等利用AFLP引物篩選出28個長穗偃麥草E組染色體特異分子標記，并將其中5個轉化為STS標記，可用于小麥背景中長穗偃麥草遺傳物質的檢測(張麗等，2008)。然而，以上發展的長穗偃麥草染色體特異分子標記不但數量少，遠遠滿足不了小麥抗性育種實際的需要，而且染色體特異性及穩定性還不理想，發展更多的覆蓋相關染色體的分子標記，進一步研究這些分子標記與抗病，抗逆基因的連鎖關系，在小麥抗逆、抗病育種實際中利用這些標記進行輔助選擇是非常重要和迫切需要的。4分子標記技術的發展
4. I基于分子雜交技術的分子標記
限制性片段長度多態性(Restriction Fragment Length Polymor- phism, RFLP)是Grodzicker等1974年創立的標記技術,用作腺病毒溫度敏感突變的遺傳標記(Grodzickeret al, 1974)，它是一種以DNA-DNA雜交為基礎的第一代遺傳標記。利用特定的限制性內切酶切割不同的基因組DNA，得到大小不等的DNA片段，通過凝膠電泳分離出不同帶，然后與DNA探針進行Southern雜交和放射顯影，即獲得反映個體特異性的RFLP圖譜。4. 2基于PCR技術的分子標記4.2.1 隨機擴增多態性 DNA(Random Amplified Polymorphism DNA, RAPD) 1990 年由Williams等人利用PCR技術發展的檢測DNA多態性的方法(Williams et al, 1990)。它利用隨機引物(一般為flObp)通過PCR反應非定點擴增DNA片段，然后用凝膠電泳分析擴增產物DNA片段的多態性。擴增片段多態性便反映了基因組相應區域的DNA多態性。但是RAPD受反應條件影響較大，因而其檢測的重復性較差。4.2.2 序列標簽位點(Sequence Tagged Sites, STS) 1989 年 Olson 等提出，是以特定引物進行PCR特異擴增的一類分子標記的統稱。通過設計特定的引物，使其與基因組DNA序列中特定位點結合，從而可用來擴增基因組中特定區域，分析其多態性。4. 2. 3 簡單重復序列(Simple Sequence Repeat, SSR)也稱微衛星DNA (Tautzet al, 1989; Love et al, 1990),是一類由I 6個堿基組成的基序(motif)串聯重復序列，其中最常見是雙核苷酸重復和三核苷酸重復，如(CA)n, (AT)n, (TG)n, (GGC)n, (GAT)n等。每個微衛星DNA的核心序列結構相同，重復單位數目一般為10飛0，它們廣泛分布于絕大多數真核生物基因組中，其多態性主要來源于串聯重復數目的不同。微衛星序列兩側一般是 相對保守的單拷貝序列，根據保守序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛星片段，由于核心序列串聯重復數目不同，因而能夠擴增出不同長度的PCR產物，將擴增產物進行凝膠電泳，根據分離片段的大小決定多態性。SSR標記一般檢測到的是單一的多等位基因位點，而且呈共顯性遺傳，故可鑒別雜合子和純合子。但是，傳統的SSR分子標記開發方法工作量大，需花費大量人力、物力進行測序，而且效率較低。4.2.4 簡單重復序列間區(inter-simple sequence repeat, ISSR) Zietkei-Witcz等于1994年提出的一種以微衛星為基礎的分子標記，它檢測的是兩個SSR之間的一段短DNA序列上的多態性。由于SSR序列廣泛分布于高等生物的基因組中，所以ISSR具有很強的多態性。目前，ISSR標記已廣泛應用于多種植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性等研究中，但在長穗偃麥草中沒有進行研究.
4.2.5 反轉座子位點間擴增多態性(inter-retrotransposon amplified poly-merphism, I RAP) 其原理是基于反轉錄轉座子在基因組中的廣泛分布，根據反轉錄轉座子中LTR的保守序列設計引物，這些引物在PCR過程中可以與LTR序列退火，從而擴增出相鄰的同一家族的反轉錄轉座子成員間的片段。也可以根據反轉錄酶基因的相對保守序列設計引物進行擴增(Kalendar et al. 1999) 0目前，IRAP分子標記技術已應用于大麥(Kalendar et al, 1999; Kalendar et al, 2000; Leigh et al, 2003)、柑橘(Breto etal, 2001)、網茅(Yannic et al, 2004)、馬鈴薯等植物的遺傳研究中。4.2.6 反轉座子微衛星擴增多態性(retrotransposon microsatellite ampli-fied polymorphism, REMAP) 一種基于基于反轉錄轉座子、微衛星在基因組中的廣泛分布而發展的標記技術(Kalendar et al, 1999)。REMAP技術原理是根據反轉錄轉座子的LTR保守序列和微衛星序列設計引物，然后進行PCR，擴增出反轉錄轉座子與鄰近的微衛星間的片段，從而檢測出反轉錄轉座子與鄰近簡單重復序列之間的多態性。4. 3基于限制性酶切和PCR技術的DNA標記
擴增片段長度多態性(Amplified Fragment Length Polymorphi- sm, AFLP) AFLP是1993年荷蘭科學家Zbaeau和Vos發展起來的一種檢測DN A多態性的新方法(Zbaeau etal, 1993)。AFLP是RFLP與PCR相結合的產物，先利用限制性內切酶將基因組DNA切割成不同大小的DNA片段，以雙鏈人工接頭與酶切片段相連接作為PCR擴增反應的模板DNA。利用人工接頭的互補鏈為引物進行預擴增，最后在接頭互補鏈的基礎上添加廣3個選擇性核苷酸作引物對模板DNA基因再進行選擇性擴增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測獲得的DNA擴增片段，根據擴增片段長度的不同檢測出多態性。隨著技術的不斷完善和發展，AFLP技術已廣泛應用于植物種質鑒定(Thomas et al, 1995)、遺傳圖譜構建(Margues etal, 1998)、目的基因定位及遺傳多態性檢測(Pakniyat ei a7, 1997)等方面。4. 4基于DNA芯片技術的分子標記
4.4. I 單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) Lander 于 1996年提出的第三代DNA遺傳標記，是指在基因組水平上由于單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態性，其多態性頻率大于1%。從分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測。4.4.2 多樣性微陣列技術(Diversity arrays technology, DArT) Jaccoud 等開發了一種新的分子標記技術多樣性微陣列技術(Jaccoud，,37,2001),并成功應用于水稻研究中。DArT技術是依賴芯片雜交的方法來區分基因組中座位多態性的差異。將待檢·測的不同樣本的基因組DNA等量混合后經相關限制性內切酶處理，根據電泳結果選擇回收不同大小DNA片段及一系列DNA操作而達到基因組復雜性減少，該部分DNA即為基因組代表，并通過相關過程將該部分DNA固定到玻片上形成點陣列的芯片。以不同樣本單獨經同樣內切酶處理所獲的基因組代表為探針，并組成相應的探針組合對芯片進行雜交，由于不同樣本的基因組DNA序列有差異，因而與芯片上同一點序列雜交的效率不一致，芯片上只有與探針DNA互補的點才具有雜交信號，通過掃描儀可識辨不同顏色雜交信號的強弱或有無來確定待檢測樣本的遺傳差別。DArT技術已在大麥、擬南芥、小麥和高梁等植物中得到應用。本發明利用基于新一代測序技術和生物信息學原理而發展的特異性長度擴增片段測序技術(Specific Length Amplified Fragment Sequencing, SLAF-seq)對普通小麥和普通小麥-長穗偃麥草附加系的特異片段進行測序，獲得海量普通小麥、長穗偃麥草序列，利用計算機軟件進行序列數據比對分析，獲得大量長穗偃麥草7E染色體特異片段序列，從而開發出大量長穗偃麥草7E染色體特異分子標記。這些標記不僅可用于長穗偃麥草7E染色體的檢測，還可為小麥抗性育種中的分子標記輔助選擇提供重要的理論與標記基礎。本發明所用的SLAF-seq技術還未在長穗偃麥草中應用，所獲長穗偃麥草7E染色體特異分子標記重復性強、穩定性高、成本低，為該技術在其它物種中進行分子標記開發提供了重要借鑒。

發明內容
本發明利用SLAF-seq技術獲得了長穗偃麥草及其7E染色體特異片段的序列，并成功獲得了長穗偃麥草染色體特異分子標記10個。長穗偃麥草7E染色體特異分子標記，其對應的特異引物是下列10對引物之一
①特異標記SLAF31945，特異引物SPECh_No.2 L: 5， -AGCAAATAAAACGACAGT -3，
R: 5’ - GGTTTTCACCAATTACAG-3’
②特異標記SLAF27230，特異引物SPECh_No.3L: 5’ -AGTGAATCTGAGATGCATAT-3’
R: 5’ - ATTTTGTTTTTACCATTTTT -3’
③特異標記SLAF5720，特異引物SPECh_No.6 L: 5’ - TTTTTCTGGTACTTACTAAC -3’
R: 5’ - TGTTCTGTGAGATGAATGTT -3’
④特異標記SLAF48385，特異引物SPECh_No.8 L: 5， - AGTCAAGGCAAATTATGGT -3，
R: 5’ - ACTGTCTAATGTCTCGTAAT -3’
⑤特異標記SLAF72555，特異引物SPECh_No.11L: 5， - ACACAAAGGTGAGTGAAAAC -3，
R: 5， - GAGTAGCAAAAATCTCAACA -3，
⑥特異標記SLAF14034，特異引物SPECh_No.12 L: 5’ -CTACCCTTACCACCTCG -3’
R: 5’ -CCACTGGATGCTGTTTAT -3’
⑦特異標記SLAF32494，特異引物SPECh_No.13 L: 5’ -GGTAAGCTTGAAATACATGA-3’
R: 5’ - TCCAAGTGATATTGTAGTCG-3’
⑧特異標記SLAF1998，特異引物SPECh_No.14 L: 5’ -CACTTGTGCATATTCGAGAG -3’
R: 5’ -CCATTTTCCAATATATACAA -3’
⑨特異標記SLAF47229，特異引物SPECh_No.15 L: 5， - GAAATGGCAAGTACCTAA-3’
R: 5， - CAAGTAGAAGTTCAGCAA-3，
⑩特異標記SLAF1699，特異引物SPECh_No.16 L: 5’ - TACACAGAAGGAAAGCATTA-3’
R: 5’ - CATCAGAAATTTTCTTTTGA -3’ 。本發明所獲得的長穗偃麥草染色體特異標記在不同材料和不同世代間表現重復性好、擴增穩定、操作簡便，不僅可用于長穗偃麥草7E染色體的檢測，跟蹤長穗偃麥草的染色體或染色體片段；還可用于抗性基因(如抗赤霉病、抗銹病等基因)的連鎖分析，為小麥抗性育種中充分利用長穗偃麥草優良抗性基因進行分子標記輔助選擇提供重要了標記基礎。本發明利用SLAF-seq技術開發長穗偃麥草特異分子標記周期短、成本低、效率高，可為在其它物種中開發特異分子標記提供重要的成功案例，也為分子育種、系統進化、種質資源鑒定中所用分子標記提供了重要的開發途徑。


圖I長穗偃麥草7E染色體特異分子標記SLAF31945在中國春-長穗偃麥草附加系中的擴增
M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:7 . elongatum (2x)。
圖2長穗偃麥草7E染色體特異分子標記SLAF27230在中國春-長穗偃麥草附加系中的擴增
M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:7 . elongatum (2x)。圖3長穗偃麥草7E染色體特異分子標記SLAF5720在中國春-長穗偃麥草附加系中的擴增
M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9: 7 . elongatum (2x)。圖4長穗偃麥草7E染色體特異分子標記SLAF48385在中國春-長穗偃麥草附加系中的擴增
M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:7 . elongatum (2x)。

圖5長穗偃麥草7E染色體特異分子標記SLAF72555在中國春-長穗偃麥草附加系中的擴增
M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:7 . elongatum (2x)。圖6長穗偃麥草7E染色體特異分子標記SLAF14034在中國春-長穗偃麥草附加系中的擴增
M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:7 . elongatum (2x)。圖7長穗偃麥草7E染色體特異分子標記SLAF32494在中國春-長穗偃麥草附加系中的擴增
M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:7 . elongatum (2x)。圖8長穗偃麥草7E染色體特異分子標記SLAF1998在中國春-長穗偃麥草附加系中的擴增
M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9: 7 . elongatum (2x)。圖9長穗偃麥草7E染色體特異分子標記SLAF47229在中國春-長穗偃麥草附加系中的擴增
M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:7 . elongatum (2x)。圖10長穗偃麥草7E染色體特異分子標記SLAF1699在中國春-長穗偃麥草附加系中的擴增
M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:7 . elongatum (2x)。圖11長穗偃麥草7E染色體特異分子標記SLAF31945在中國春-長穗偃麥草置換系中的穩定性
M:MarkerDL2000;I:DS1E/1A;2:DS1E/1B;3:DS1E/1D;4:DS2E/2A;5:DS2E/2B;6:DS2E/2D;7:DS3E/3A;8:DS3E/3B;9:DS3E/3D;10:DS4E/4A;11:DS4E/4B;12:DS4E/4D;
13:DS5E/5B;14:DS5E/5D;15:DS6E/6A;16:DS6E/6D;17:DS7E/7A;18:DS7E/7B;19:DS7E/7D; 20: CS; 21: Th. elonga turn (2x)。圖12長穗偃麥草7E染色體特異分子標記SLAF31945在其它小麥及多倍體長穗偃麥草中的穩定性
M:Marker DL2000;I:Y14;2:Y16;3:Y158;4:N13;5: Y18;6:An 8455;7:Su 3;8:Th. elonga turn (4x) ; 9 : Th. ponticum (10x, PI179162) ; 10 : Th. ponticum (10x,PI204383) ; 11:CS; 12: Th. elongatum 。圖13長穗偃麥草7Ε染色體特異分子標記SLAF31945在Υ16與DS7E/7A正交后代中的穩定性
M:Marker DL2000 ; I: (Y16 X DS7E/7A) F1; 2-19 : (Y16 X DS7E/7A) F2; 20: Y16;21:DS7E/7A0圖14長穗偃麥草7E染色體特異分子標記SLAF31945在Y16與DS7E/7A反交后代中的穩定性
M:Marker DL2000; I: (DS7E/7AX Y16) F1; 2-19: (DS7E/7AX Y16) F2; 20: Y16;21:DS7E/7A。
具體實施例方式實施例I實驗材料
普通小麥中國春(CS, 2η=6χ=42)、二倍體長穗偃麥草(7 . elonga turn, EE, 2n=2x=14)、 中國春-長穗偃麥草附加系(CS- Th. elonga turn addition lines)、中國春-長穗偃麥草置換系(CS- Th. elonga turn substitutions lines)、四倍體長穗偃麥草(.Th.2n=4x=28)、十倍體長穗偃麥草PI179162, PI204383,
2n=10x=70),以上材料由加拿大農業部的Dr. Fedak惠贈,材料原始文獻為《Disomic andditelosomic additions of diploid Agropyron elonga turn chromosomes to Triticumaestivum、'場轟14(Π4,即揚0-139,江蘇里下河農科所用揚麥158和揚麥6號雜交育成)、揚麥16 (Υ16，即揚0-126是江蘇里下河地區農科所用揚91F138和揚90-30雜交育成)、揚麥158 (Υ158，由江蘇省里下河地區農科所利用揚麥4號/ST1472 / 506育成，品種登記號為GS02001 - 1997)、寧麥13 (Ν13,即寧0078，國審麥2006004，由江蘇省農科院糧食作物研究所從寧麥9號系譜選育)、揚麥18 (Υ18,系譜為4Χ寧麥9號/3/ 6X揚麥158//88-128/南農Ρ045)，上述材料由江蘇省里下河農科所提供，均有市售；安農8455 (Αη8455，安徽農科院育成)和蘇麥3號(Su3，蘇州地區農科所于1968年利用Funo和臺灣小麥育成)為實驗室保存品種；揚麥16與中國春-長穗偃麥草7E/7A置換系正交(Y16XDS7E/7A)與反交(DS7E/7AX Y16) Fl、F2代由本實驗室通過雜交獲得。實施例2基因組DNA的提取
供試材料長至兩葉一心期，以SDS法提取基因組DNA，步驟為(I)取幼嫩葉片(約0. Ig)，剪碎裝入2ml的離心管中，置于液氮中冷卻，用研磨棒碾碎至粉末狀；
(2)離心管放置于室溫稍冷卻，加入700μ1的緩沖液A(緩沖液A配方29. 2g NaCl、100ml 的 IM Tris-HCl、18. 6gEDTA-Na、15g SDS，ddH20 定容至 IL 并滅菌)，輕輕混勻，然后65°C水浴20min,期間每隔5min上下顛倒混勻一次；
(3)取出稍冷卻至室溫，加入苯酚和氯仿各350μ1，上下顛倒，充分混勻，抽提5min；
(4)12000rpm,離心IOmin,將上清液吸取到一個新的離心管中；
(5)加入約750μ1氯仿，上下顛倒，充分混勻，抽提5min；
(6)12000rpm,離心IOmin,將上清液吸取到一個新的離心管中；
(7)加入約560μ1異丙醇，輕慢混勻，室溫放置lOmin，可見絮狀沉淀；(8)12000rpm，離心IOmin,棄去上清液；
(9)加500μ170%的乙醇溶液洗滌兩次，每次2_3min.室溫晾干；
(10)晾干的DNA溶于20μ1TER中，37°C溫浴45min. _20°C保存備用。
實施例3基于SLAF-seq技術獲得長穗偃麥草7E染色體特異片段
(I)簡化方案設計利用酶切預測軟件對參考基因組系統分析，主要根據基因組的GC含量、重復序列情況和基因特點等信息，設計標記開發方案，確定酶切方案和切膠范圍，測序量等以保證其分子標記開發的密度、均勻性從而確保達到預期的實驗目的。(2)基因組DNA酶切通過酶切的方式選取目的片段，達到預期設計標簽數指標要求。酶切體系為基因組DNA 500ng(中國春、長穗偃麥草、中國春-長穗偃麥草7E附加系基因組 DNA)、NEB buffer4 I μ I (New England Biolabs 公司緩沖液 4) Jfeel 0. 12 μ l>ddH20(雙蒸水)加至50 μ I體系，試劑配好后混勻，37°C 15h，用QIAGEN試劑盒純化。(3)5’末端修復將酶切產生的不同類型的末端進行修復，同時對5’末端進行磷酸化修飾。反應體系為步驟(2)中純化樣本DNA 30μ1、Τ4 DNA Ligase Buffer with 10mM ATP (含 10 mM ATP 的 T4 DNA 連接緩沖液)10 μ I、10 mM dNTP Mix (10 mM dNTP 混合液)4μ1、Τ4 DNA Polymerase (T4 DNA 聚合酶)5 μ I、Klenow Enzyme (Klenow 酶)Ιμ 、T4 PNK 5 μ l、ddH20(雙蒸水)45 μ I。試劑配好后混勻，20°C 30分鐘，反應結束后用QIAGEN·試劑盒純化，33μ1 EB回溶。溶液名稱的中文
(4)3’末端加A :與solexa (Illumina公司生產的高通量測序儀)接頭5’端的T互補提高連接效率，并阻止solexa接頭進行自連。反應體系為步驟(3)中純化樣本DNA 32μ1、Klenow Buffer 5μ 1、1 mM dATP 10 μ I、Klenow Exo- 3 μ I。(5)連接solexa測序接頭便于統一模板進行PCR擴增，同時將連接產物錨定在玻璃表面(flow cell)上，進行橋式擴增。反應體系為步驟(4)中純化樣本DNA 10 μ I、DNALigase Buffer 2X (2X 的 DNA 連接酶緩沖液)25 μ I、Adapter (solexa 測序接頭)ΙΟμΙ、DNA連接酶5 μ I。(6)PCR擴增增大起始模板量，達到上機建庫量的要求。反應體系為步驟(5)中純化樣本 DNA 8μ I、PCR primer PE I. O (PCR 引物 I) I. 5μ I、PCR primer PE 2.0(PCR 引物 2) I. 5 μ l、Phusion DNA Polymerase (Finnzymes Oy 公司生產的 DNA 聚合酶)20 μ I、ddH20(雙蒸水)9 μ I。反應程序為98°C預變性30s，98°C變性40s、65°C退火30s、72°C延伸30s、10-12 個循環，72°C延伸 5min。(7)切取目的片段根據設計預期得到的SLAF標簽數目確定切膠范圍。切取大小合適的目的片段制作2%低熔點瓊脂糖膠，將步驟(6)中的PCR產物進行電泳，120V 60分鐘，切取400-500bp的目的片段，QIAGEN膠回收試劑盒回收目的片段。(8)定量與測序優化特異性長度片段cluster的密度，確保測序有效數據量達到預期要求，對所需要的cluster上機測序。(9)序列信息分析利用IlluminaGAIIx測序得到原始數據，利用軟件SLAF_Poly.pl.(北京百邁克公司研發)對測序結果中index序列識別和低質量過濾，得到項目各樣品有效原始數據。利用比對軟件BLAT，將各樣品有效數據分別進行相似度聚類，并通過深度識別和糾正測序錯誤，得到各樣品有效特異序列標簽。實施例4根據長穗偃麥草7E染色體特異序列設計引物
利用SLAF-seq技術共獲得二倍體長穗偃麥草7E染色體特異序列518個。根據測序結果，任意選擇了 16個特異SLAF片段利用Primer Premier5. O軟件各設計引物I對，以發展長穗偃麥草7E染色體特異分子標記。相應的引物序列見表I。
表I根據長穗偃麥草7E染色體特異片段設計的16對引物
權利要求
1.長穗偃麥草7E染色體特異分子標記，其對應的特異引物是下列10對引物之一 ①特異標記SLAF31945，特異引物SPECh_No.2 L: 5， -AGCAAATAAAACGACAGT -3，R: 5’ - GGTTTTCACCAATTACAG-3’ ②特異標記SLAF27230，特異引物SPECh_No.3 L: 5’ -AGTGAATCTGAGATGCATAT-3’R: 5’ - ATTTTGTTTTTACCATTTTT -3’ ③特異標記SLAF5720，特異引物SPECh_No.6 L: 5’ - TTTTTCTGGTACTTACTAAC -3’R: 5’ - TGTTCTGTGAGATGAATGTT -3’ ④特異標記SLAF48385，特異引物SPECh_No.8 L: 5， - AGTCAAGGCAAATTATGGT -3，R: 5’ - ACTGTCTAATGTCTCGTAAT -3’ ⑤特異標記SLAF72555，特異引物SPECh_No.11 L: 5， - ACACAAAGGTGAGTGAAAAC -3，R: 5， - GAGTAGCAAAAATCTCAACA -3， ⑥特異標記SLAF14034，特異引物SPECh_No.12 L: 5’ -CTACCCTTACCACCTCG -3’R: 5’ -CCACTGGATGCTGTTTAT -3’ ⑦特異標記SLAF32494，特異引物SPECh_No.13 L: 5’ -GGTAAGCTTGAAATACATGA-3’R: 5’ - TCCAAGTGATATTGTAGTCG-3’ ⑧特異標記SLAF1998，特異引物SPECh_No.14 L: 5’ -CACTTGTGCATATTCGAGAG -3’R: 5’ -CCATTTTCCAATATATACAA -3’ ⑨特異標記SLAF47229，特異引物SPECh_No.15 L: 5， - GAAATGGCAAGTACCTAA-3’R: 5， - CAAGTAGAAGTTCAGCAA-3， ⑩特異標記SLAF1699，特異引物SPECh_No.16 L: 5’ - TACACAGAAGGAAAGCATTA-3’R: 5’ - CATCAGAAATTTTCTTTTGA -3’。
2.權利要求I所述長穗偃麥草7E染色體特異分子標記在跟蹤長穗偃麥草的染色體或染色體片段中的應用。
3.權利要求I所述長穗偃麥草7E染色體特異分子標記在長穗偃麥草抗赤霉病、抗銹病基因的連鎖分析中的應用。
全文摘要
本發明屬于作物遺傳育種領域，具體為根據基于新一代測序技術和生物信息學原理而發展的特異性長度擴增片段測序技術，對普通小麥和普通小麥-長穗偃麥草附加系的特異片段進行測序，獲得海量普通小麥、長穗偃麥草序列，利用計算機軟件進行序列數據比對分析，獲得大量長穗偃麥草7E染色體特異片段序列，從而開發出10個長穗偃麥草7E染色體特異分子標記。這些標記不僅可用于長穗偃麥草7E染色體的檢測，還可為小麥抗性育種中的分子標記輔助選擇。此外，基于SLAF-seq技術開發長穗偃麥草染色體特異分子標記的成功，也為該技術應用于其它物種的分子標記開發提供了重要借鑒，為分子育種、系統進化、種質資源鑒定提供重要的應用基礎。
文檔編號C12N15/11GK102888400SQ201210444430
公開日2013年1月23日 申請日期2012年11月9日 優先權日2012年11月9日
發明者陳建民, 陳士強, 高勇, 黃澤峰, 秦樹文, 高營營 申請人:揚州大學