專利名稱：一種全細胞高效催化木糖轉化制取木糖酸(鹽)的方法
技術領域：
本發明涉及木糖酸(鹽)的制備方法，特別涉及一種全細胞高效催化木糖轉化制取木糖酸(鹽)的方法。
背景技術：
木糖的高效轉化與利用是木質纖維類原料加工與利用，尤其是其生物煉制的關鍵性技術瓶頸。目前，木糖生物轉化的主要產 品形式有燃料こ醇、木糖醇、木糖酸(鹽)、乳酸、丁ニ酸和飼料酵母等。除木糖酸(鹽)以外，受市場容量、環境污染和現有生產技術水平的局限，目前其它產品的發展空間都十分有限。木糖酸(鹽)與葡萄糖酸(鹽)的性能相近，可用作檸檬酸和葡萄糖酸等產品的替代品，它作為一種新興的生物基化學品近年來它的用途被不斷地發掘和拓展，主要的應用市場有水泥減水劑、分散劑和緩釋劑、混凝土黏接劑、增塑劑、玻璃清洗劑、冶金除銹劑、金屬離子螯合劑和紡織助漂劑等，還被用于粘膠纖維混紡以生產夏季冰爽纖維面料。其中，尤其是木糖酸(鹽)在水泥減水劑和混凝土黏結劑領域的應用具有巨大的市場容量和廣闊的發展前景。理論上可通過化學法、酶法和微生物發酵法轉化木糖生成木糖酸(鹽)(鹽)。化學法主要是碘或鈀催化法，反應條件苛刻，環境污染大，且催化劑易失活，生產成本高。酶法主要是指葡萄糖氧化酶(EC I. I. 3. 4)和木糖脫氫酶(EC I. I. I. 175和EC I. I. I. 179)，都存在著酶的底物專ー性限制、酶用量大、反應速率低和生產成本昂貴的嚴重不足。當前已經報道的木糖微生物發酵產木糖酸(鹽)的木糖濃度最高值不超過13% (質量濃度，g/mL)，木糖利用率和木糖酸(鹽)轉化率最高值分別為90%和95%。因此，現有化學合成法和酶法轉化木糖產木糖酸(鹽)都不具備エ業化生產的條件，而微生物發酵法仍需要進ー步提高反應體系的底物和產物濃度、原料利用率和轉化率，才能保證木糖乃至木質纖維原料生物煉制的エ業化生產的整體經濟效益。

發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種全細胞高效催化木糖轉化制取木糖酸(鹽)的方法，以實現提高底物木糖和產物木糖酸(鹽)的濃度，提高設備的生產效率和降低生產成本，提高整體經濟效益。技術方案為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下
一種全細胞高效催化木糖轉化制取木糖酸(鹽)的方法，包括以下步驟
(1)在液體深層通風反應體系中加入初始反應基質，接入氧化葡萄糖酸桿菌iGluconabacter ァt/a/75·),攪拌通風連續發酵,保持反應體系的溶氧濃度不低于10% ;其中，在初始反應基質中含有木糖和必要的無機鹽，木糖的質量濃度大于13%，不高于15% ;初始發酵體系的PH值不低于3. O;
(2)采用半連續或連續分批添料方式，向發酵體系中添加木糖或木糖溶液，控制反應體系中的木糖質量濃度不高于25%，并同步調控pH值；
(3)添加至反應體系木糖累積加入質量濃度達到30%，停止添加，繼續催化反應直至木糖利用率達到98%以上，木糖酸轉化率達到99%以上。所述的氧化葡萄糖酸桿菌為ATCC 621-H菌株，或以ATCC 621-H菌株為宿主菌的基因重組菌株，或以ATCC 621-H菌株為出發菌株進行馴化改良后的菌株，接入量為使發酵體系的 OD6tltlnm= 1.0。所述分批添加木糖是指固體木糖或高濃度木糖液，同步調控所使用的堿性中和劑是指含有鈣、鈉、鉀、鎂、銨等離子的堿性固體或濃溶液，尤其是以粉狀固體碳酸鈣和碳酸鈉為最優。采用同步操作可簡化工藝，降低勞動強度。該全細胞高效催化木糖轉化制取木糖酸(鹽)的方法，針對木糖酸(鹽)微生物發酵過程中存在的底物、產物和低PH值的抑制作用，充分利用氧化葡萄糖酸桿菌類微生物細胞所具有的木糖轉運、糖氧化酶及輔酶等復合酶系，以全細胞作為催化體系，在液體深層通風 反應體系中通過半連續或連續式操作方式，分批同步添加木糖和堿性中和剤，一方面消除上述的抑制作用，另ー方面利用全細胞催化體系實現定向高效催化木糖生成木糖酸(鹽)，進而極顯著地提高底物木糖和產物木糖酸(鹽)的濃度，顯著提高設備的生產效率和降低生產成本。有益效果與現有技術相比，本發明利用全細胞催化木糖轉化制取木糖酸(鹽)的方法，通過連續或半連續分批同步添料的操作方式實現對反應體系的控制和定向催化，極顯著地提高了底物木糖和產物木糖酸(鹽)的反應濃度，顯著提高了設備的生產效率和大幅度降低了木糖酸(鹽)的生產成本，其中，底物木糖的累積濃度最高值可達到30%，木糖的最聞利用率超過99% ;廣物木糖酸(鹽)的最聞濃度值可達到29. 8%,木糖酸的轉化率最聞值可達到100%ο


圖I是全細胞催化木糖轉化制取木糖酸(鹽)的反應歷程圖；圖中，橫座標為反應時間(h)，縱座標為木糖和木糖酸(鹽)的質量濃度。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進ー步的說明。以下實施例所使用的氧化葡萄糖酸桿菌為ATCC621-H菌株，來源于美國標準生物品收藏中心(American type culture collection, ATCC)。其中，氧化葡萄糖酸桿菌NL71以ATCC 621-H菌株為出發菌株進行長期馴化選育的菌株；馴化方法采用真實木質纖維稀酸水解液逐級增濃、平板篩選和搖瓶振蕩發酵的測定方法；所得到的氧化葡萄糖酸桿菌NL71可直接發酵含有5(Tl00g/L木糖的玉米秸桿、楊木原料的稀酸水解液。稀酸水解液的制備方法全玉米稻桿剪切至3 5cm或楊木切片至長X寬X厚為3cmXl. 5cmX0. 5cm,按固液比I 3. 8 10 (質量比)加入1.0%硫酸(w/w)，于15(Tl80°C反應O. 2 2. 0h，過濾并洗滌得稀酸水解液，再經常規減壓蒸發濃縮可得濃縮液。以下實施例中，木糖和木糖酸(鹽)的測定方法采用高效液相離子色譜測定法，參照中國專利申請201210012963. 4，包括在美國Dionex ICS-3000離子色譜系統上采用CarboPacTM PAlO色譜柱帶保護柱進行測定。柱溫30°C，自動上樣，進樣體積10. O μ L ;以18 mmol/L、200 mmol/L氫氧化鈉和500 mmol/L醋酸鈉為淋洗液進行ニ元梯度淋洗,流速為
O.3 mL/min,在O 10 min內以18 mmol/L氫氧化鈉溶液進行等度洗脫；10 20 min內醋酸鈉溶液淋洗的濃度梯度為50 200 mmol/L，氫氧化鈉溶液淋洗的濃度梯度為65. 4 70. 8 mmol/L ;采用20 40 min內氫氧化鈉溶液淋洗的濃度為200 mmol/L對交換柱進行再生；采用40 50 min內氫氧化鈉溶液淋洗的濃度為18 mmol/L對交換柱進行平衡；電化學檢測器檢測模式為金工作電極和pH-Ag/AgCl復合型參比電扱。采用外標法以積分和脈沖安培檢測法和色譜峰面積積分法測定和計算各物質的濃度含量。實施例I 在3. OL全自動機械攪拌通風式發酵罐中，加入初始木糖質量濃度為9. 5%的木糖溶液1500mL，加入0. 4 8/1硫酸鎂，1.5 g/L磷酸氫ニ鉀和I. O g/L硫酸銨，控制攪拌速率為300r/min，通入無菌壓縮空氣至溶解氧濃度為10% 50%，接入活化后的氧化葡萄糖酸桿菌NL71至細胞濃度為OD6tltol = I. 0，加入粉狀碳酸鈣調節反應體系pH6. 5左右，進行全細胞催化反應。實時監測反應體系的pH值和木糖濃度，每隔2(T24h分3批同步加入約IOOg粉狀固體木糖和碳酸鈣，控制PH值為3. (Γ6. 5和木糖質量濃度不高于18% (g/mL)。如圖1，反應至192h，反應體系的木糖質量濃度低于0. 12%，木糖酸(鹽)的質量濃度為28. 4%。向反應體系累計添加底物木糖的質量濃度達到28. 6%。木糖利用率達到99%，木糖酸(鹽)和轉化率達到100%。實施例2
在10. OL全自動機械通風攪拌式發酵罐中，加入初始木糖質量濃度為15%的木糖溶液4L，加入0. 4 g/L硫酸鎂，I. 5 g/L磷酸氫ニ鉀和1.0 g/L硫酸銨，控制攪拌速率為280r/min，通入無菌壓縮空氣至溶解氧濃度為10°/Γ50%，接入活化后的ATCC 621-Η菌株至細胞濃度為OD6tltlnm = I. I，加入粉狀碳酸鈣調節反應體系ρΗ6. 5左右，進行全細胞催化反應。實時監測反應體系的pH值和木糖濃度，連續加入固體木糖，并實時控制pH值為
3.(Γ6. 5和木糖質量濃度不高于25%。添加至反應體系木糖累積加入質量濃度達到30%，停止添加，反應至木糖質量濃度低于0. 2%，測定木糖酸(鹽)的質量濃度為29. 7%。木糖利用率達到99%，木糖酸(鹽)和轉化率達到100%。實施例3
在100 L全自動機械通風攪拌式發酵罐中，加入初始木糖質量濃度為14%的木糖溶液70L，加入0. 4 g/L硫酸鎂，I. 5 g/L磷酸氫ニ鉀和I. O g/L硫酸銨，控制攪拌速率為220r/min，通入無菌壓縮空氣至溶解氧濃度為15°/Γ40%，接入活化后的ATCC 621-Η菌株至細胞濃度為OD6tltlnm = I. I，加入粉狀碳酸鈣調節反應體系ρΗ6. 5左右，進行全細胞催化反應。實時監測反應體系的pH值和木糖濃度，分批加入高濃度木糖溶液，并實時控制pH值為3. (Γ6. 5和木糖質量濃度不高于20%。添加至反應體系木糖累積加入質量濃度達到29. 2%,停止添加，反應至木糖質量濃度低于0. 2%，測定木糖酸的質量濃度為29. 0%。木糖利用率達到99%，木糖酸(鹽)和轉化率達到100%ο
權利要求
1.一種全細胞高效催化木糖轉化制取木糖酸(鹽)的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)在液體深層通風反應體系中加入初始反應基質，接入氧化葡萄糖酸桿菌，攪拌通風連續發酵，保持反應體系的溶氧濃度不低于10%;其中，在初始反應基質中含有木糖和必要的無機鹽，木糖的質量濃度大于13%，不高于15% ;初始反應體系的pH值不低于3. 0 ； (2)采用半連續或連續分批添料方式，向發酵體系中添加木糖或木糖溶液，控制反應體系中的木糖質量濃度不高于25%，并同步調控pH值； (3)添加至反應體系木糖累積加入質量濃度達到30%，停止添加，繼續催化反應直至木糖利用率達到98%以上，木糖酸轉化率達到99%以上。
2.根據權利要求I所述的全細胞高效催化木糖轉化制取木糖酸(鹽)的方法，其特征在于所述的氧化葡萄糖酸桿菌接入量為使反應體系的OD6tltlnm = I. (Tl. I。·
3.根據權利要求I所述的全細胞高效催化木糖轉化制取木糖酸(鹽)的方法，其特征在于采用含有鈣、鈉、鉀、鎂或銨離子的堿性固體或濃溶液同步調控反應體系的PH值。
4.根據權利要求I所述的全細胞高效催化木糖轉化制取木糖酸(鹽)的方法，其特征在于所述的氧化葡萄糖酸桿菌為ATCC 621-H菌株，或以ATCC 621-H菌株為宿主菌的基因重組菌株，或以ATCC 621-H菌株為出發菌株進行馴化改良后的菌株。
全文摘要
本發明公開了一種全細胞高效催化木糖轉化制取木糖酸(鹽)的方法，在液體深層通風反應體系中加入初始反應基質，接入氧化葡萄糖酸桿菌，攪拌通風連續反應，保持反應體系的溶氧濃度不低于10%；采用半連續或連續分批添料方式，向反應體系中添加木糖或木糖溶液，控制反應體系中的木糖質量濃度不高于25%，并同步調控pH值不低于2.8；添加至反應體系木糖累積加入質量濃度達到30%，停止添加，繼續催化反應完全可得轉化產物木糖酸(鹽)產品。該方法的底物木糖的累積濃度最高值可達到30%，木糖的最高利用率超過99%；發酵產物木糖酸(鹽)的最高濃度值可達到29.8%，木糖酸(鹽)的轉化率最高值可達到100%。
文檔編號C12R1/01GK102676608SQ201210191920
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月12日 優先權日2012年6月12日
發明者余世袁, 勇強, 徐勇, 王滎 申請人:南京林業大學