專利名稱：預防或者治療纖維化疾病的中藥組合物及制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥領域，特別涉及一種預防或者治療纖維化疾病的中藥組合物及制備方法和用途。
背景技術：
組織纖維化是內外致病原引起組織損傷的共同后果，也是多種感染和非感染性炎癥疾病的基本病理改變。組織纖維增生不僅見于各種慢性肺疾病、心血管疾病、慢性進行性腎病、肝硬化、慢性胰腺炎、系統性紅斑狼瘡以及黃斑變性等，而且能夠影響腫瘤生長與轉移、促進器官移植的慢性排斥反應發生。事實上，組織纖維化累及人體幾乎所有器官和系統，是許多疾病致殘、致死的主要原因，嚴重威脅人類健康。據美國有關統計資料證明，因各種疾病而致死的病人中，接近45%可以歸于各種組織纖維增生疾病。長期以來，抗炎藥，特別是糖皮質激素，是治療肺纖維化的主要藥物，然而，糖皮質激素的治療不僅副作用大，效 果不確切，長期使用還可能加重肺纖維化的發展。纖維增生性疾病屬于典型的由遺傳、環境等多種因素參與的慢性復雜疾病，其發病機制是由多靶點失衡造成的，單靶點藥物難以獲得足夠的治療效果，并且毒副作用較大。對多種纖維化疾病模型的研究發現，纖維化疾病是ー類Th2免疫反應占優勢的疾病，Th2免疫反應是維持機體及受損組織處于慢性炎癥狀態、促進組織發生纖維化的原兇。Th2細胞因子如IL-5、IL-13能促進和加重器官纖維化；相反，Thl細胞因子如干擾素Y則具有抗纖維化的作用。目前，組織纖維增生性疾病仍然沒有針對性有效的治療方案。因此，開發新的抗組織纖維化藥物以提高患者生活品質和降低死亡率，是一件迫在眉睫的事。

發明內容
本發明要解決的技術問題就是針對的現有技術缺乏有效的預防或治療纖維化疾病的藥物的不足，提供一種新的預防或者治療纖維化疾病的中藥組合物及制備方法和用途。本發明提供一種預防或者治療纖維化疾病的中藥組合物，其配方包括原料A和/或原料A的提取物；所述的原料A的提取物為水或こ醇水溶液的提取物；其中，所述的原料A 包括黃苗、黑木耳(Auricularia auricula (L. exHooke) Underw)、三七、以及靈芝 B ;所述的靈芝 B 為赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst.)和 / 或紫芝(Ganodermasinense Zhao, Xu et Zhangノ；白勺胃LAuricularia auricula (L. exHooke；Underw)、‘三七、以及靈芝B之間的重量比為9 30 9 30 Γ9 6 12。本發明中，所述的黃苗、黑木耳(Auriculariaauricula (L. exHooke) Underw)>三七、以及靈芝B之間的重量比較佳的為12:9:1 :6。需要說明的是，本發明中所說的原料A的重量比均以原料的重量計量，即若本發明中藥組合物配方中使用的是原料A的提取物，在計算用量時也以其原料A的重量計量。本發明中，所述的黃芪、三七本領域技術人員均知，均為中國藥典收錄名稱定義的中藥材。本發明中，所述的赤芝(GanodermaLucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst.)、紫芝(Ganoderma sinense Zhao, Xu et Zhang)為本領域常規所用藥材，為中國藥典收錄,其中，所述的紫芝(Ganoderma sinense Zhao, Xu et Zhang)的同物異名為紫芝(Ganodermajaponicum(Fr.)Lloyd)。本發明中，所述的原料A在直接使用吋，一般按本領域常規粉碎使用，較佳的使粒徑大小過40目篩即可。本發明中，所述的原料A的提取物一般按本領域常規方法制得，較佳的按下述方法制得將原料A用3 10重量倍數的水或3 10重量倍數的70v/v% 95v/v%こ醇水溶液回流提取2 3次，每次提取I 3小時，合并提取液，過濾，濃縮，干燥，粉碎即可。其中，所述的原料A的提取物在制備時按本領域常規操作，既可以將原料A中各原料分別制備提取物后混合，也可以各原料混合后再制備提取物。其中，當將原料A中各原料分別制備提取物后混合時，黃芪的提取物的提取時間較佳的為1-2小時；黑木耳(Auricularia auricula (L. exHooke)Underw)的提取物的提取時間較佳的為I. 5 3小時；三七的提取物、以及靈芝B的提取物的提取時間分別較佳的為2^3小時。本發明中，所述的中藥提取物較佳的還含有原料C和/或原料C的發酵培養物，所述的原料 C 為冬蟲夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc)和 / 或隱孔菌(Crytoporusvolvatus (Peck. ノHubbara. )0其中，所述的冬蟲夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc)的發酵培養物較佳的為蝙幅蛾被毛孢(Hiresutella hepiali Chen et Shen. (1985))的發酵培養物；蝙幅蛾被毛抱(Hiresutella hepiali Chen et Shen. (1985))的同種異名為中國被毛抱(Hiresutella sinensis X. J. Liu, Y. L. Guo. (1989))。其中，所述的隱孔菌(Crytoporus volvatus (Peck. )Hubbara.)的發酵培養物較佳的為中華隱孔菌(Crytoporus sinensis Sheng H. Wu&M. Zang)的發酵培養物。本發明中，所述的冬蟲夏草發酵培養物為按本領域常規發酵方法將冬蟲夏草發酵培養獲得，較佳的由下述方法制得將冬蟲夏草菌種接種至液體培養基中，之后進行通氣培養得發酵培養物，干燥即可。所述的冬蟲夏草菌種為按本領域常規方法經過ニ級或三級種子培養獲得的菌種。其中，所述的ニ級種子培養是指依次經過斜面菌種培養、搖瓶種子培養、一級和ニ級種子罐培養。所述的三級級種子培養是指依次經過斜面菌種培養、搖瓶種子培養、一級、ニ級和三級種子罐培養。所述的培養的條件為本領域常規操作，較佳的為10°c 18°C、pH
6.O 7. 5。所述的斜面菌種培養、搖瓶種子培養、ー級、ニ級和三級種子罐培養的培養時間，較佳的分別為30 60天、10天、6天、6天、6天和6 12天。其中，所述的液體培養基為本領域常規使用，較佳的為重量百分比的碳源0.5% 5%，氮源0. 2% 5%、微量元素、維生素，補足余量的水；更佳的為重量百分比蠶蛹粉2. 0%,蛋白胨I. 5%，玉米粉I. 8%，蔗糖I. 6%，磷酸ニ氫鉀0. 1%，硫酸鎂0. 05%，其余為水分。其中，所述的通氣按本領域常規操作，一般為通入無菌空氣。 其中，所述的干燥為本領域常規操作，較佳的為噴霧干燥。所述的干燥可按本領域常規，直接將發酵培養物勻漿后干燥，也可以先過濾得菌絲體和發酵濾液(或經膜分離獲得有效發酵濾液)之后分別干燥。本發明中，所述的隱孔菌發酵培養物為按本領域常規發酵方法將隱孔菌發酵培養獲得，同前述冬蟲夏草發酵培養物的制備方法，即較佳的由下述方法制得將隱孔菌菌種接種至液體培養基中，之后進行通氣培養得發酵培養物，干燥即可。所述的隱孔菌菌種為按本領域常規方法經過ニ級或三級種子培養獲得的菌種。其中，所述的ニ級種子培養、三級級種子培養如前所述。所述的培養的溫度為本領域常規操作，較佳的為20°C 30°C。所述的斜面菌種培養、搖瓶種子培養、ー級、ニ級和三級種子罐培養的培養時間，較佳的分別為3 10天、6天、6天、6天、6天和I 10天。其中，所述的液體培養基、通氣、干燥的操作同前述冬蟲夏草發酵培養物制備操作條件。所述的液體培養基較佳的為重量百分含量葡萄糖O. 6%-3. 0%，麥芽糖I. 5%-1. 8%，玉米粉 0-0. 3%，蛋白胨 O. 1%-0. 5%,酵母粉 O. 8%-1%，KH2PO4 O. 1%，MgSO4 · 7H20 O. 05%,維生素B1 O. 05%-0. 1%，瓊脂 0-2. 7%, pH 4. 5-5. 0，其余成分為水。 本發明中，所述的原料C和/或原料C的發酵培養物的用量較佳的為重量份數3 20，更佳的為3 9。所述的原料C的發酵培養物計量以原料C的發酵培養物重量計。本發明中，所述的靈芝B和/或靈芝B提取物還可以被替代為原料C和/或原料C的發酵培養物，獲得本發明的中藥提取物。本發明中，所述的中藥組合物還可以含有藥學上可接受的載體。本發明中，所述的藥學上可接受的載體是指藥學領域常規的藥物載體。其中，稀釋劑如淀粉、糖粉、糊精、微晶纖維素、甘露醇、乳糖和大豆油等；粘合劑如聚こ烯吡咯烷酮或羥丙基纖維素等；崩解劑如羧甲基纖維素鈉或低取代羥丙纖維素等；潤滑劑如硬脂酸鎂或滑石粉等；穩定劑如羧甲基纖維素鈉或環糊精等；防腐劑如對羥基苯甲酸こ酯或苯甲酸鈉等。另外，還可以在該藥物組合物中加入其他輔助劑如香味劑和/或甜味劑如蔗糖、果糖和天冬甜素等。該藥物組合物的活性成分是治療有效量的上述的本發明的提取物。該藥物組合物可采用醫學領域常規的方法，將所述的活性成分與藥學上可接受的載體制成各種劑型。用于ロ服時，可將其通過常規方法包括混合、制粒、干燥、裝膠囊或壓片或分裝成顆粒劑等制備成常規的固體制劑如片劑、膠囊、軟膠囊、液體制劑、顆粒劑、煎膏劑、丸剤、懸浮齊U、分散劑或糖漿劑等。本發明的中藥組合物較佳經ロ服途徑應用，安全有效。所述的中藥組合物的使用劑量根據患者的年齡和病情而定，常用的每日劑量約為O. OOOf 100g，優選O. 01 5(^,更優選O. I 20g,給藥次數一天一次或數次。本發明還提供前述中藥組合物的制備方法為按配方，將各成分均勻混合即可。本發明還提供前述的中藥提取物在制備預防或治療纖維化疾病的藥物中的用途。本發明中，所述的纖維化疾病一般包括心臟纖維化疾病、肺臟纖維化疾病、腎臟纖維化疾病或肝臟纖維化疾病等在內的具有纖維增生性特征的疾病。其中，所述的肺纖維化疾病通常由慢性阻塞性肺病(C0PD)、特發性肺纖維化或間質性肺炎等疾病引起或伴發。本發明中藥組合物能有效治療經典藥物性導致肺纖維化疾病模型(博來霉素模型)。其中，所述的心臟纖維化疾病通常由高血壓心臟病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(又稱冠心病)、擴張性心肌病、肥厚性心肌病、心律失常(特別是心房纖顫或室性心動過速)或慢性心衰等疾病引起或伴發。本發明中藥組合物能有效治療經典藥物性導致心臟纖維化疾病模型(阿霉素模型)。其中，所述的肝纖維化疾病(肝硬化)通常由病毒性肝炎、酒精性肝炎或脂肪肝等疾病引起或伴發。所述的病毒性肝炎通常是指甲肝、こ肝或丙肝。其中，所述的腎纖維化疾病包括終末期腎病(各種原因引起的腎衰)，通常由可導致腎衰的腎小管、腎小球等疾病引起或伴發。本發明中藥組合物能有效治療經典梗阻性腎病導致腎臟纖維化疾病模型(單側輸尿管結扎(UUO)模型)。在預防或治療纖維化疾病時，本發明的中藥組合物可以單獨使用或者與其他沒有拮抗作用的藥物聯合使用。本發明中，為方便表達及描述，在


及具體實施方式
中將本發明的中藥組合物以縮寫CFZ代替。本發明中，上述優選條件在符合本領域常識的基礎上可任意組合，即得本發明各較佳實例。本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。本發明的積極進步效果在于I、本發明的中藥組合物可以同時作用于多個靶點，降低單靶點藥物引起的副作用，各成分有協同作用藥效治療效果超過單組份藥效的總和。2、本發明中藥組合物在預防和逆轉肺纖維化的應用中，對于小鼠纖維化疾病，包括心臟纖維化疾病、肺臟纖維化疾病、腎臟纖維化疾病或肝臟纖維化疾病等在內的具有纖維增生性特征的疾病具有明顯的預防或治療效果；能顯著抑制博萊霉素引起的肺纖維化降低肺纖維化小鼠的死亡率，降低肺纖維化小鼠的肺重指數；降低肺纖維化小鼠肺組織羥脯氨酸、膠原的含量，并降低與肺纖維化相關的α -肌動蛋白(α -SM)的表達，減少肺纖維化小鼠肺泡灌洗液中多種炎性細胞的數量；增加肺臟中抑纖維化的Thl細胞因子的分泌，減少促纖維化的Th2細胞因子的分泌，調節纖維化肺臟的抑制性免疫微環境。3、本發明的中藥組合物在預防和逆轉阿霉素(DOX)所致擴心病心室異常重構及心肌組織纖維化的應用中，能顯著改善阿霉素所致擴心病心室異常重構及心肌組織纖維化；可以顯著抑制左心室舒張期前壁厚度、后壁厚度和室間隔厚度的減小，顯著抑制舒張期左室內徑的増加，顯著改善體現心臟收縮和舒張功能的各項指標，表現為心臟射血分數、左心室短軸縮短率、左心室收縮壓上升最大速率、左心室舒張壓下降最大速率増加，降低心肌中膠原的含量，并降低與纖維化相關的a -SMA的表達，抗心臟組織纖維化表現為與改變組織Thl/Th2免疫極化方向，增強抗組織纖維化因子的表達，抑制促組織纖維化因子表達關系密切。4、本發明的中藥組合物在預防和逆轉單側輸尿管結扎(UUO)誘導的腎纖維化病變的應用中，能夠減輕單側輸尿管結扎所誘導的小鼠腎纖維化，表現為減少腎組織的膠原沉積，上調上皮細胞特征性蛋白E-鈣粘素表達，減少活化的成纖維細胞標志性蛋白a -SMA表達。

圖I為預防性給予樣品藥物降低博萊霉素引起肺纖維化小鼠的死亡率隨時間變、化關系圖；其中，博來霉素造模后第7天開始給予中藥組合物或干擾素-Y，CFZ低為低劑量組(lg/kg/day)，CFZ中為中劑量組(2g/kg/day)，CFZ高為高劑量組(4g/kg/day)；##P<0. Olvs假手術組；*P〈0. 05vs模型組。圖2為預防性給予樣品藥物降低肺纖維化小鼠的肺臟膠原沉積Masson染色圖，及絕對膠原面積比較圖；其中，博來霉素造模后第7天開始給予中藥組合物或干擾素Y，CFZ低為低劑量組(lg/kg/day)，CFZ中為中劑量組(2g/kg/day)，CFZ高為高劑量組(4g/kg/day) ；###P<0. OOlvs 假手術組;*Ρ〈0· 05，_Ρ〈0· OOlvs 模型組。圖3為預防性給予樣品藥物對肺纖維化小鼠肺組織羥脯氨酸含量的影響圖；其中，博來霉素造模后第7天開始給予中藥組合物或干擾素Y ;CFZ低為低劑量組(lg/kg/day), CFZ中為中劑量組(2g/kg/day)，CFZ高為高劑量組(4g/kg/day) ；##P<0. Olvs假手術組;*Ρ〈0· 05，**Ρ〈0· Olvs 模型組。 圖4為預防性給予樣品藥物對小鼠肺組織α-SMA表達水平的影響圖；其中，博來霉素造模后第7天開始給予中藥組合物或干擾素Y，CFZ低為低劑量組(lg/kg/day)，CFZ中為中劑量組(2g/kg/day)，CFZ高為高劑量組(4g/kg/day) ；##P<0. Olvs假手術組，*P〈0. 05vs 模型組。圖5為預防性給予樣品藥物對肺纖維化小鼠的肺臟炎癥影響的HE染色圖，及炎癥對比圖；其中，博來霉素造模后第7天開始給予中藥組合物或干擾素Y，CFZ低為低劑量組(lg/kg/day)，CFZ中為中劑量組(2g/kg/day)，CFZ高為高劑量組(4g/kg/day)；###PくO. OOlvs 假手術組；**Ρ〈0· 01，***Ρ〈0· OOlvs 模型組。圖6為預防性給予樣品藥物對肺纖維化小鼠肺泡灌洗液中多種炎性細胞影響的數量對比圖；其中，博來霉素造模后第7天開始給予中藥組合物或干擾素Y，CFZ低為低劑量組(lg/kg/day)，CFZ中為中劑量組(2g/kg/day)，CFZ高為高劑量組(4g/kg/day)；##PくO. 01，###PくO. OOlvs 假手術組;*P〈0. 05vs 模型組。圖7為預防性給予樣品藥物對肺纖維化小鼠肺組織Thl、Th2細胞因子分泌的調節作用(ELISA)含量對比圖；其中，博來霉素造模后第7天開始給予中藥組合物或干擾素Y，CFZ低為低劑量組(lg/kg/day)，CFZ中為中劑量組(2g/kg/day)，CFZ高為高劑量組(4g/kg/day) ;##PくO. 01，###PくO. OOlvs 假手術組;*Ρ〈0· 05，**Ρ〈0· Olvs 模型組。圖8為治療性給予樣品藥物對博萊霉素引起肺纖維化小鼠的死亡率隨時間變化關系圖；其中，博來霉素造模后第14天開始給予中藥組合物或干擾素Y，CFZ中Af為中劑量治療組(2g/kg/day)，CFZ高Af為高劑量治療組(4g/kg/day) ；##P<0. Olvs假手術組；*P〈0. 05vs 模型組。圖9為治療性給予樣品藥物對肺纖維化小鼠作用的肺臟膠原沉積Masson染色圖，及絕對膠原面積比較圖；其中，博來霉素造模后第14天開始給予中藥組合物或干擾素Y，CFZ中Af為中劑量治療組(2g/kg/day)，CFZ高Af為高劑量治療組(4g/kg/day)；###PくO. OOlvs 假手術組，**Ρ〈0· 01，***Ρ〈0· OOlvs 模型組。圖10為治療性給予樣品藥物對肺纖維化小鼠肺組織羥脯氨酸含量的影響圖；其中，博來霉素造模后第14天開始給予中藥組合物或干擾素Y，CFZ中Af為中劑量治療組(2g/kg/day), CFZ 高 Af 為高劑量治療組(4g/kg/day) ;##PくO. Olvs 假手術組，**P〈0. Olvs模型組。
圖11為預防性給予樣品藥物對阿霉素所致擴心病小鼠心室擴張的影響圖，代表性心臟切片(圖A左)和超聲心動圖(圖A右)，左心室超聲心動圖參數(圖B、C、D和E)，左心室舒張期前壁厚度(LVAWd)、后壁厚度(LVPWd)、室間隔厚度(IVSd)及舒張期左室內徑(LVDd) ；#P<0. 05，##PくO. Olvs 正常組;*P〈0. 05vs 模型組。圖12為預防性給予樣品藥物對阿霉素致擴心病小鼠心功能的影響圖；CFZ對心臟射血分數(EF)、左心室短軸縮短率(FS)的影響(圖A和B)，CFZ對左心室收縮壓上升最大速率(+dP/dtmax)、左心室舒張壓下降最大速率(-dP/dtmax)、心率(HR)、平均動脈壓(MAP)等血流動力學指標的影響(圖C-F) ;#PくO. 05，##P<0. Olvs正常組;*P〈0. 05，*Ρ〈0· Olvs模型組。圖13為預防性給予樣品藥物對阿霉素致擴心病小鼠心臟組織纖維化影響圖；心肌組織切片HE染色(圖Α)，心肌組織切片Masson’ s染色分析心臟組織纖維化(圖B和D);免疫組化檢測a -SMA表達(圖C和Ε) ；##P<0. Olvs正常組，*P〈0. 05vs模型組。 圖14為預防性給予樣品藥物對阿霉素致擴心病小鼠心臟Thl/Th2平衡的影響圖；CFZ抑制轉化生長因子-β (TGF-β )表達(圖A和C)，CFZ促進干擾素Y表達(圖B和D);CFZ 增加干擾素 Y/轉化生長因子 β 比值(IFNi/TGF-β)(圖 Ε);##ρ〈0· 01，###ρ〈0· OOlvs正常組，**ρ〈0· 01, ***ρ〈0· OOlvs 模型組。圖15為預防性給予樣品藥物對阿霉素致擴心病小鼠心臟組織氧化應激反應影響圖；超氧化物歧化酶(SOD)檢測(圖Α)，丙ニ醛(MDA)檢測(圖B) ；##p<0. Olvs正常組，**ρ〈0· 05, ***ρ〈0· Olvs 模型組。圖16為預防性給予樣品藥物對單側輸尿管結扎致小鼠腎纖維化影響圖，腎組織切片Masson’s染色和a -SMA染色(圖Α)，腎小管損傷評分(圖B)，腎纖維化評分(圖C)，小鼠腎外觀(圖D)，a-SMA半定量評價(圖Ε)，蛋白質印跡檢測a-SMA表達(圖F) ;#ρ〈0. 05，##ρくO. 01，###ρくO. Olvs 假手術組，*ρ〈0· 05，**ρ〈0· 01，_ρ〈0· OOlvs 模型組。圖17為預防性給予樣品藥物對基質金屬蛋白酶(MMPs) /基質金屬蛋白酶抑制物(HMPs)平衡影響圖；代表性RT-PCR結果(圖Α)，前膠原I、a-SMA、基質金屬蛋白酶抑制物I (TIMPl)和基質金屬蛋白酶(ΜΜΡ2)的表達和分析(圖B-E), MMPs/TIMPs比值(圖F)；#pくO. 05，##pくO. 01，###PくO. OOlvs 假手術組;*p〈0. 05vs 模型。圖18為治療性給予樣品藥物對單側輸尿管結扎致小鼠腎纖維化影像圖(14天)，腎組織切片Masson’s染色圖(放大100倍，圖A，放大400倍，圖B)，腎組織切片以抗a -SMA抗體染色觀察激活的成肌纖維細胞(圖C)和以E-鈣粘素染色觀察腎上皮細胞(圖D)，CFZ減少腎膠原面積(圖Ε)，蛋白質印跡檢測a-SMA和E-鈣粘素表達(圖F) ;CFZ高為高劑量給藥組(4g/kg/day), CFZ 低為低劑量給藥組(lg/kg/day), ##pくO. 01, ###pくO. Olvs 假手術組;**ρ〈0· 01, ***ρ〈0· OOlvs 模型組。圖19為治療性給予樣品藥物對單側輸尿管結扎致小鼠腎纖維化影響圖(21天)，其中，腎組織切片Masson’ s染色(放大100倍，圖A，放大200倍，圖B)，CFZ減少腎膠原面積和膠原面積比值(圖C)，蛋白質印跡檢測a -SMA和E-鈣粘素表達(圖D) ；CFZ高為高劑量給藥組(4g/kg/day)，CFZ 低為低劑量給藥組(lg/kg/day);#ρ〈0· 05，###p<0. Olvs 假手術組;*ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01, ***ρ〈0· OOlvs 模型組。圖20為治療性給予樣品藥物對單側輸尿管結扎致腎纖維化小鼠腎功能影響圖；單側輸尿管結扎14天，結扎ー側腎和對側正常腎、脾重和體重分析(圖A-F);單側輸尿管結扎21天，結扎ー側腎和對側正常腎、脾重和體重分析(圖G-L)，腎功能以血清肌酐(圖D、E)和尿素氮(圖J、K)評價雨〈O. 01，###p<0. Olvs假手術組;*ρ〈0· 05，**ρ〈0· Olvs模型組。
具體實施例方式下面用實施例來進ー步說明本發明，但本發明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I配方黃苗1500g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)2000g,三七 500g, 靈芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. ) 1500g (質量比為 9 :12 :3 :9)。制備步驟(I)黑木耳提取物的制備黑木耳加10倍量水提取3次，每次提取I小時，合并提取液，濾過，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(2)黃芪、三七、靈芝分別粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(3)黑木耳提取物、黃芪、三七、靈芝混勻后，制粒，干燥，裝膠囊，即得。實施例2配方黃苗75Og,黑木耳(Auriculariaauricula (L. exHooke)2500g,三七75Og,靈芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. )Karst. ))IOOOg (質量比為 9 30 9 :12)。制備步驟(I)黑木耳提取物的制備黑木耳加6倍量95%こ醇水溶液提取2次，每次I. 5小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(2)黃芪、三七、靈芝分別粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(3)黑木耳提取物、黃芪、三七和靈芝混勻，制粒，干燥，壓片即得。實施例3配方黃苗1600g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)1200g,三七 400g,靈芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. )) 1600g (質量比為 8 :6 :2 :8)。制備步驟(I)黃芪提取物的制備黃芪加3倍量70%こ醇水溶液提取3次，每次3小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎成細粉，備用。(2)三七提取物的制備三七加5倍量60%こ醇水溶液提取3次，每次2小時，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(3)黑木耳、靈芝粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。( 4 )黃芪、三七提取物、黑木耳、靈芝混勻，制粒，干燥，分裝成顆粒劑，即得。實施例4配方黃苗1600g,黑木耳(Auricularia auricula (L. exHooke) 1600g,三七1200g,靈芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. )Karst. ))800g (質量比為 8 :8 :6 :4)。制備步驟(I)黃芪提取物的制備黃芪加5倍量水提取3次，每次提取2小時，合并提取液，濾過，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(2)黑木耳提取物的制備黑木耳加10倍量95%こ醇水溶液提取2次，每次3小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。
(3)三七、靈芝粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。( 4 )黃芪提取物、黑木耳提取物、三七、靈芝混勻，制粒，干燥，裝膠囊，即得。實施例5配方黃苗1200g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)3000g,三七 IOOg,靈芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. )) 900g (質量比為 12 3 I :9)。制備步驟(I)黃芪提取物的制備黃芪加3倍量70V/V%こ醇水溶液提取3次，每次3小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(2)黑木耳提取物的制備黑木耳加5倍量60v/v%こ醇水溶液提取3次，每次2小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(3)靈芝粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。( 4 )黃芪提取物、黑木耳提取物、三七、靈芝混勻，制粒，干燥，分裝成顆粒劑，即得。實施例6配方黃苗2500g,黑木耳(Auricularia auricula (L. exHooke)750g,三七 750g,靈芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. )) 750g (質量比為 10 3 3 :3)。制備步驟(I)黃芪提取物的制備黃芪加5倍量水提取3次，每次提取2小時，合并提取液，濾過，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(2)靈芝提取物的制備靈芝加10倍量95%こ醇水溶液提取2次，每次3小時，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(3)黑木耳、三七粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。( 4 )黃芪提取物、靈芝提取物、黑木耳、三七混勻，制粒，干燥，壓片，即得。實施例7配方黃苗3000g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)1200g,三七 IOOg,靈芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. )Karst. ))1200g (質量比為 30 12 I :12)。制備步驟(I)黃芪提取物的制備黃芪參加6倍量95%こ醇水溶液提取2次，每次I. 5小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(2)黑木耳、三七、靈芝分別粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(3)黃芪提取物、黑木耳、三七和靈芝混勻，制粒，干燥，壓片即得。實施例8配方黃苗2000g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)2000g,三七 200g,靈芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. )) 400g (質量比為 10 :10 :1 :2)。制備步驟(I)黑木耳提取物的制備黑木耳加10倍量水提取3次，每次提取I小時，合并提取液，濾過，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。
(2)黃芪、三七、靈芝分別粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(3)黑木耳提取物、黃芪、三七和靈芝混勻后，制粒，干燥，裝膠囊，即得。實施例9配方黃苗2400g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)1800g,三七 200g,靈芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. )) 1200g (質量比為 12 :9 :1 :6)。制備步驟(I)黃芪提取物的制備黃芪加3倍量70%こ醇水溶液提取3次，每次3小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。 (2)黑木耳提取物的制備黑木耳加5倍量60%こ醇水溶液提取3次，每次2小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(3)靈芝提取物的制備靈芝加10倍量95%こ醇水溶液提取2次，每次3小時，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(4)三七粉碎成細粉，備用。(5)黃芪提取物、黑木耳提取物、三七和靈芝提取物混勻，制粒，干燥，分裝成顆粒齊U，即得。實施例10配方黃苗1800g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)1800g,三七 200g,靈芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. )) 1200g (質量比為 9 :9 :1 :6)。制備步驟(I)黃芪提取物的制備黃芪加3倍量70%こ醇水溶液提取3次，每次3小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(2)黑木耳提取物的制備黑木耳加5倍量60%こ醇水溶液提取3次，每次2小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(3)三七、靈芝粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(4)黃芪提取物、黑木耳提取物、三七和靈芝細粉混勻，制粒，干燥，裝膠囊，即得。實施例11配方黃苗2400g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)1800g,三七 200g,冬蟲夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc) 1200g (質量比為 12 :9 :1 :6)。制備步驟(I)黃芪提取物的制備黃芪加3倍量70%こ醇水溶液提取3次，每次3小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(2)黑木耳提取物的制備黑木耳加5倍量60%こ醇水溶液提取3次，每次2小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(3)三七、冬蟲夏草粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(4)黃芪提取物、黑木耳提取物、三七和冬蟲夏草細粉混勻，制粒，干燥，分裝成顆粒劑，即得。實施例12配方黃苗2400g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)1800g,三七 200g,隱孔菌(Crytoporus volvatus (Peck.) Hubbara. ) 1200g (質量比為 12 :9 :1 :6)。
制備步驟(I)黃芪提取物的制備黃芪加3倍量70%こ醇水溶液提取3次，每次3小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(2)黑木耳提取物的制備黑木耳加5倍量60%こ醇水溶液提取3次，每次2小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(3)三七、隱孔菌粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(4)黃芪提取物、黑木耳提取物、三七和隱孔菌細粉混勻，制粒，干燥，分裝成顆粒 齊U，即得。實施例13配方黃苗2400g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)1800g,三七 200g,冬蟲夏草發酵培養物1200g (質量比為12 :9 :1 :6)。制備步驟(I)黃芪提取物的制備黃芪加3倍量70%こ醇水溶液提取3次，每次3小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(2)黑木耳提取物的制備黑木耳加5倍量60%こ醇水溶液提取3次，每次2小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(3)三七粉碎、過篩，得過40目篩的細粉，備用。(4)黃芪提取物、黑木耳提取物、三七和冬蟲夏草發酵培養物混勻，制粒，干燥，分裝成顆粒劑，即得。冬蟲夏草菌發酵培養物的制備中國冬蟲夏草無性代菌種蝙幅蛾被毛抱(Hiresutella hepiali Chen et Shen.(1985))(浙江賜富醫藥有限公司出售菌種)在液體培養基上發酵，獲得發酵上清液、菌絲體及各種代謝物。發酵方法為依次斜面菌種培養、搖瓶種子培養、ー級、ニ級種子罐培養、液體發酵罐中通氣培養，10 18°C，pH 6. 0 7· 5，分別培養50、10、6、6、10天。液體培養基(重量百分比，％)為蠶蛹粉2. 0，蛋白胨I. 5，玉米粉I. 8，蔗糖I. 6，磷酸ニ氫鉀O. 1，硫酸鎂O. 05，其余為水分，發酵過程中通入無菌空氣。發酵完畢后固液分離，得到菌絲體和發酵液，發酵液再進行膜分離(超濾膜，膜孔徑300)，收集膜截留液即得到富含有效成分的發酵濾液，發酵濾液濃縮后與菌絲體混合、勻漿、噴霧干燥，即得所述的冬蟲夏草發酵培養物。實施例14配方黃苗2400g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)1800g,三七 200g,隱孔菌發酵培養物1200g (質量比為12 :9 :1 :6)。制備步驟(I)黃芪提取物的制備黃芪加3倍量70%こ醇水溶液提取3次，每次3小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎成細粉，備用。(2)黑木耳提取物的制備黑木耳加5倍量60%こ醇水溶液提取3次，每次2小吋，濾過，合并濾液，濃縮干燥，粉碎成細粉，備用。(3)三七粉碎成細粉，備用。(4)黃芪提取物、黑木耳提取物、三七和隱孔菌發酵培養物混勻，制粒，干燥，分裝成顆粒劑，即得。隱孔菌發酵培養物的制備(I)菌種活化將4°C條件下保存的隱孔菌菌種(Crytoporus sinensis Sheng
H.Wu&M. Zang)(浙江賜富醫藥有限公司出售菌種)，通過無菌操作移植到培養基中，在真菌常規培養溫度下培養8天。培養基組分和重量百分含量為(％):葡萄糖O. 6，麥芽糖1.5，蛋白胨O. 1，酵母粉O. 8，KH2PO4 O. LMgSO4 · 7H20 O. 05，維生素 B1O. 07，瓊脂 2. 7，pH 4. 8，其余成分為水。(2)搖瓶培養將上述活化的隱孔菌菌絲移入內裝200mL下述培養液的500mL三角瓶中，在震蕩頻率為200epm、溫度為2(T30°C條件下在搖床中震蕩培養6天。培養液組分和質量(％)為葡萄糖O. 7，麥芽糖I. 6，蛋白胨O. 2，酵母粉1，KH2PO4 O. LMgSO4 · 7H20 O. 05，維生素 B1 O. I, pH 5.0，其余成分為水。(3)液體發酵培養在20L發酵罐中裝入14L的下述培養液，用壓差法移接相當于罐容量3%搖瓶培養的隱孔菌菌絲液，在通風量為1:0. Γ1. O (v/v/分鐘)、葉輪攪拌速度為200rpm、罐壓大于O. 05kg/cm2,溫度20 30°C條件下發酵10天。培養液組分和重量百分含量(％)為葡萄糖3.0，麥芽糖I. 8，玉米粉O. 3，蛋白胨
O.5，酵母粉 1，KH2PO4 O. 1，MgSO4 · 7H20 O. 05，維生素 B10. 05，pH 4. 5，其余成分為水。(4)將上述發酵罐內的隱孔菌發酵產物采用常規過濾方法過濾得到菌絲體和發酵上清液；隱孔菌菌絲體濾餅在8(T90°C條件下烘干，粉碎、過篩，得到顆粒小于60目的隱孔菌菌粉；發酵上清液7(T80°C旋轉蒸發濃縮至密度為I. 4克/毫升，再加熱濃縮至稠膏狀，加入上述所得菌粉，攪拌均勻，烘干、粉碎，過60目篩，即得所述隱孔菌發酵培養物。效果實施例I本發明的中藥組合物在預防或治療肺纖維化中的應用I、材料和方法I. I主要試劑本效果實施例所用的中藥組合物是上述實施例9所得的產品，縮寫為CFZ。實驗所用博萊霉素(BLM)購自日本化藥(日本化藥株式會社)，批號191140。實驗所用干擾素-Y(干擾素Y )購自上?？寺∩锔呒夹g有限公司，批號20090307。I. 2實驗動物實驗所用的SPF級C57BL/6小鼠(雄性，6 8周齡，16 18g)，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。I. 3肺纖維化動物模型制備雄性C57BL/6 (周齡6 8周)小鼠，隔夜禁食，戊巴比妥鈉(45mg/kg，i. p.)麻酔，氣管內注射博萊霉素(5U/kg)。具體方案如下以盡量小的創傷切開頸部皮膚，在彎頭眼科鑷的協助下，暴露氣管，使用微量進樣器穿刺氣管，向氣管內注入約50 μ I博萊霉素，迅速地旋轉并直立5分鐘，以便使博萊霉素均勻地進入左右肺葉。整個操作在約60°C左右的手術操作臺進行。假手術組(Sham)氣管內注射等量的注射用生理鹽水。I. 4實驗分組(I) CFZ預防肺纖維化為研究本發明的中藥組合物在預防肺纖維化的形成中的效果，將上述制備的動物模型在造模7天后分組給藥，分組和給藥情況如表I所示
表I肺纖維化動物模型在造模7天后分組給藥的情況
權利要求
1.一種預防或者治療纖維化疾病的中藥組合物，其特征在于配方包括原料A和/或原料A的提取物；所述的原料A的提取物為水或こ醇水溶液的提取物；其中，所述的原料A包括黃苗、黑木耳(Auricularia auricula (L. exHooke) Underw)、三七、以及靈芝B ;所述的靈芝 B 為赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex F r. ) Karst.)和 / 或紫芝(Ganodermasinense Zhao, Xu et Zhang；CAuricularia auricula (L. exHooke；Underw)、三七、以及靈芝B之間的重量比為9 30 9 30 Γ9 6 12。
2.如權利要求I所述的中藥組合物，其特征在于所述的黃苗、黑木耳(Auriculariaauricula (L. exHooke)Underw)、三七、以及靈芝B之間的重量比為12 9 1 6 ;所述的原料A在直接使用時，粉碎使用，使粒徑大小較佳的過40目篩。
3.如權利要求I所述的中藥組合物，其特征在于所述的原料A的提取物按下述方法制得將原料A用3 10重量倍數的水或3 10重量倍數的70v/v% 95v/v%こ醇水溶液回流提取2 3次，每次提取I 3小時，合并提取液，過濾，濃縮，干燥，粉碎即可。
4.如權利要求3所述的中藥組合物，其特征在于所述的原料A的提取物在制備時為將原料A中各原料分別制備提取物后混合，或者將各原料混合后再制備提取物； 當所述的原料A的提取物在制備時將原料A中各原料分別制備提取物后混合，黃芪的提取物的提取時間為1-2小時;黑木耳(Auricularia auricula (L. exHooke) Underw)的提取物的提取時間為I. 5 3小時；三七的提取物、以及靈芝B的提取物的提取時間分別為2^3小時。
5.如權利要求I所述的中藥組合物，其特征在于所述的中藥提取物還含有原料C和/或原料C的發酵培養物,所述的原料C為冬蟲夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc)和 / 或隱孔菌(Crytoporus volvatus (Peck. ) Hubbara.)。
6.如權利要求I所述的中藥組合物，其特征在于所述的靈芝B和/或靈芝B提取物被替代為原料C和/或原料C的發酵培養物,所述的原料C為冬蟲夏草(Cordyceps sinensis(Berk. ) Sacc)和 / 或隱孔菌(Crytoporus volvatus (Peck. ) Hubbara.)。
7.如權利要求5或6所述的中藥組合物,其特征在于所述的冬蟲夏草(Cordycepssinensis (Berk. ) Sacc)的發酵培養物為編幅蛾被毛抱(Hiresutella hepiali Chen etShen. (1985))的發酵培養物；所述的隱孔菌(Crytoporus volvatus (Peck. ) Hubbara.)的發酵培養物為中華隱孔菌(Crytoporus sinensis Sheng H. Wu&M. Zang)的發酵培養物。
8.如權利要求5或6所述的中藥組合物，其特征在于所述的原料C和/或原料C的發酵培養物的用量為重量份數3 20，較佳的為重量份數3 9。
9.如權利要求7所述的中藥組合物，其特征在于所述的原料C的發酵培養物由下述方法制得將原料C菌種接種至液體培養基中，之后進行通氣培養得發酵培養物，干燥即可；所述的原料C菌種為按經過ニ級或三級種子培養獲得的菌種。
10.如權利要求9所述的中藥組合物，其特征在于所述的ニ級種子培養為依次經過斜面菌種培養、搖瓶種子培養、ー級和ニ級種子罐培養；所述的三級級種子培養為依次經過斜面菌種培養、搖瓶種子培養、ー級、ニ級和三級種子罐培養； 當所述的原料C為冬蟲夏草時，所述的培養的條件為10°C 18°C、pH6. O 7. 5 ;所述的斜面菌種培養、搖瓶種子培養、ー級、ニ級和三級種子罐培養的培養時間分別為30 60天、10天、6天、6天、6天和6 12天；當所述的原料C為隱孔菌時，所述的培養的條件為20°C 30°C;所述的斜面菌種培養、搖瓶種子培養、ー級、ニ級和三級種子罐培養的培養時間分別為3 10天、6天、6天、6天、6天和I 10天。
11.如權利要求9所述的中藥組合物，其特征在于所述的液體培養基為重量百分比蠶蛹粉2. 0%，蛋白胨I. 5%，玉米粉I. 8%，蔗糖I. 6%，磷酸ニ氫鉀O. 1%，硫酸鎂O. 05%,其余為水分； 當所述的原料C為隱孔菌時，所述的液體培養基較佳的為重量百分含量葡萄糖O. 6%-3. 0%,麥芽糖 I. 5%-1. 8%,玉米粉 0-0. 3%，蛋白胨 O. 1%_0· 5%,酵母粉 O. 8%_1%，KH2PO4O. 1%，MgSO4 · 7H20 O. 05%,維生素 B1 O. 05%-0. 1%，瓊脂 0-2. 7%, pH 4. 5-5. 0，其余成分為水。
12.如權利要求f11任一項所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于按配方，將各成分均勻混合即可。
13.如權利要求f11任一項所述的中藥組合物在制備預防或治療纖維化疾病的藥物 中的用途。
14.如權利要求13所述的用途，其特征在于所述的纖維化疾病包括心臟纖維化疾病、肺臟纖維化疾病、腎臟纖維化疾病或肝臟纖維化疾病。
全文摘要
本發明公開一種預防或者治療纖維化疾病的中藥組合物及制備方法和用途。該中藥組合物配方包括原料A和/或原料A的提取物；所述的原料A的提取物為水或乙醇水溶液的提取物；其中，所述的原料A包括黃芪、黑木耳(Auricularia auricula(L.exHooke)Underw)、三七、以及靈芝B；所述的靈芝B為赤芝(Ganoderma Lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.)和/或紫芝(Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang)；所述的黃芪、黑木耳(Auricularia auricula(L.exHooke)Underw)、三七、以及靈芝B之間的重量比為9~30︰9~30︰1~9︰6~12。該制備方法為按配方將各成分均勻混合即可。該中藥組合物能夠有效預防或治療纖維化疾病。
文檔編號C12N1/14GK102716179SQ20121018366
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月5日 優先權日2012年6月5日
發明者嚴君, 何令帥, 崔冰, 胡卓偉, 陳黎 申請人:北京偉峰益民科技有限公司, 浙江賜富醫藥有限公司