專利名稱：產土臭素的菌株的制作方法
技術領域：
一種結合聞香手段從制曲過程中篩選白酒中微生物代謝相關的香氣物質產生菌的篩選及運用該方法篩選土霉味物質土臭素(geosmin)產生菌的篩選鑒定及其應用，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
白酒是我國特有的一種蒸餾酒，并深得消費者的喜愛。白酒香味成分復雜是眾所周知的，每種白酒都是由幾百種香味成分組分的集合體。而這些呈香物質的來源，與白酒的生產過程是離不開的。白酒中香味物質的形成，不僅是微生物將淀粉、蛋白質等物質轉化而生成醇、醛、酸、酮、酯等物質，同時與釀制過程中的原料選擇、制曲工藝、釀酒工藝及操作過程密切相關。不同的白酒所采用的原料和輔料各有差異，而不同的原料的組分也有很大的差異，這就 為白酒香味物質提夠了豐富的前驅物。如大米中富含醇、醛、酮、酸、酯、酚、內酯類、乙縮醛類、呋喃類、吡嗪類、噻吩、噻唑類等化合物；玉米中富含芳香族化合物；豌豆中富含吡嗪類化合物等。糧谷原料中的淀粉、蛋白質、脂肪、單寧、果膠質及輔料中的木質素等成分經微生物發酵后的代謝產物基本上都是白酒的香味成分。乳酸、乙酸和高級醇類等來自糧谷中淀粉的降解和轉化，高級脂肪酸乙酯來源于糧谷中脂肪酸的酯化，甲醇由果膠質酶解而得，等
坐寸ο相對于同是蒸懼酒的威士忌(whiskey)、白蘭地(brandy)和蘭姆酒(rum)而言,我國的白酒屬多菌種發酵，微生物包括大曲微生物、窖泥微生物還有空氣微生物，所以白酒的香味成分是數量眾多的霉菌、酵母菌和細菌等微生物相互作用形成的特定微生態結構，進而代謝產生的揮發性代謝產物的結果。這就造就了白酒的香味成分不但種類繁多，含量微少，且每種白酒中的香味成分的種類和含量都不相同。含量微少、種類繁多的香味物質在每種白酒的酒體中有自己一套既復雜又微妙的香和味的關系。因此，確定每種白酒典型風格最重要的風味構成組分，明確各香味組成成分在白酒釀造過程中的來源及產生條件，從而在源頭控制白酒中的各香氣的含量及比例，對提聞白酒風味品質具有深遠影響。

發明內容
針對現有技術難點及存在的問題，本發明的目的在于提供一種結合聞香手段，從制曲過程中篩選白酒中微生物代謝產生的香氣物質的相關菌株的篩選及鑒定方法。該方法可快速有效地從白酒生產過程中，如制曲過程及其周圍環境中篩選產白酒中目的香氣物質的菌株。應用該方法，成功從清香型白酒廠生產的大曲中篩選得到四株產geosmin的菌株，分別命名為LBG-FXJ、FJ-HX、QC-I和QC-2，根據其菌落、細胞形態和生理生化特征以及16SrRNA基因序列比對結果，該四菌株均為鏈霉菌()，其中LBG-FXJ為白色鏈霉菌(albus、, FJ-HX 為弗氏鏈霉菌(Sire/ fradiae、。這四菌株在土豆-葡萄糖培養基中均能大量積累土霉味物質geosmin。解決了清香型白酒中土霉味物質geosmin來源的問題。篩選得到的四株鏈霉菌可以作為模式菌，用于白酒生產中產geosmin菌株的檢測及其產生機理的研究。本發明的技術方案產土臭素的菌株，共四株，分別為
(1)分類命名為白色鏈霉菌LBG-FXJ,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 4206 ；
(2)分類命名為弗氏鏈霉菌fradiae) 已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 4205 ；
(3)分類命名為鏈霉菌sp.) QC-I,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 4535 ；
(4)分類命名為鏈霉菌sp.) QC-2,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 4536。所述產土臭素的菌株的篩選方法，結合聞香手段從制曲過程中篩選白酒中微生物代謝相關的香氣物質產生菌的篩選方法，以風味為導向，結合嗅覺感官，篩選能夠代謝白酒中相關香氣物質的微生物；
所采取的篩菌策略為將大曲的菌懸液稀釋涂布到分離培養基上，30°C培養4天后，挑取單菌落接入滅菌后加水量為麩皮質量50%-150%的麩皮管中，30°C培養7天后，經過2-3個事先經培訓，熟知目的香氣的聞香人員聞香檢測，初步篩選從中發現有目的香氣的管子；將該管中的一部分發酵產物進行氣相色譜-聞香儀(GC-O)和氣相色譜-質譜(GC-MS)檢測，進行進一步驗證，確定具有目的香氣化合物后，將該管中的微生物進行分離，得到產目的香氣物質的目的菌株；
所述產目的香氣物質的目的菌株為上所述產土臭素的菌株；
選取麥芽汁瓊脂為分離培養基，選取PH為6. O的麥芽汁瓊脂用于霉菌、酵母的篩選；選取pH為8. O的麥芽汁瓊脂用于放線菌、細菌的篩選；
添加質量分數O. 1%的Triton-100到分離培養基中，防止菌絲擴散，從而形成單菌落，易于挑取。所述產土臭素的菌株的應用，篩選得到的四株產土臭素的鏈霉菌可以作為模式菌，用于白酒生產中產geosmin菌株的檢測及其產生機理的研究。為了模擬制曲過程的培養條件，使分離到的純種菌株盡可能再現曲中的生長狀態，制作了“固體麩皮管”。從而避免由于培養條件不同導致微生物代謝產物不同的因素。固體麩皮管制備50g麩皮，25-75g水，混合均勻。裝入試管中，壓實至試管約2/3處。115°C下，滅菌15min。為確定該培養方式是否能夠使曲中產geosmin的微生物在該培養條件下產geosmin,做以下試驗
取Ig曲粉，加到20mL無菌生理鹽水，玻璃珠打勻。將菌懸液按十倍比例逐次稀釋至不同濃度梯度。取0. 5mL各梯度菌懸液至不同固體麩皮試管中，30°C靜置培養。菌懸液濃度較高的在5-7天出現該氣味，菌懸液濃度較低的在10-15天出現該氣味。說明該培養方式能夠使產geosmin的微生物生長并產生該物質，可以作為篩選驗證方法。同時，在篩菌過程中發現，涂布平板后，最先長出的是羽絨狀的絲狀菌，并且迅速、生長，覆蓋其他類型菌落。從而不能將涂布產生的單菌落挑取，限制了可分離菌株的數量。為去除霉菌蓬松的菌絲體的干擾，添加O. 1%的Triton-ΙΟΟ，可以有效防止防止菌絲擴散。從而形成單菌落，易于挑取。生物材料樣品保藏
從清香型白酒廠生產的大曲中篩選得到四株產土臭素geosmin的菌株，分別命名為LBG-FXJ、FJ-HX, QC-I和QC-2，根據其菌落、細胞形態和生理生化特征以及16S rRNA基因序列比對結果，該四菌株均為鏈霉菌(泣其中LBG-FXJ為白色鏈霉菌(S trep tomyces albus ), F J-HX 為弗氏鏈霉菌(51 trep tomyces fradiae )。在申請日之前已送往中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，
LBG-FXJ保藏編號CGMCC No. 4206，保藏日期2010年10月8日。
FJ-HX保藏編號CGMCC No. 4205，保藏日期2010年10月8日。QC-I保藏編號CGMCC No. 4535，保藏日期2011年I月11日。QC-2保藏編號CGMCC No. 4536，保藏日期2011年I月11日。


圖I麩皮中添加水的比例對微生物代謝產生geosmin的影響。圖2產geosmin菌株FXJ發酵麩皮后風味質譜圖。圖3四株產geosmin菌的菌落形態。
具體實施例方式實施例I :
篩選方案確定
將大曲的菌懸液稀釋涂布到分離培養基(麥芽汁瓊脂)中。30°C培養4天后，挑取單菌落接入滅菌后加水50%-150%的麩皮管中，30°C培養7天后，經過2-3個事先經培訓，熟知目的香氣的聞香人員聞香檢測。初步篩選從中發現有土霉味的管子。將該管中的一部分發酵產物進行GC-O和GC-MS檢測，進行進一步驗證。確定具有目的香氣化合物后，將該管中的微生物進行分離。實施例2:
分離培養基的確定
由于在麥芽中各種微生物生長較快，利于縮短篩菌周期。且麥芽汁易于大量制備，從而可以保證篩菌培養基的穩定性。所以，選取麥芽汁瓊脂為篩菌培養基。選取pH為6. O的麥芽汁瓊脂用于霉菌，酵母的篩選。選取PH為8. O的麥芽汁瓊脂用于放線菌，細菌的篩選。添加O. 1%的Triton-100，防止菌絲擴散。從而形成單菌落，易于挑取。實施例3
篩選產geosmin菌株培養基確定
為了模擬制曲過程的培養條件，使分離到的純種菌株盡可能再現曲中的生長狀態，制作了“固體麩皮管”。從而避免由于培養條件不同導致微生物代謝產物不同的因素。同時在研究過程中發現發霉麩皮中會有geosmin產生，所以考察了向麩皮中不同水的添加量對微生物產geosmin濃度的影響，從而確定最適合產geosmin的水添加量。由圖I可知，向麩皮添加50°/Γ 50%的水均可以導致麩皮在自然條件下產生明顯含量的geosmin，說明添加50°/Γ 50%的水是適合微生物geosmin的產生，所以確定添加50°/Γ 50%的水到麩皮中作為篩選培養基。實施例4
白酒大曲中產geosmin菌株的篩選
運用上述方法，從各酒廠生產的白酒大曲中，共分離到867株單菌株，將這些菌株進行單菌種麩皮管發酵，從中發現5株菌發酵后具有明顯土霉氣味。利用頂空固相微萃取結合氣相質譜(HS-SPME-GC-MS)和氣相色譜-聞香儀(GC-0)，將該發酵產物進行檢測。通過比對土霉未知化合物與 geosmin 在 NIST 05 a. L Database (Agilent Technologies Inc.) >AMDIS、Wiley 275. L database中標準離子碎片圖譜比對,直接添加geosmin標準品離子圖譜等方法來確認檢測土霉異味化合物。發現這五株菌的揮發性代謝產物譜中有明顯的geosmin峰,說明geosmin為這五株菌的主要產物。這五株菌分別為清香型白酒廠A清巷 曲中和清香型白酒廠B紅心大曲中各分離得到一株產geosmin的菌株，分別命名為FXJ和HX。從汾酒廠所用的清茬大曲中分離出三株產geosmin的菌株，分別命名為QC_1，QC-2，QC-3。實施例5
菌落形態特征觀察
為進一步描述所篩選得到的五株菌，在PDA培養基中觀察該菌的菌落形態特征，其結果如附圖3。表I PDA培養基上的五株菌的菌落形態特征
權利要求
1.產土臭素的菌株，分類命名為弗氏鏈霉菌(5 /· /7 ο _75·/ra￡/iae)FJ-HX,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 4205。
2.權利要求I所述產土臭素的菌株的應用，其特征在于篩選得到的該株產土臭素的弗氏鏈霉菌用作模式菌，用于白酒生產中產geosmin菌株的檢測及其產生機理的研究。
全文摘要
產土臭素的菌株，屬于生物工程技術領域。本發明公開了結合聞香手段，以風味為導向，從制曲過程中篩選白酒中微生物代謝產生的香氣物質的相關菌株的篩選及鑒定方法。應用該方法，成功從清香型白酒廠生產的大曲中篩選得到土臭素geosmin的菌株，命名為FJ-HX，根據其菌落、細胞形態和生理生化特征以及16SrRNA基因序列比對結果，該菌株為弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)。其在土豆-葡萄糖培養基中能大量積累土霉味物質geosmin。解決了清香型白酒中土霉味物質geosmin來源的問題。篩選得到的弗氏鏈霉菌可以作為模式菌，用于白酒生產中產geosmin菌株的檢測及其產生機理的研究。
文檔編號C12Q1/04GK102719376SQ20121018180
公開日2012年10月10日 申請日期2011年4月8日 優先權日2011年4月8日
發明者徐巖, 杜海, 范文來 申請人:江南大學