專利名稱：整合質粒pOPHI及無抗性篩選標記的自主發(fā)光分枝桿菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及一種整合質粒pOPHI，以及一種無抗性篩選標記的自主發(fā)光分枝桿菌。
背景技術：
分枝桿菌屬(Mycobacterium)是一類細長略彎曲的微生物,有時有分枝或出現絲狀體。目前在分類學上已將分枝桿菌屬歸納于放線菌中。對人致病的放線菌可分含和不含分枝菌酸兩類。分枝桿菌屬于含分枝菌酸類。本屬細菌的主要特點是細胞壁含有大量脂質，主要是分枝菌酸。這和其染色性、生長特性、致病性、抵抗力等密切相關。一般不易著色，若經加溫或延長染色時間而著色后能 抵抗強脫色劑鹽酸乙醇的脫色，故又稱抗酸桿菌(acid-fast bacilli)。該菌屬無鞭毛、無芽胞、一般不產生內、外毒素，其致病性和菌體成分有關。引起的疾病都呈慢性，并伴有肉芽腫。分枝桿菌種類較多，主要可分為結核分枝桿菌復合群、非結核分枝桿菌和麻風分枝桿菌三類。結核分枝桿菌可發(fā)生形態(tài)、菌落、毒力、免疫原性和耐藥性等變異。卡介苗(BCG)就是Calmette和Guerin 2人(1908)將牛結核分枝桿菌在含甘油、膽汁、馬鈴薯的培養(yǎng)基中經13年230次傳代而獲得的減毒活疫苗株，現廣泛用于預防接種。根據菌落色素與生長速度可將非結核分枝桿菌分為4組。第IV組迅速生長菌。在25 45°C生長。生長快，培養(yǎng)5 7 d即可見到菌落，菌落粗糙，有的并能產色。恥垢分枝桿菌(M. smegmatis)即是其中一種。結核分枝桿菌(Mtb)是引起結核病的病原菌,可侵犯全身各器官,但以肺結核為最多見。結核病至今仍為重要的傳染病，全世界現在每年因結核病死亡約200萬人。結核分枝桿菌生長緩慢，難于對其進行遺傳操作，需要昂貴的帶負壓的3級生物安全實驗室，長時間培養(yǎng)不僅占用空間而且容易污染等等使結核分枝桿菌的研究耗時耗財耗力。以抗Mtb藥物的研發(fā)為例，抗Mtb藥物的研發(fā)昂貴且周期長。近半個世紀以來尚無一種新作用機制的藥物用于臨床治療。研究抗Mtb藥物最核心的難題之一就是缺乏有效，快速和廉價的模型，特別是體內模型。目前最常見的抗Mtb藥物體外篩選是利用表達熒光素酶[1]或綠色熒光蛋白(GFP:Green fluorescent protein) [2]的重組菌或利用染料阿爾瑪藍(alamar blue)可以區(qū)分活菌與死菌的特性[3]進行篩選。其中，表達細菌熒光素酶操縱子的重組菌因為不需要加入底物或進行誘導，自身即可實現發(fā)光，故稱之為自主發(fā)光菌。之前構建的自主發(fā)光的Mtb并發(fā)現利用該菌可簡單，快速，經濟地進行大規(guī)模抗Mtb藥物體外篩選和連續(xù)檢測藥物/疫苗在活體小鼠的效果。該發(fā)明可極大減少體外對藥物篩選、評價及對藥物和疫苗體內效果評價中所需的時間，精力，動物，花費等，特別是對抗Mtb藥物的研發(fā)可能具有變革意義。現有技術構建的自主發(fā)光的Mtb是通過電轉化人工構建的質粒，然后將自主發(fā)光元件框整合到Mtb基因組中從而使之發(fā)光。現有技術方案的實現方式現有技術方案主要是利用整合質粒PTYOKm。該質粒含有熒光素酶操縱子基因卡那霉素抗性基因、整合酶基因// 。:熒光素酶操縱子，該系列基因的表達使得宿主菌可以自主發(fā)光。整合酶基因可以表達出整合酶,將質粒整合進分枝桿菌的基因組中。將此質粒電轉化入Mtb菌中，使用卡那抗性篩選出陽性克隆，并檢測到發(fā)光，即獲得目標菌株。但該菌株由于含有卡那霉素抗性基因，在藥物篩選/評價中，可能存在交叉抗性。由于對分枝桿菌進行遺傳操作，僅有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因比較有效。因此，利用可自主發(fā)光分枝桿菌進行研究時，如果所用菌株具有抗性基因，這會對以后的遺傳操作帶來不便。例 如，基因敲除/遺傳互補一般至少需2種抗性基因；重組工程技術也需要至少2種抗性基因等

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種整合質粒pOPHI。本發(fā)明的另一個目的是提供一種無抗性篩選標記的自主發(fā)光分枝桿菌。本發(fā)明所采用的技術方案是
整合質粒pOPHI，其包括啟動子，發(fā)光所需酶基因(ΖμΩΜΜ)，整合酶基因(7/ )和抗性篩選基因的融合基因，位于融合基因兩端的同向重復序列仿了/ 和Di/I，以及噬菌體整合位點{attP、和復制子。所述啟動子為漢s/7仰啟動子。所述抗性篩選基因為潮霉素抗性基因(場叉)，其序列如SEQ ID NO:9所示。所述仿YTP和仿YI的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。所述復制子為大腸桿菌復制子ir印)。整合質粒pOPHI，其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。整合質粒pOPHI的構建方法，包括如下步驟
1)構建質粒pP:起始質粒pbluelnt用限制性內切酶AiI消化后，回收3. 6 kb片段，加入連接酶使其自身環(huán)化，得到3. 6 kb的質粒pP ；
2)構建質粒pOP:用限制性內切酶Kpnl和通ol消化質粒pP，得到3. 6 kb功能片段；用限制性內切酶Kpnl和ZAoI消化質粒pluxOK ;回收6. 3kb的功能片段Kpn I-Hsp60~luxCDABE-Xho I ;將上述2種功能片段進行連接，得到9. 9 kb的質粒pOP ；
3)構建質粒pU⑶is用限制性內切酶治7/ 1和歷'fldIII消化質粒pUC19，回收2. 6 kb的功能片段，將其與DifL (SEQ ID N0:2)、DifR (SEQ ID NO:3)進行三片段連接，得到2. 7kb的質粒ptXDis ；
4)構建質粒PU⑶I:將質粒pU⑶is用ZhI和Cleil消化，得到2. 7kb的功能片段A ；以質粒 pbluelnt 為模板，用引物 Int-f (SEQ ID NO:4)與引物 Int-rl (SEQ ID N0:5)擴增出I. 3kb的Int片段(SEQ ID NO:6)，片段Int經酶切C al和Clal切)后與功能片段A進行連接，得到4. O kb的質粒pUCDI ；
5)構建質粒PU⑶IH:質粒pU⑶I用油al消化，連入油al消化的 片段(SEQ IDNO:9)，得到 5. I kb 的質粒 pUCDIH ；
6)構建質粒pOPHI 用限制性內切酶通ο I消化質粒pOP，回收9. 8 kb的功能片段，用限制性內切酶通ol消化質粒pU⑶IH，得到2. 5 kb的功能片段將上述2個功能片段進行連接，得到12. 3 kb的質粒pOPHI。一種無抗性篩選標記的自主發(fā)光分枝桿菌，由以下方法制備得到
O電轉化法將權利要求I 6任一項所述的整合質粒pOPHI轉入分枝桿菌中，獲得自主發(fā)光分枝桿菌；
2)將獲得的自主發(fā)光分枝桿菌傳代培養(yǎng)篩選出抗性基因和整合酶基因均丟失的發(fā)光菌即為無抗性篩選標記的自主發(fā)光分枝桿菌。所述分枝桿菌包括恥垢分枝桿菌(Mycobac teri um. smegma tis),結核分枝桿 舊(Mycobacterium, iMercWo1Si1S),卡介苗(Mycobacterium, bovis海分枝桿菌{Mycobac teri um. aari/ 應),或布魯 _壞死分枝桿菌(IcoAacieritta ulcerans )等。步驟2)的具體操作為將步驟I)得到的發(fā)光菌挑取少量菌落到無抗性的7H9培育基中，搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)物稀釋后鋪板37°C培養(yǎng)，挑取多個單菌落同時劃線到無抗生素的7H11板和含潮霉素(Hyg)的7H11板上，37°C培養(yǎng)，挑取在Hyg板上未長出，而在相應的無抗板上長出的克隆到7H9培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再取培養(yǎng)物鋪于Hyg板上培養(yǎng)，若平板上無單克隆長出，則篩選所得相應克隆是正確的丟失Hyg抗性的克隆。本發(fā)明的有益效果在于
1)本發(fā)明制備得到的質粒pOPHI可轉入各種分枝桿菌中，從而得到可自主發(fā)光的分枝桿菌，可通過細菌的發(fā)光與否來判斷其死活，可用于多種實驗檢測，能快速得到可信的實驗數據；
2)本發(fā)明的無抗性篩選標記自主發(fā)光分枝桿菌可用于體外藥物活性檢測，不需要任何底物，可連續(xù)檢測同一樣品，1-3天便可以看出抑菌和殺菌活性，靈敏度高，重復性強。利用本發(fā)明的自主發(fā)光分枝桿菌，可以連續(xù)對感染的小鼠進行活體、動態(tài)、無創(chuàng)體內藥物檢測和評價，不僅利用動物少，而且更具有統(tǒng)計學意義。該方法還具有簡便易行可以進行大規(guī)模體內篩選等優(yōu)點，檢測一只小鼠僅需3秒時間，一個人一天可以麻醉并檢測500只以上的小鼠。如果對所用檢測儀進行改進，甚至無需麻醉小鼠即可進行活體檢測。我們用該菌株對作用機制不同的7種抗Mtb藥進行體內活性檢測，發(fā)現給藥后I到2天即可判斷其有無體內藥物活性，3到4天即可以判斷該藥是具有抑菌還是殺菌活性。所需化合物量少；
3)相對于現有的具有抗性標記的自主發(fā)光分枝桿菌，本發(fā)明的自主發(fā)光分枝桿菌因為沒有抗性基因，所以更加更加適用于大規(guī)模操作(抗性基因的表達可能對菌的生長，對藥物的敏感性等有一定的影響)。


圖I質粒pP、pOP的構建流程 圖2質粒pU⑶IH構建流程 圖3質粒pOPHI構建流程 圖4質粒pNBVl酶切圖譜；
圖5質粒pOPHI的酶切圖譜；圖6發(fā)光菌形態(tài) 圖7將轉化后所獲得的發(fā)光菌進行傳代的示意 圖8將傳代后的發(fā)光菌分別涂布含Hyg平板和無抗生素平板示意 圖9進一步驗證篩選獲得的發(fā)光菌株抗性已丟失。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。以下實施例中所采用的分子生物學實驗技術包括PCR擴增、質粒提取、質粒轉化、DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等都采用常規(guī)的方法，具體可參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黃培堂等譯，2002,北京科學出版社)。 以下實施例中PCR反應所用的pfu酶、dNTP以及相關試劑均購買自上海生工生物有限公司；抗生素潮霉素購自羅氏公司；大腸桿菌感受態(tài)DH5a購買于廣州東盛生物科技有限公司，貨號為C1042 ;DNA連接反應均采用Takara寶生物公司的T4 DNA連接試劑盒，型號D6020A ;質粒DNA提取試劑盒(BSCOIMl )、DNA回收試劑盒(BSC02M1)、PCR純化試劑盒(BSC03M1)購自博日生物公司。實施例I
構建整合質粒pOPHI，構建流程見圖I 3，質粒pOPHI的圖譜見圖5。如圖5所示，質粒pOPHI含有分枝桿菌強啟動子0 / 仰)，發(fā)光所需酶基因UuxCDABE、，整合酶基因ilnt)和潮霉素抗性基因(Myg)的融合基因，位于融合基因兩端的同向重復序列DifR和DiH菌體整合位點(^的，以及氨芐青霉素抗性基因(如/ττ)和復制子(Tfe/7)。各元件的功能如下
Z&/7份？ 一種分枝桿菌強啟動子，可以啟動后續(xù)基因的強表達。LuxCDABE :發(fā)光所需酶基因，該基因的表達使得宿主菌可以自主發(fā)光[5]。整合酶基因:可以表達出整合酶，將質粒整合進分枝桿菌的基因組中。整合酶的作用是可逆的，即它既可以將含有的序列的質粒整合到基因組立點，也可以再將其解離下來。因此，在最終的目標菌中如不含有該基因，不會起到解離作用，則構建的菌株可能更穩(wěn)定。潮霉素抗性基因(Myg)潮霉素抗性基因(Myg、是一種選擇標記，用于篩選獲得目的菌株。潮霉素抗性基因(Myg)在分枝桿菌和大腸桿菌中表達后，可使宿主獲得對潮霉素(hygromycin,縮寫為Hyg)的抗性，即可在含有Hyg的培養(yǎng)基中生長。潮霉素是一種常用的抗性篩選藥物，用于分枝桿菌的Hyg濃度為50ug/mL,用于大腸桿菌的Hyg濃度為200ug/
mLo同向重復序列 /i/:該序列可以被分枝桿菌自身的一種解離酶識別，并高效切除，因而可以在后續(xù)操作中去掉潮霉素抗性基因和整合酶基因。噬菌體整合位點{attP、:整合酶獲得表達后，可通過結合此位點將整個質粒整合進分枝桿菌的基因組中的位點。即此位點的主要作用是被整合酶結合，起整合到基因組的作用。氨芐青霉素抗性基因(辦 /TT):是一種篩選標記，但只在大腸桿菌等細菌中起作用，在分枝桿菌中無作用，因為分枝桿菌對氨芐青霉素天然耐藥。復制子0 ):負責質粒在大腸桿菌中復制的元件。質粒pOPHI的具體構建方法如下
I、質粒PP的構建
起始質粒pbluelnt(由美國約翰霍普金斯大學,Eric Nuermberger教授惠贈,其質粒圖譜見圖1，具體構建方法見參考文獻4 )用限制性內切酶AiI消化后，去掉功能片段hi，使之成為殘存的無功能的Int，,回收3. 6 kb的片段，加入連接酶使其自身環(huán)化，得到3. 6kb的質粒pP (見圖1)，轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5ci，利用含氨芐青霉素抗性的LB固體平板篩選出陽性克隆，挑取單克隆到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，提取質粒，用限制性內切酶AiI酶切鑒定質粒pP，正確的質粒卩？可切下3.6 kb左右的單一條帶。2、質粒pOP的構建
用限制性內切酶和通Ol消化質粒pP，凝膠回收試劑盒回收3. 6kb的功能片段；用限制性內切酶治和％01消化質粒pluxOK(由美國約翰霍普金斯大學,Eric Nuermberger教授惠贈，其質粒圖譜見圖1，具體構建方法見參考文獻4 )，回收6.3 kb的功能片段Kpn I -Hsp60~l uxCDABE-Xho I ;將上述2種功能片段進行連接，得到9. 9 kb的質粒pOP(見圖1)，轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5ci，利用含氨芐青霉素抗性的LB固體平板篩選出陽性克隆，挑取單克隆到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，提取質粒，用限制性內切酶廣ZAoI酶切鑒定質粒pOP,正確的質粒pOP可切下3. 6kb和6. 3 kb兩個條帶。3、質粒ptXDis的構建
1)用限制性內切酶治和歷‘/7(1111消化質粒PUC19，回收2.6kb的功能片段；
2)由上海捷瑞生物工程有限公司合成覓/1(SEQ ID NO: 2)和仿YTP (SEQ ID NO: 3)片段，合成的兩端帶有HindIII和XbaI酶切位點，仿YTP兩端帶有XbaI和KpnI酶切位占.
3)將pUC19酶切后的2. 6kb功能片段和片段進行三片段連接，得到2. 7kb的質粒PUCDis (見圖2)，然后轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α，利用含氨芐青霉素抗性的LB固體平板篩選出陽性克隆，用限制性內切酶&0RI酶切鑒定質粒pUCDis，正確的質粒可切下
2.7kb左右的單一條帶。4、構建質粒 ptXDI
1)將質粒PU⑶is用ZhI和Cleil消化，得到2.7kb的功能片段；
2)以質粒pbluelnt 為模板，用引物 Int-f (SEQ ID N0:4)與引物 Int-rl (SEQ IDNO: 5)擴增出 I. 3kb 的 (SEQ ID NO:6)片段；
3)片段Int經油al和Clal酶切后與pTCDis酶切后得到的2.7kb功能片段進行連接反應，得到4. Okb的質粒pUCDI (見圖2)。轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α，利用含氨芐青霉素抗性的LB固體平板篩選出陽性克隆，用限制性內切酶油al和CZaI酶切鑒定質粒pUCDI，正確的質粒pU⑶I可切下2. 7kb和I. 3kb兩個條帶。5、構建質粒 pUCDIH
I)以質粒pNBVl (由美國約翰霍普金斯大學William Bishai實驗室惠贈，質粒圖譜見圖4，具體構建方法見參考文獻6)為模板，以引物hyg-f (SEQ ID NO: 7)和hyg_r (SEQ IDNO:8)擴增獲得 片段，將該 片段送上海捷瑞生物工程有限公司進行突變，將片段中僅有的一個酶切位點(GGTACC)突變?yōu)镚GTACA ;將片段中僅有的I個&0RI酶切位點(GAATTC)突變?yōu)镚AATTA，從而去掉了內部的命/71和及位點，最后序列見SEQ ID N0:9,序列首尾均為及《1酶切位點。2)質粒pUCDI用油al消化，回收約4. O kb的片段， 片段(SEQ ID N0:9)用油al消化，回收約I. I kb的片段，將上述兩個片段進行連接，得到5. Ikb的質粒pU⑶IH(見圖2)，轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5ci，利用含Hyg抗性的LB固體平板篩選出陽性克隆，擴大培養(yǎng)，提取質粒，用限制性內切酶油a I酶切鑒定質粒PU⑶IH，正確的質粒pU⑶IH可切下
4.Okb和I. Ikb兩個條帶。6、質粒pOPHI的構建
1)用限制性內切酶通ol消化質粒pOP，回收約9.8 kb的載體片段；2)用限制性內切酶沿ol消化質粒pUCDIH，回收2.5 kb的片段DifL-Int-Hyg-DifR ；
3)將上述兩個片段進行連接，得到12.3kb的質粒pOPHI (見圖3)，轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α，利用含Hyg抗性的LB固體平板篩選出陽性克隆，挑取單克隆到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，提取質粒，酶切鑒定出正確的克隆即為質粒pOPHI。用限制性內切酶通ο 酶切鑒定質粒pOPHI，正確的質粒pOPHI可切下9. 8 kb和2. 5kb兩個條帶。實施例2
一種無抗性篩選標記的自主發(fā)光分枝桿菌的制備方法
本實施例涉及的7H9培養(yǎng)基、7H11培養(yǎng)基、吐溫80均購自廣州華奇盛生物公司。Biorad 電轉化儀(Biorad GenePulser Xcell)以及電轉杯購自 Biorad 公司。I.需要準備的材料
I)恥垢分枝桿菌(Mycobacterium.),可從中國普通微生物菌種保藏管理中
心獲得，編號為I. 2621。2) 10% 甘油+0.05% Tween 80 [20ml 甘油+180 毫升水+IOOul Tween 80，并用0.2Mm濾器過濾。要求新鮮配制，不得超過I周。3)滅菌的玻璃珠,50ml離心管，Biorad的O. 2cm的電轉杯,25 ml移液管。4)50ml長好的對數期的菌液[菌液的OD值，達到O. 6-1. 3]。帶濾芯的Iml槍尖。2.電轉化
I)將待轉菌(恥垢分枝桿菌,妙〃0如<^6 /^應.接種至含有50 mL 7H9 (含O. 1% tween 80)的液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37°C搖菌擴增。凍存甘油菌需要先加到含有5ml培養(yǎng)基的50ml離心管復壯，待長起之后，需取>2ml，接種到含有50 mL 7H9 (含O. 1% tween 80)的液體培養(yǎng)基的錐形瓶中；
菌落需刮取上百個菌落加入含有50 mL 7H9(含O. 1% tween 80)的液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，同時錐形瓶中需加入10顆左右的玻璃珠；
普通生長的或在4°C保存的菌，接種時可以取I至5ml加入含有50 mL 7H9 (含0. 1%tween 80)的液體培養(yǎng)基的錐形瓶中。2)檢測菌液的OD值，若達到0.6-1. 3，則可進行電轉化。3)將40ml菌液轉至50 mL離心管中，加入1(Γ13顆玻璃珠后，于渦旋器中充分渦旋5分鐘后[目的是將菌團塊打散]，于4°C離心機中6000 rpm離心8分鐘。4)加入40mL 10%甘油，于渦旋器中充分洗滌細菌后，于4°C離心機中6000 rpm離心8分鐘。5)重復步驟4) 2次后，留約I mL上清，用帶濾芯的槍尖，吹吸充分混勻后于冰上放置。6)于標記好的O. 2cm的電轉杯中，分別加入10 μ 濃縮后的質粒pOPHI和200 μ 分枝桿菌感受態(tài)細胞。輕柔吹吸充分混勻后于冰上放置10分鐘，加入電轉儀前擦盡電轉杯上的水分。7)用Biorad電轉化儀進行電轉化，以電壓2. 5KV、電阻1000 Ω、電容25PF脈沖波進行電轉化。未加DNA的細菌陰性對照的脈沖時間應于If 21秒間，該時間范圍顯示待轉細菌處于良好狀態(tài)。若感受態(tài)細胞洗得不干凈或質粒含鹽較多，會發(fā)生爆炸。8)迅速用帶濾芯的槍尖于電轉液中加入2 mL 7H9(含吐溫80)培養(yǎng)基(先用I mL轉移電轉液，再用I mL洗漆電轉杯)，轉移至50mL離心管中。
·
9)于37度孵箱中孵育4 12小時，充分復活細菌并使其抗性表達。10)用帶濾芯的槍尖吹吸混勻后，lml/1. 5ml tube分裝,10000 rpm離心I分鐘沉淀轉化菌，棄上清，用O. 6 mL 7H9培養(yǎng)基重懸后，以500 PL/板鋪于含抗生素[50ug/mlHyg]的7H11培養(yǎng)板中。同時稀釋一百倍后，500 PL/板鋪Hyg板。11)避光于37°C孵箱培養(yǎng)。備注待轉菌為恥垢分枝桿菌時，所用到的試劑及耗材均需于4°C預冷，電轉全過程需冰浴中完成。培養(yǎng)恥垢分枝桿菌的7H9 /7H11可以加放線菌酮，羧芐青霉素，濃度均為 50ug/mL。上述操作中的待轉菌除了可用恥垢分枝桿菌(Mycobacterium, smegma tis)夕卜，還可選用其它的分枝桿菌如結核分枝桿菌(Mycobac teri um. tuberculosi s ),卡介苗(Mycobac teri um. bovis 皮7( ),海分枝桿菌布魯 _ 壞死分枝桿菌(.Mycobac teri um. ulcerans )等等。3、檢測平板上生長出的單克隆菌落發(fā)光值的大小
I)將Hyg板上生長的單個菌，挑取到含有IOOuL 7H9培養(yǎng)基的I. 5mL離心管中，混勻后，將離心管放入發(fā)光檢測儀器(普洛麥格公司的GL0MAX2020)，檢測發(fā)光值大小。根據經驗，一般發(fā)光值在100以下的可認定為不發(fā)光，發(fā)光值在IO5或更高的可認定為發(fā)光很強。2)對于發(fā)光很強的單個菌落，在暗室中，憑肉眼可以看到明顯的藍色熒光(見圖6)。4、選取發(fā)光值在IO5或更高的單克隆進行傳代，篩選出抗性基因和整合酶基因均丟失的發(fā)光菌即為目標菌株。具體篩選方法如下(圖7 9):
I)連續(xù)傳代搖菌培養(yǎng)
從平板上，挑取發(fā)光值在IO5或更高的單克隆接種到5mL7H9培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)約2天。將培養(yǎng)所得的菌液適當稀釋后，進行鋪板，以每個平板上長出5 50個菌落為宜。平板37°C培養(yǎng)3天后觀察，挑取100-200個單菌落同時劃線到無抗生素的7H11板和含50ug/mL Hyg的7H11板，并對應編號；
放置37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天左右，可觀察在Hyg板上是否有未長出的克隆，而在相應的無抗板上長出，挑取相應的克隆到5mL 7H9培養(yǎng)基中培養(yǎng)約2天，取500微升培養(yǎng)物鋪于Hyg板(50ug/mL)，培養(yǎng)2 3天，若平板上無單克長出，則篩選所得相應克隆是正確的丟失Hyg抗性的克隆，即丟失潮霉素抗性基因(辦^)和整合酶基因的克隆(圖8、圖9)。利用上述制備得到的菌株進行體外藥物活性檢測，不需要任何底物，可連續(xù)檢測同一樣品，1-3天便可以看出抑菌和殺菌活性，靈敏度高，重復性強。利用自主發(fā)光分枝桿菌，可以連續(xù)對感染的小鼠進行活體、動態(tài)、無創(chuàng)體內藥物檢測和評價，不僅利用動物少，而且更具有統(tǒng)計學意義。該方法還具有簡便易行可以進行大規(guī)模體內篩選等優(yōu)點，檢測一只小鼠僅需3秒時間，一個人一天可以麻醉并檢測500只以上的小鼠。如果對所用檢測儀進行改進，甚至無需麻醉小鼠即可進行活體檢測。我們用該菌株對作用機制不同的7種抗Mtb藥進行體內活性檢測，發(fā)現給藥后I到2天即可判斷其有無體內藥物活性，3到4天即可以判斷該藥是具有抑菌還是殺菌活性。所需化合物量少。

參考文獻
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權利要求
1.整合質粒pOPHI，其包括啟動子，發(fā)光所需酶基因(ΖμΩΜΜ)，整合酶基因(Τ/7 )和抗性篩選基因的融合基因，位于融合基因兩端的同向重復序列仿了/ 和Di/I，以及噬菌體整合位點{attP、和復制子。
2.根據權利要求I所述的整合質粒pOPHI，其特征在于，所述啟動子為/&/7抑啟動子。
3.根據權利要求I所述的整合質粒pOPHI，其特征在于，所述抗性篩選基因為潮霉素抗性基因(場叉)，其序列如SEQ ID N0:9所示。
4.根據權利要求I所述的整合質粒pOPHI,其特征在于,所述/7//7P和Di/I的序列如SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3 所示。
5.根據權利要求I所述的整合質粒pOPHI，其特征在于，所述復制子為大腸桿菌復制子(.rep) ο
6.根據權利要求I所述的整合質粒pOPHI，其核苷酸序列如SEQID NO: I所示。
7.整合質粒pOPHI的構建方法，包括如下步驟 1)構建質粒pP:起始質粒pbluelnt用限制性內切酶I消化后，回收3.6 kb片段，加入連接酶使其自身環(huán)化，得到3. 6 kb的質粒pP ； 2)構建質粒pOP:用限制性內切酶Kpnl和通ol消化質粒pP，得到3. 6 kb功能片段；用限制性內切酶Kpnl和ZAoI消化質粒pluxOK ;回收6. 3kb的功能片段KpnI-Hsp60~luxCDABE-XhoI ;將上述2種功能片段進行連接，得到9. 9 kb的質粒pOP ； 3)構建質粒pU⑶is用限制性內切酶治7/ 1和歷'fldIII消化質粒pUC19，回收2. 6 kb的功能片段，將其與DifL (SEQ ID N0:2)、DifR (SEQ ID NO:3)進行三片段連接，得到2. 7kb的質粒ptXDis ； 4)構建質粒PU⑶I:將質粒pU⑶is用ZhI和Cleil消化，得到2. 7kb的功能片段A ；以質粒 pbluelnt 為模板，用引物 Int-f (SEQ ID NO:4)與引物 Int-rl (SEQ ID N0:5)擴增出I. 3kb的Int片段(SEQ ID NO:6)，片段Int經酶切C al和Clal切)后與功能片段A進行連接，得到4. O kb的質粒pUCDI ； 5)構建質粒PU⑶IH:質粒pU⑶I用油al消化，連入油al消化的場^ 片段(SEQ IDNO:9)，得到 5. I kb 的質粒 pUCDIH ； 6)構建質粒pOPHI用限制性內切酶通ο I消化質粒pOP，回收9. 8 kb的功能片段，用限制性內切酶通ο I消化質粒pU⑶IH，得到2. 5 kb的功能片段將上述2個功能片段進行連接，得到12. 3 kb的質粒pOPHI。
8.一種無抗性篩選標記的自主發(fā)光分枝桿菌，由以下方法制備得到 O電轉化法將權利要求I 6任一項所述的整合質粒pOPHI轉入分枝桿菌中，獲得自主發(fā)光分枝桿菌； 2)將獲得的自主發(fā)光分枝桿菌傳代培養(yǎng)篩選出抗性基因和整合酶基因均丟失的發(fā)光菌即為無抗性篩選標記的自主發(fā)光分枝桿菌。
9.根據權利要求8的制備方法，其特征在于，所述分枝桿菌包括恥垢分枝桿菌(Mycobacterium. smegmatis), €t亥If 胃(Mycobacterium. tuberculosis), ^(Mycobacterium. bovis 皮7( ),海分枝桿菌或布魯_壞死分枝桿菌 iMycobac teri um. ulcerans )。
10.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟2)的具體操作為將步驟I)得到的發(fā)光菌挑取少量菌落到無抗性的7H9培育基中，搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)物稀釋后鋪板37°C培養(yǎng)，挑取多個單菌落同時劃線到無抗生素的7H11板和含潮霉素(Hyg)的7H11板上，37°C培養(yǎng)，挑取在Hyg板上未長出，而在相應的無抗板上長出的克隆到7H9培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再取培養(yǎng)物鋪于Hyg板上培養(yǎng)，若平板上無單克隆長出，則篩選 所得相應克隆是正確的丟失Hyg抗性的克隆。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種整合質粒pOPHI及無抗性篩選標記的自主發(fā)光分枝桿菌，所述整合質粒pOPHI包括啟動子，發(fā)光所需酶基因(LuxCDABE)，整合酶基因(Int)和抗性篩選基因的融合基因，位于融合基因兩端的同向重復序列DifR和DifL，以及噬菌體整合位點(attP)和復制子。整合質粒pOPHI轉入分枝桿菌后，經過傳代培養(yǎng)篩選出抗性基因和整合酶基因均丟失的發(fā)光菌即為無抗性篩選標記的自主發(fā)光分枝桿菌。構建得到的無抗性篩選標記的自主發(fā)光分枝桿菌可通過細菌的發(fā)光與否來判斷其死活，可用于多種實驗檢測，能快速得到可信的實驗數據。
文檔編號C12N15/66GK102719471SQ20121018300
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月5日 優(yōu)先權日2012年6月5日
發(fā)明者張?zhí)煊?申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院