專利名稱：耐多藥結核分枝桿菌非熒光dna微陣列檢測方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術檢測領域，具體涉及一種耐多藥結核分枝桿菌檢測方法及試劑盒，尤其涉及利福平和異煙肼耐藥基因突變的DNA微陣列雜交檢測方法及利用該方法制成的試劑盒。
背景技術：
結核病是當今全球范圍內對人類最具威脅的傳染性疾病之一，20世紀80年代中期以來在全球出現回升趨勢。據世界衛生組織報道，我國是全球22個結核病高負擔國家之一，活動性肺結核病人數居世界第二位。目前我國全年齡組結核菌感染率為44. 5%，全國約
5.5億人受到了結核菌感染，感染率高于全球人口 1/3感染率的水平。同時，近年來，由于抗結核藥物的不規范治療,患者體內的結核菌對多種抗結核藥物發生耐藥，從而形成耐多藥結核病，耐藥結核病問題日趨嚴重成為結核病控制的難題之一。世界衛生組織2008年I月的調查報告顯示，全球范圍耐多藥(NDR-TB)結核病的發病率已達到創紀錄水平，全球114個國家和地區的結核病新發病例耐藥率達到17. 0%，多重耐藥率達到2. 9%。全年新發結核病例940萬，死亡病例180萬。同年估計有44萬耐多藥結核病例，15萬例耐多藥結核病死亡。中國是俄羅斯以外結核病耐藥最嚴重的國家，衛生部2007 2008年全國結核病耐藥基線調查顯示，中國肺結核患者耐多藥率為8. 32%，廣泛耐藥率為O. 68%。因此，結核病的快速診斷和最佳個體化治療方案的建立仍然是結核控制中的重要挑戰之一。由于結核分枝桿菌生長緩慢，如今廣泛應用的耐藥測定方法均是建立在菌株的基礎上，雖然使用了新的液體培養基，但仍然耗時較長，推遲了獲得菌株敏感型的時間。在現階段，我國各醫院廣泛采用痰培養加藥物敏感性實驗來檢測結核桿菌的耐藥性，即先培養出結核桿菌，再給予抗結核藥物，并觀察藥物抑菌效果。該法的檢測結果可靠，但最大不足之處是培養條件要求高,結核桿菌生長緩慢,往往需要6-8周；同時痰培養檢出率低，僅為30%，故藥敏試驗的檢出率也僅有30%左右，不能滿足臨床檢測需要。隨著基因診斷技術的不斷發展，DNA序列測定(DNA sequenc ing )、PCR-單鏈構象多態性分析(PCR- SSCP)、PCR-限制性片段長度多態性分析(RFLP)、RNA /RNA錯配試驗(RNA /RNA )、異源雙鏈構象(HDF)、多重連接依賴的探針擴增(M LPA)等分子生物學方法引入結核分支桿菌耐藥性的診斷，相對于傳統的檢測方法檢測時間短，但這些方法仍存在諸如儀器與成本上的局限性，不適合推廣應用。于是，開發一種操作簡單，成本低廉的快速準確診斷耐多要結核病的檢測方法，對于早期發現、阻斷耐藥結核病的傳播，規范指導用藥，提高耐藥結核病的治愈率具有非常重要的意義。臨床診斷要求檢測方法具有簡單、快速、重復性好、高通量和低成本的特點。目前已有的以纖維膜為固相支持物的反向斑點膜雜交技術途徑通常采用人工點樣、肉眼檢測雜交結果的操作方式,不利于檢測試驗的均質控制。DNA微陣列(DNA microarray)又稱DNA陣列或DNA芯片，是一塊帶有DNA微陣列(micorarray)涂層的特殊玻璃片。在經過特殊處理的玻璃基片上通過點樣、原位合成等方法有序固定多條DNA序列，經由一次測驗，即可提供大量序列信息，具有操作簡單、快速、精確、低成本的特點，在臨床診斷中已被廣泛應用于人類基因SNP、等位基因及多種微生物病原體DNA的檢測。根據基因突變、SNP等位點特異性，針對目的基因片段設計帶有特殊標記的探針序列，在待檢測位點存在一個堿基的差異。在芯片雜交過程中一個堿基的不同即可引起Tm值的大幅降低，從而使正常堿基配對探針顯示陽性結果，而錯配探針既成為陰性結果。基于以上技術背景，本發明將基于PCR的DNA微陣列雜交技術成功引入到結核分枝桿菌耐藥基因檢測的領域中。
利福平是抗結核聯合化療中主要的一線藥物。正常情況下，利福平(RFP)與RNA聚合酶β亞基(rpoB )特異性結合，阻斷RNA的合成而起到抑制細菌生長的作用。rpoB基因在利福平的藥物選擇壓力下發生突變而改變所編碼的rpoB亞基構象，從而降低與利福平的親和力。突變一般集中在rpoB基因的507 533位的27個氨基酸密碼子，長度81bp的利福平耐藥決定區(RRDR)內。異煙肼是結核病臨床治療方案中5種一線藥物中關鍵的一種，也是最容易出現耐藥性的抗結核藥物。研究表明，異煙肼耐藥主要與編碼過氧化氫酶-過氧化物酶的katG基因以及編碼還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性烯酰基載體蛋白還原酶的inhA基因的啟動子基因突變相關。其中突變頻率最高的是katG 315位點以及inhA -15位點。

發明內容
本發明的目的是提供一種基于PCR擴增的結核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥相關基因突變的DNA微陣列檢測方法及檢測試劑盒。本發明提出的基于PCR擴增的快速檢測結核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥相關基因突變的非熒光DNA微陣列檢測方法，擴增3個結核耐藥相關基因相應DNA序列的PCR體系和同時檢測所述耐藥相關基因相應點突變的DNA微陣列雜交體系；
所述的3個結核分枝桿菌耐藥相關基因是rpoB、inhA和katG基因，所述基因區域中的突變包括rpoB基因511、516、526、531、533位點，katG基因315位點和inhA基因-15位點；具體步驟如下
(1)設計針對3個基因的3對特異性擴增引物，應用dUTP-UNG酶系統，采用PCR擴增體系進行擴增，得到相應3個基因目的DNA ；
(2)采用DNA微陣列雜交體系檢測結核分枝桿菌rpoB、inhA和katG基因突變情況； 其中，反向擴增引物5 ‘端作生物素標記，引物序列及其擴增產物包含的突變位點如表
I所示
表I引物序列及擴增產物信息
權利要求
1.一種基于PCR擴增的快速檢測結核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥相關基因突變的非熒光DNA微陣列檢測方法，其特征在于擴增3個結核耐藥相關基因相應DNA序列的PCR體系和同時檢測所述耐藥相關基因相應點突變的DNA微陣列雜交體系； 所述的3個結核分枝桿菌耐藥相關基因是rpoB、inhA和katG基因，所述基因區域中的突變包括rpoB基因511、516、526、531、533位點，katG基因315位點和inhA基因-15位點；具體步驟如下 (1)設計針對3個基因的3對特異性擴增引物，應用dUTP-UNG酶系統，采用PCR擴增體系進行擴增，得到相應3個基因目的DNA ； (2)采用DNA微陣列雜交體系檢測結核分枝桿菌rpoB、inhA和katG基因突變情況； 其中，反向擴增引物5’端作生物素標記，引物序列及其擴增產物包含的突變位點如表I所示 表I引物序列及擴增產物信息
2.權利要求I所述的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增體系及反應條件如下表2 PCR擴增體系:__
(1)3對擴增引物SEQ ID NO. 18 和 SEQ ID NO. 19，SEQ ID NO.20 和 SEQ ID NO. 21，SEQ ID NO. 22 和 SEQ ID NO. 23 ； (2)dUTP-UNG酶系統的PCR擴增體系_
全文摘要
本發明屬于生物技術檢測領域，具體涉及一種耐多藥結核分枝桿菌檢測方法及試劑盒。本發明的試劑盒包括針對結核分枝桿菌利福平和異煙肼主要耐藥基因核酸片段的PCR正反向擴增引物(正向擴增引物5’端有生物素標記)和寡核苷酸探針序列(5’端有氨基標記)，可在一個反應單位中同時檢測rpoB基因511、516、526、531和533位、katG基因315位和inhA基因-15位的突變情況。本發明的試劑盒可快速檢測結核分枝桿菌利福平和異煙肼主要耐藥基因突變情況，且對儀器和費用要求低廉，操作簡單，可應用與結核分枝桿菌的耐藥基因檢測。
文檔編號C12R1/32GK102719537SQ20121018440
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月6日 優先權日2012年6月6日
發明者吳海, 張墨翰, 張舒林, 朱濱, 李瑤, 薛文斐 申請人:上海百傲科技有限公司, 復旦大學