專利名稱：提高羅倫隱球酵母控制蘋果采后青霉病及展青霉素效力的方法
技術領域：
本發明屬于生物防治技術領域，涉及一種羅倫隱球酵母{Cryptococcuslaurentii)以及利用海藻糖提高羅倫隱球酵母控制蘋果采后青霉病及展青霉素效力的方法。
背景技術：
展青霉素又稱棒曲霉素，是青霉屬、曲霉屬、絲衣霉屬等霉菌代謝產生的一種有毒的真菌次級代謝產物，是一種遺傳毒性化合物，具有潛在的細胞和動物毒性，存在致畸性、致癌性和免疫毒性，是對人類危害最大的霉菌毒素之一。展青霉素是一種世界范圍內的水果污染物，食品生產中展青霉素的污染相當普遍，廣泛存在于蘋果、葡萄、橘子、菠蘿、玉米、奶酪和谷物等產品中，特別是在蘋果及以蘋果為加工原料的產品中展青霉素的污染最為嚴重。我國是世界最大的蘋果生產國，但由于貯藏加工能力不足，導致大量的蘋果出現腐爛現象。引起蘋果采后腐爛的致病菌主要有灰葡萄孢ci/ 6 rea)和擴展青霉iPenicillium expansum )。擴展青霉引起的蘋果損失不僅在于由擴展青霉引起的蘋果腐爛，而且在于由擴展青霉產生的展青霉素污染。蘋果上展青霉素的積累量與蘋果腐爛程度直接相關，蘋果腐爛程度越高，展青霉素平均含量越大；腐爛蘋果中的展青霉素可以擴散至未腐爛部分，腐爛部位展青霉素含量最大，展青霉素含量隨著和腐爛部位的距離增加而降低。因此控制蘋果腐爛可以有效控制蘋果上展青霉素的積累量。低溫貯藏、氣調貯藏是抑制水果采后病害的有效方法，但這兩種方法需要相應的設備，成本比較高，在廣大的發展中國家很難實施。另外，有些致病霉菌比較耐低溫，在冷藏情況下仍能在水果上生長并造成水果腐爛，甚至產生霉菌毒素。有些水果，特別是熱帶、亞熱帶水果不能在低溫下貯藏(低溫下貯藏冷害嚴重)，只能在亞低溫下貯藏，此時致病霉菌繁殖仍然比較快，水果在貯藏期的腐爛比較嚴重，產生霉菌毒素，特別是展青霉素的機會就更多。長期以來，控制水果采后病害及霉菌毒素污染的主要措施是使用殺菌劑。但是由于殺菌劑的長期大量使用對環境及健康的影響，化學殺菌劑的使用受到越來越多的限制，事實上，目前多種殺菌劑(如Captan、Benomyl等)已被美國環保局明令禁止使用或者在部分水果產品上限制使用。用拮抗微生物對水果采后病害的生物防治方法被認為是最有希望取代化學殺菌劑的果蔬采后病害防治方法之一。國內外研究表明，許多酵母菌應用于水果表面，可以防治水果由致病霉菌引起的病害，這些酵母被稱為拮抗酵母。通過近20年的研究，已經有數十種酵母顯示具有拮抗真菌的特性，特別是假絲酵母屬(Candit/a )、隱球酵母屬(Cryp tococcus )、畢赤酵母屬iPichia)、紅酵母屬iRhodotorula)、梅奇氏酵母屬(Metschnikowia)、絲抱酵母屬(Jrichosporon)和(類酵母)短梗霉屬iAureobasidium)等的研究相對較多。值得注意的是，國外近年來的研究表明，一些拮抗酵母不僅能直接抑制蘋果上的擴展青霉，抑制擴展青霉產生展青霉素，而且還能分解已經存在的展青霉素。Coelho等用體外試驗(// vitro test)的方法研究拮抗酵母對展青霉素的降解作用，結果表明，將223呢的展青霉素添加到含有25 ml酵母培養液的三角瓶中，再在其中接種3 X IO6 cells奧默畢赤酵母iPichia ohmeri),在25 ° C培養,經過2d,展青霉素減少83% ;經過5d,展青霉素減少99% ;再經過15d的培養，展青霉素的量減少到無法測定的水平。Castoria等報道粘紅酵母iRhodotorula glut in is)和羅倫隱球酵母laurentii )在體外培養情況下能分解展青霉素；將其應用于蘋果上，可以顯著降低展青霉素在蘋果上的積累。Morales等報道清酒假絲酵母QCandida sake)在冷藏條件下(1°C )既能降低蘋果上青霉病的發生率，又能防治展青霉素在蘋果上的積累。Tolaini等的研究發現，在實驗室及半商業貯藏情況下，香燕{Lentinula et/oofes)培養液能夠增強羅倫隱球酵母(C laurentii)防治蘋果上擴展青霉的生長及展青霉素產生的效力。Lima等將羅倫隱球酵母(C與低劑 量的殺菌劑boscalid (BOSC), cyprodinil (CYPR)結合使用，有效地降低了蘋果上青霉病的發病率及展青霉素的積累。目前，生物降解展青霉素以降低水果及其制品中霉菌毒素含量已成為國際學術界研究的熱點。但到目前為止，已實際應用于生產的拮抗菌種類并不多，只有Biosave和Aspire等少數幾種產品上市，我國目前尚沒有拮抗菌應用于實際生產。由于環境條件的不確定性，商業生產條件下生物拮抗菌作為活菌保鮮劑，其生物防治效果或者達不到所需要求或者不穩定，單一運用酵母拮抗菌來防治水果采后病害難以達到理想的效果。探索能夠增強現有拮抗菌拮抗能力的有效措施就顯得尤為重要。羅倫隱球酵母控制蘋果采后青霉病的作用已經得到證實，進一步提高其拮抗效力，是提高其對水果青霉病、展青霉素控制效力，并將其應用于水果貯藏保鮮的重要策略之
o海藻糖對生物體和生物大分子具有非特異性保護作用，它能有效地保護細胞膜和蛋白質的結構，使生物體在異常情況下，如高溫、干燥、高滲透壓、冷凍時仍保持細胞內濕潤，防止細胞因失水而造成養分的損失和細胞的損傷。而且體外海藻糖同樣具有穩定生物膜和蛋白質結構的特性。Li和Tian報道,通過海藻糖培養C laurentii后,能在該酵母細胞內積累較高濃度水平的海藻糖，保持細胞活性，顯著提高低溫及人工氣調條件下酵母對蘋果青霉病的控制效力。

發明內容
本發明為了克服上述現有技術中的不足，提供了一種提高羅倫隱球酵母控制蘋果采后青霉病及展青霉素效力的方法。羅倫隱球酵母經海藻糖補充培養基培養制備成菌懸液，將菌懸液應用到水果上，能提高羅倫隱球酵母對蘋果采后青霉病及展青霉素的控制效力。在體外培養(/ 情況下，經海藻糖補充培養基培養能提高羅倫隱球酵母對擴展青霉在PDA平板上生長的抑制作用；能提高羅倫隱球酵母對擴展青霉在PDA平板上展青霉素積累的抑制作用。本發明具有安全、高效、成本低等優點，可以廣泛地用于水果采后病害的生物防治過程中，減少水果青霉病造成的損失及展青霉素造成的危害。本發明同時提供了提高羅倫隱球酵母控制蘋果采后青霉病及展青霉素效力的方法，按照下述步驟進行(I)將羅倫隱球酵母(jCryptococcus laurentii)固體活化NYDA培養基28°C培養48h ; (2)液體培養在三角瓶中裝入以體積計1/5的NYDB種子培養基，用接種環接入一環活化好的羅倫隱球酵母，在200rpm，28°C條件下培養20h ; (3)誘導培養接種到海藻糖補充培養基中進行培養，離心得到菌體；將菌體制備成5 X IO8個/ml的菌懸液；在水果果實傷口處加入30 Ul酵母菌懸液，自然晾干后，將果實放入塑料筐并用保鮮膜密封，室溫下貯藏，即可達到提高控制蘋果采后青霉病及展青霉素效力的目的。其中所述的NYDB種子培養基中含牛肉膏Sg，酵母浸膏5g，葡萄糖IOgjK 1000ml ；
其中所述的海藻糖補充培養基中含酵母膏5g，牛肉浸膏Sg，海藻糖0. 2-lg,葡萄糖
0.2-lg,純化水1000ml,自然pH ;優選酵母膏5g,牛肉浸膏8g,海藻糖4g,葡萄糖6g,純化水1000ml,自然 pH。其中所述的水果為蘋果。本發明的優點
(I)本發明使用海藻糖培養羅倫隱球酵母控制蘋果青霉病的腐爛率及展青霉素積累，使用方法簡單，操作方便，效果好，成本低。(2)海藻糖培養羅倫隱球酵母可以代替化學殺菌劑防治蘋果青霉病及控制展青霉素積累，避免了化學殺菌劑對人體健康的危害，具有顯著的經濟效益和社會效益。


其中圖I為不同濃度海藻糖誘導的羅倫隱球酵母對蘋果青霉病的抑制效應；注CK :對照；NYDB :碳源為1%的葡萄糖；0. 2 :碳源為0. 2%的海藻糖和0. 8%的葡萄糖；0. 4 :碳源為0. 4%的海藻糖和0. 6%的葡萄糖；0. 6 :碳源為0. 6%的海藻糖和0. 4%的葡萄糖；0. 8 :碳源為
0.8%的海藻糖和0. 2%的葡萄糖；NYTB :碳源為I. 0%的海藻糖。不同字母代表差異顯著性(p=0. 05)。圖2為不同濃度海藻糖誘導后的羅倫隱球酵母對展青霉素積累的抑制效果；注CK :對照；0 :碳源為1%的葡萄糖；0. 2 :碳源為0. 2%的海藻糖和0. 8%的葡萄糖；0. 4 :碳源為0. 4%的海藻糖和0. 6%的葡萄糖；0. 6 :碳源為0. 6%的海藻糖和0. 4%的葡萄糖；0. 8 :碳源為0. 8%的海藻糖和0. 2%的葡萄糖；1 :碳源為I. 0%的海藻糖。不同字母代表差異顯著性(p=0. 05)。圖3為不同濃度海藻糖誘導后羅倫隱球酵母對擴展青霉在PDA培養基上生長的影響；注=CK :對照；NYDB :碳源為1%的葡萄糖；0. 2 :碳源為0. 2%的海藻糖和0. 8%的葡萄糖；
0.4 :碳源為0. 4%的海藻糖和0. 6%的葡萄糖；0. 6 :碳源為0. 6%的海藻糖和0. 4%的葡萄糖；
0.8 :碳源為0. 8%的海藻糖和0. 2%的葡萄糖；NYTB :碳源為I. 0%的海藻糖。不同字母代表差異顯著性(P=O. 05)。圖4為海藻糖誘導羅倫隱球酵母對PDA培養基上展青霉素積累的影響；
注CK :對照；NYDB :碳源為1%的葡萄糖；0. 4% :碳源為0. 4%的海藻糖和0. 6%的葡萄糖。不同字母代表差異顯著性(P=O. 05)。
具體實施例方式通過借助以下實施實例將更加詳細的說明本發明。以下實施例僅是說明性的，本發明并不受這些實施實例的限制。
羅倫隱球酵母)購于中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)，于NYDA (NYDB培養基的基礎上添加2%的瓊脂)培養基4°C低溫保存。實施例I :本發明實施過程如下(I)菌種固體活化NYDA培養基28°C培養48h ；
(2)菌種液體培養在250 ml的三角瓶中裝入50 ml的NYDB種子培養基(牛肉膏8g，酵母浸膏5g,葡萄糖10 g,水1000 ml)用接種環接入一環活化好的C. lau rentii,^￡ 200rpm,28°C條件下培養20 h ;(3)誘導培養將上述培養混合物7000Xg條件下離心10 min，無菌蒸餾水洗滌兩次，以去除培養介質，并用無菌蒸餾水重新懸浮酵母細胞，血球記數板調節細胞濃度為5X IO8個/ml。在250ml的三角瓶中分別裝入50ml NYDB培養基或海藻糖補充培養基(海藻糖濃度分別為0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%)，并加入上述濃度的酵母細胞培養液1ml，然后在200印111，281條件下培養2411;(4)離心分離再懸浮上述不同處理酵母培養混合物在7000Xg條件下,離心10-15min,并用無菌蒸懼水洗漆2次，以去除培養介質，用無菌蒸餾水重新再懸浮，并用血球計數板調節酵母細胞濃度為5X IO9個/ml。實施例2 :海藻糖誘導培養羅倫隱球酵母對蘋果青霉病的控制 一、試驗方案
蘋果處理后，用消過毒的打孔器在每個果實表面赤道部位形成統一大小和深度的傷口5mm (直徑)X3_ (深)。在每個傷口處等量加入30 (I)經NYDB培養基培養的羅倫隱球酵母菌懸液(濃度為5X108 cells/ml)； (2)經海藻糖補充培養基(碳源為海藻糖和葡萄糖)培養的酵母懸浮液，海藻糖濃度分別為0. 2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0% (NYTB培養基，以海藻糖全部取代葡萄糖)；(3)無菌水(作為對照)。3h后，在每個傷口處等量加入30 Ul P.expansum孢子懸浮液(濃度為5 X IO4 spores/ml )。自然晾干后,將蘋果放入塑料筐內，用保鮮膜密封以保持筐內濕度，置于20°C相對濕度為95%RH的恒溫恒濕培養箱內進行貯藏。每處理重復3次，每個重復12個果實，整個試驗重復2次。經過若干天的培養，用游標卡尺測定水果病斑，記錄病斑直徑并計算發病率，以此評價羅倫隱球酵母對蘋果青霉病的防治效果。發病率的計算公式如下
發病率(%)= E發病的果實/接種病原菌的果實總數X 100%
_■、試驗結果
按照上述步驟試驗，海藻糖誘導培養羅倫隱球酵母對蘋果青霉病的控制效果如下 從圖I可以看出，試驗中接種羅倫隱球酵母的所有處理均能降低擴展青霉引起的青霉病的發生率。當培養基中碳源組份海藻糖濃度0. 4%、葡萄糖0. 6%培養羅倫隱球酵母時，其對蘋果青霉病的抑制效應最為顯著。NYDB培養的羅倫隱球酵母處理組青霉病的發病率為45. 8%，為對照處理的68. 7%。經過0. 4%海藻糖和0. 6%葡萄糖為碳源誘導培養羅倫隱球酵母處理的蘋果青霉病的發病率為34%，為對照處理的50%。實施例3 :海藻糖誘導培養羅倫隱球酵母對蘋果展青霉素的控制 一、試驗方案
蘋果處理后，用消過毒的打孔器在每個果實表面赤道部位形成統一大小和深度的傷口5mm (直徑)X3_ (深)。在每個傷口處等量加入30 (I)經NYDB培養基培養的羅倫隱球酵母菌懸液(濃度為5X108 cells/ml)； (2)經海藻糖補充培養基(碳源為海藻糖和葡萄糖)培養的酵母懸浮液，海藻糖濃度分別為0. 2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0% (NYTB培養基，以海藻糖全部取代葡萄糖)；(3)無菌水(作為對照)。3h后，在每個傷口處等量加入30 Ul P.expansum孢子懸浮液(濃度為5 X IO4 spores/ml )。自然晾干后,將蘋果放入塑料筐內，用保鮮膜密封以保持筐內濕度，置于20°C相對濕度為95%RH的恒溫恒濕培養箱內進行貯藏。每處理重復3次，每個重復12個果實，整個試驗重復2次。樣品提取和凈化蘋果添加等量的無菌蒸餾水用高速組織搗碎機勻漿，取一定量的勻漿轉移至250ml錐形瓶中，加入等量果膠酶于40°C恒溫搖床水浴鍋中酶解2h，4000rpm離心取上清液作為試樣，將上清液轉移到125ml分液漏斗中，用25ml乙酸乙酯振搖5min，靜置3min。待分層后,用刻度吸管移取上層有機相于另一分液漏斗中，再加用25ml乙酸乙酯于水相中，重復上述振搖提取過程兩次。棄去水層，合并三次乙酸乙酯提取液于分液漏斗中，加入IOml碳酸鈉水溶液，立即振搖，靜置分層，此凈化操作應在2min內完成。再用IOml乙酸乙酯提取碳酸鈉水層一次，棄去碳酸鈉水層，合并乙酸乙酯提取液，加入5滴冰乙酸后，全部轉移至旋轉蒸發器于40°C下蒸發至近干，用Iml乙酸鹽緩沖溶液溶解殘留物，經
0.45um濾膜濾至樣品瓶內，采用高效液相色譜測定展青霉素的含量。二、試驗結果
按照上述步驟試驗，海藻糖誘導培養羅倫隱球酵母對蘋果展青霉素的控制效果如下由圖2結果可知，接種羅倫隱球酵母的所有處理均能降低蘋果上展青霉素的積累量。當培養基中碳源組份為海藻糖0. 4%和葡萄糖0. 6%培養羅倫隱球酵母時，其對蘋果上展青霉素的積累量的抑制效應最為顯著。經過0. 4%海藻糖和0. 6%葡萄糖為碳源誘導培養羅倫隱球酵母處理的蘋果展青霉素含量為14. 5呢，為對照處理的48%。實施例4 :海藻糖誘導培養羅倫隱球酵母對擴展青霉在PDA培養基上生長的影響 一、試驗方案
用無菌打孔器在PDA培養基中間打一個直徑為Icm的洞，加入IOOu I (I)經NYDB培養基培養的羅倫隱球酵母菌懸液(濃度為5X IO8 cells/ml) ；(2)經海藻糖補充培養基(碳源為海藻糖和葡萄糖)培養的酵母懸浮液，海藻糖濃度分別為0. 2%，0. 4%，0. 6%，0. 8%，1.0% (NYTB培養基，以海藻糖全部取代葡萄糖)；(3)無菌水(作為對照)。3h后再分別加入IOOiU擴展青霉孢子懸浮液(5X IO4 spores/ml)。用保鮮膜密封以防治交叉感染，置于溫度為28°C、相對濕度為95%RH的恒溫恒濕培養箱中培養7d，用游標卡尺測量病斑直徑。每個處理重復3次，整個試驗重復2次。二、試驗結果
不同濃度海藻糖誘導后羅倫隱球酵母對擴展青霉在PDA培養基上生長的影響結果如
下
由圖3結果可知，在PDA培養基中，接種羅倫隱球酵母的所有處理均能抑制擴展青霉的生長。當培養基中碳源成分為海藻糖0. 4%葡萄糖和0. 6%培養羅倫隱球酵母時，其對擴展青霉生長的抑制效應最為顯著。對照組病斑直徑為22. 6mm,海藻糖0. 4%葡萄糖0. 6%培養后的羅倫隱球酵母處理組病斑直徑僅為13. 5mm,擴展青霉在PDA平板上的生長得到顯著抑制。實施例5 :海藻糖誘導羅倫隱球酵母對PDA培養基上展青霉素合成量的影響 一、試驗方案
用無菌打孔器在PDA培養基中間打一個直徑為Icm的洞，加入IOOu I (I)經NYDB培養基培養的羅倫隱球酵母菌懸液(濃度為5X IO8 cells/ml) ；(2)經海藻糖補充培養基(碳源為海藻糖和葡萄糖)培養的酵母懸浮液，海藻糖濃度分別為0. 2%，0. 4%，0. 6%，0. 8%，1.0% (NYTB培養基，以海藻糖全部取代葡萄糖)；(3)無菌水(作為對照)。3h后再分別加入IOOiU擴展青霉孢子懸浮液(5X IO4 spores/ml)。用保鮮膜密封以防治交叉感染，置于溫度為28°C、相對濕度為95%RH的恒溫恒濕培養箱中培養7d，用無菌刀沿病斑外圍0. 5cm處取出PDA培養基，研缽研磨后轉移到125ml分液漏斗中，展青霉素經過提取和凈化處理后采用高效液相色譜測定展青霉素的含量。 二、試驗結果
由圖4可知，在PDA培養基中，接種羅倫隱球酵母的處理均能抑制展青霉素的合成量。經過0. 4%海藻糖0. 6%葡萄糖為碳源誘導培養的羅倫隱球酵母對展青霉素合成的抑制效果最好，為對照處理的42%。
權利要求
1.提高羅倫隱球酵母控制蘋果采后青霉病及展青霉素效力的方法，其特征在于按照下述步驟進行(I)將羅倫隱球酵母(ococcys Iaurentii固體活化NYDA培養基28°C培養48h ; (2)液體培養在三角瓶中裝入以體積計1/5的NYDB種子培養基，用接種環接入一環活化好的羅倫隱球酵母，在200 rpm, 28°C條件下培養20h ; (3)誘導培養接種到海藻糖補充培養基中進行培養，離心得到菌體；將菌體制備成5 X IO8個/ml的菌懸液；在水果果實傷口處加入30 u I酵母菌懸液，自然晾干后，將果實放入塑料筐并用保鮮膜密封，室溫下貯藏，即可達到控制蘋果采后青霉病及展青霉素效力的方法。
2.根據權利要求I所述的提高羅倫隱球酵母控制蘋果采后青霉病及展青霉素效力的方法，其特征在于其中所述的NYDB種子培養基中含牛肉膏Sg，酵母浸膏5 g，葡萄糖10 g，水 1000 ml O
3.根據權利要求I所述的提高羅倫隱球酵母控制蘋果采后青霉病及展青霉素效力的方法，其特征在于其中所述的海藻糖補充培養基中含酵母膏5g，牛肉浸膏Sg，海藻糖0.2-lg,葡萄糖0. 2-lg,純化水1000ml,自然pH。
4.根據權利要求I所述的提高羅倫隱球酵母控制蘋果采后青霉病及展青霉素效力的方法，其特征在于其中所述的水果為蘋果。
5.根據權利要求3所述的提高羅倫隱球酵母控制蘋果采后青霉病及展青霉素效力的方法，其特征在于其中所述的海藻糖補充培養基中含酵母膏5g，牛肉浸膏Sg，海藻糖4g，葡萄糖6g,純化水1000ml,自然pH。
全文摘要
本發明公開了提高羅倫隱球酵母控制蘋果采后青霉病及展青霉素效力的方法，屬于生物防治技術領域。按照下述步驟進行將羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)活化，接種到海藻糖補充培養基(碳源為0.4%海藻糖和0.6%葡萄糖)中進行培養，離心得到菌體；將菌體制備成1×108個/ml的菌懸液；在果實傷口處加入30μl酵母菌懸液，自然晾干后，將果實放入塑料筐并用保鮮膜密封，在室溫下貯藏。本發明使用海藻糖提高羅倫隱球酵母控制蘋果采后青霉病及展青霉素的效力環保、安全、經濟、高效、實用，具有重要的社會價值和經濟價值。
文檔編號A23B7/155GK102696755SQ201210190959
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月11日 優先權日2012年6月11日
發明者任曉鋒, 張曉云, 張紅印, 李超蘭, 靳莎莎 申請人:江蘇大學