專利名稱：副溶血性弧菌檢測用引物組及方法
副溶血性弧菌檢測用弓I物組及方法技術領域：
本發明屬于食品安全領域，涉及環介導等溫擴增技術，具體涉及一種基于副溶血性弧菌檢測用引物組及方法。
背景技術：
副溶血性弧菌(Bibrio Parahemolyticus),又稱嗜鹽桿菌，屬于非霍亂弧菌，臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀，副溶血性弧菌是最常見的食源性細菌病原體，在多種食物如水產品、腌制品中常會發生副溶血性弧菌污染，在廣東、廣西、海南、江蘇、浙江等養殖老區尤為嚴重，已成為我國重要的食源性致病菌。傳統副溶血性弧菌檢測方法是一種簡單的微生物增殖步驟，專門針對以食品為傳播載體的病原，雖然可靠的，但卻很費力、耗時，需要4 7天才能完成。因此，在需要及時、 快速評價食品中微生物的安全性時，通常不被采用。隨著DNA和抗體技術的發展，近10 15年間發展了無數改進的方法，其中許多可以在48h內檢出副溶血性弧菌，這些方法通稱為快速檢測。環介導等溫擴增技術(Loop-mediatedIsothermal Amplification,LAMP)是日本的榮研株式會的Notomi T等2000年在Nucleic. Acids. Res.雜志上報道的一種新的核酸擴增方法。LAMP方法是針對靶基因的6個區域設計4種特異的引物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件保溫幾十分鐘，完成核酸擴增反應。可以在I小時之內，將靶基因DNA片段擴增109-1010倍，并且只要用肉眼觀察白色混濁沉淀，就能鑒定是否擴增，不需要電泳檢測過程。LAMP方法的原理決定了它具有許多其它DNA擴增方法無法比擬的優點(I)操作簡單，無需特殊設備=LAMP反應在等溫狀態下就能進行，無需預先進行雙鏈的變性。同時LAMP反應不需要特殊儀器和試劑，只需要將PCR反應中的Taq DNA聚合換成具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶；(2)靈敏度高LAMP方法能檢測到比PCR方法還少的拷貝數，其靈敏度可以比PCR法高10 100倍；(3)特異性強LAMP應體系要求四條引物完全匹配才能進行擴增，信息量大，因此反應體系中的其他模板對反應的干擾很小；(4)速度快，耗時短LAMP反應不需要加熱變性，省去了熱循環步驟，40 60min即完成擴增反應；(5)可直接擴增RNA :擴增RNA時，只要在擴增DNA試劑的基礎上加上逆轉錄酶和酶阻抑劑，就能一步實現RNA的擴增；科學家們已經建立了逆轉錄LAMP (RT-LAMP)方，該方法的靈敏度是RT-PCR方法的100倍；(6)產物檢測方便、快捷LAMP反應只要用肉眼觀察或濁度儀檢測沉淀濁度就能夠判斷擴增與否，進行實時驗證。
發明內容本發明要解決的一個技術問題是，提供一種對副溶血性弧菌具有特性的引物組。上述技術問題通過以下技術方案實現一種副溶血性弧菌檢測用引物組，其特征在于，包括下列引物
F3 引物GAC GTA CCA TGT ACT AGA TC ；B3 引物GCC ATC ACT AGC CAT AGC G ；FIP 引物:CGA TCG CCA GCA TGC GCG GCA TGT CTA TTG GTG AGA GGT CTTG ；BIP 引物CAT GAT TTC AAT GAC GTC CCA TTC TGAACC CAAAAT CCG GGC。本發明要解決的另一個技術問題是，提供一種利用上述引物組基于環介導等溫擴增法檢測副溶血性弧菌的方法。
上述技術問題通過以下技術方案實現一種副溶血性弧菌的檢測方法，具體為(101)對待檢樣品提取待檢I旲板DNA待檢樣品用增菌液進行培養，得待檢增菌液，取ImL待檢增菌液，7000 X g離心2min，盡量吸棄上清液；加入80 ii LDNA提取液，混勻后沸水浴lOmin，置冰上IOmin ；7000 X g離心2min，取上清液作為待檢模板DNA ；(102)副溶血性弧菌的環介導等溫擴增按下述LAMP反應體系，在反應管中加入相應反應液、Bst DNA聚合酶，混勻，然后加入穩定液，最后在反應管中加入待檢模板DNA，進行65°C環介導等溫擴增反應60min ；LAMP反應體系為
權利要求
1.一種副溶血性弧菌檢測用引物組，其特征在于，包括下列引物 F3 引物GAC GTA CCA TGT ACT AGA TC ； B3 引物GCC ATC ACT AGC CAT AGC G ； FIP引物CGA TCG CCA GCA TGC GCG GCA TGT CTA TTG GTG AGA GGT CTTG ； BIP引物CAT GAT TTC AAT GAC GTC CCA TTC TGAACC CAAAAT CCG GGC。
2.一種副溶血性弧菌的檢測方法，其特征在于，具體為 (101)對待檢樣品提取待檢模板DNA 待檢樣品用增菌液進行培養，得待檢增菌液，取ImL待檢增菌液，7000 Xg離心2min，盡量吸棄上清液；加入80 ii LDNA提取液，混勻后沸水浴lOmin，置冰上IOmin ;7000Xg離心2min,取上清液作為待檢模板DNA ； (102)副溶血性弧菌的環介導等溫擴增 按下述LAMP反應體系，在反應管中加入相應的引物、dNTPs、ThermoPol緩沖液、MgS04、Bst DNA聚合酶、水,混勻,然后加入甜菜堿,最后在反應管中加入待檢模板DNA,進行65°C環介導等溫擴增反應60min ； LAMP反應體系為
3.根據權利要求2所述的副溶血性弧菌的檢測方法，其特征在于，當副溶血性弧菌LAMP反應體系的總體積為25 u L,副溶血性弧菌LAMP反應體系具體為 組分工作液濃度加樣量(y L)~ 反應體系終濃度 F3 引物IOy mol/L 050. 2 y mol/L B3 引物IOy mol/L 050. 2 y mol/L FIP 引物40y mol/L LO1.6y mol/L BIP 引物40y mol/L LO1.6y mol/LdNTPslOmmol/L 4I.6mmol/L 甜菜減5mol/L40.8mol/LMgS04150mmol/L I8mmol/LThermoPol 緩沖液IOX2^5IX Bst DNA 聚合酶8U/y L050. 16U/y L 待檢模板DNAI15I 去離子水/7. 5/ o
4.根據權利要求2所述的副溶血性弧菌的檢測方法，其特征在于，所述標準菌株模板DNA，通過如下方法取得將副溶血性弧菌標準菌株接種于6%胰蛋白胨水中36°C ±1°C培養18h 24h，用無菌生理鹽水稀釋至約IO6 108CFU/mL，得稀釋液，然后取ImL稀釋液加到I.5mL無菌離心管中，7000 Xg離心2min,盡量吸棄上清液；加入80 y LDNA提取液,混勻后沸水浴lOmin，置冰上IOmin ;7000Xg離心2min，取上清液作為標準菌株模板DNA。
全文摘要
本發明涉及一種副溶血性弧菌檢測用引物組，包括下列引物F3引物GAC GTACCATGTACTAGATC；B3引物GCCATCACTAGCCATAGCG；FIP引物CGATCGCCAGCATGCGCGGCATGTCTATTGGTGAGAGGTCTTG；BIP引物CATGATTTCAATGACGTCCCATTCTGAACCCAAAATCCGGGC。本發明還提供一種使用上述引物組檢測副溶血性弧菌的方法。本發明的檢測方法具有特異性高、重復性好、快速可靠的優點，為副溶血性弧菌的檢測提供一強力有效的手段。
文檔編號C12Q1/04GK102747148SQ20121017836
公開日2012年10月24日 申請日期2012年5月31日 優先權日2012年5月31日
發明者馮家望, 游淑珠, 王小玉, 胡松楠, 鄺筱珊, 鄭立新 申請人:馮家望, 王小玉, 胡松楠