專利名稱：玉米MuDR轉座子插入側翼序列的分離方法
技術領域：
本發明涉及玉米DNA領域，尤其涉及一種玉米ifoDR轉座子插入側翼序列的分離方法。
背景技術：
隨著玉米基因組 測序的完成，為玉米基因組研究和實際應用帶來了新的機遇和挑戰。玉米B73基因組約85%由轉座子組成的，其中含量較多、結構最復雜的是Mutator (Mu)轉座子家族。由于轉座子結構和遺傳的特點,轉座子標簽技術研究已成為功能基因組研究的重要領域，同時也為創制育種材料提供快速簡捷的途徑。轉座子標簽技術以轉座子插入的側翼序列的有效分離、及側翼序列與突變性狀共分離為目標的，其中量/TAIL-PCR技術是實現該目標的重要技術之一。該技術以ifo轉座子保守序列設計引物(Settles, 2004),并經Tail-PCR方法改進,分離Mu轉座子插入側翼序列的方法(Liu，1995)。利用ifotailPCR方法有效分離和克隆了籽粒顏色Myb基因和pi基因(Robbins, 2008 ；Zhang, 2005)等，同時該方法對基因組DNA質量要求不高，實驗流程簡單，耗時少，被多數利用ifo轉座子分離和克隆基因的研究者們所采用。JfoTAIL-PCR技術是Settles等(2004)根據ifo轉座子家族反向重復序列(Terminal Inverted Repeat , TIR)的保守序列設計的特異性引物進行側翼序列的擴增。Mu轉座子家族據Mu內部序列的保守性將其分為6個亞族，Mu/Mu2、MuZ、Mu‘ Mu込/Mu]、Mu8和ifo9/ifo5，而將ifo9，及與Mu轉座活性相關的轉座子Cy等命名為ifoDR (Bennetzenet al. , 1993)。ifo轉座子家族中僅JfoDR包含轉錄基因JfoDRA和ifoDRB，且轉錄起始位點在ifo-TIR內，能實現JfoDR的自主性轉座(Hershberger et al. , 1995)，因而采用ifoDR原始群體與其他玉米自交系雜交后代構建的突變體遠遠高于其家族中其他類型轉座子構建的突變體效率，故僅以ifoDR的保守序列設計引物分離和克隆ifo轉座子插入的目標基因將更具有實際意義。但現有技術中，存在一些技術問題有待解決，如下
1、根據ifo轉座子家族反向重復序列的保守序列設計的特異性引物擴增目標插入基因，致使全部量/轉座子家族及其目標基因進行擴增，而對誘變材料后代產生突變體的ifoDR無法進行特異性擴增，因而干擾了突變性狀與目標基因的聯系的建立；
2、Mum誘變材料后代是產生ifo轉座子插入突變體的主要來源，原有的技術方法是針對ifo家族擴增，而非特異性擴增ifoDR及其目標基因，會造成巨大的時間、試劑的無效浪費，突變體目標基因有效擴增效率的下降。

發明內容
本發明所解決的技術問題在于提供一種玉米JfoDR轉座子插入側翼序列的分離方法，其可實現轉座子插入的側翼序列的有效分離，提供創制育種的便捷途徑。為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案一種玉米JfoDR轉座子插入側翼序列的分離方法，包括如下步驟
第一、JfoDR誘變材料的制取用雜交方式構建誘變群體，并篩選出突變體材料；
第二、突變體材料的DNA提取；
第三、巢式引物和簡并引物設計在#"DR轉座子TIR序列的保守序列設計巢式引物TIR9-1 和 TIR9-2 序列，所述 TIR9-1 序列為ATAGAAGCCAACGCCATGGCCTCCATTTCGTC，所述TIR9-2序列為GGCCTCCATTTCGTCGAATCCCTT ;簡并引物是根據物種共享的蛋白質的保守氨基酸序列設計；
第四、進行ifoTAIL-PCR反應，并在反應中添加甘油和二甲基亞砜；
第五、JfoDR轉座子插入側翼序列的真實性檢測。作為本技術方案的進一步改進，所述巢式引物TIR9-1和TIR9-2的序列，是根據對突變體材料DNA的測序和JfoDR特異性引物擴增的結果，獲得JfoDR的TIR序列；然后，將MuOR的TIR序列與Mutator轉座子家族其他成員的TIR進行比對，獲得了 JfoDR-TIR特異性序列區域，并以此為基礎設計了巢式引物TIR9-1和TIR9-2。
作為本技術方案的進一步改進，所述分離方法還包括對量/TAIL-PCR反應的產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。作為本技術方案的進一步改進，所述量/TAIL-PCR反應包括第一輪反應和第二輪反應，所述第一輪反應中包括利用巢式引物TIR9-2和簡并引物進行預擴增，并進行高特異性循環。作為本技術方案的進一步改進，所述第二輪反應中包括利用巢式引物TIR9-2和簡并引物進行擴增，并進行超級循環。與現有技術相比，本發明所述的玉米JfoDR轉座子插入側翼序列的分離方法通過巢式引物TIR9-1和TIR9-2的設計及對側翼序列插入的真實性的檢測，能有效、便捷的實現Mum轉座子插入的側翼序列的分離。

圖I為本發明所述的量/TAIL-PCR流程圖。圖2為本發明所述的量/DR插入真實性檢測引物設計模式圖。圖3為本發明所述的量/Tail-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖，其中，Z31、Mu -親本；M1 M3 -突變體；Marker - DL2000 ;A、B分別為體系優化前、后。
具體實施方式
本發明提供一種玉米量/DR轉座子插入側翼序列的分離方法，其包括如下步驟
UifoDR誘變材料的創制
以玉米自交系Z31與具有原始來源活性ifoDR的W22 Mu雜交構建誘變群體M1,經連續自交到F7或連續回交到BC4F1，篩選穩定的突變體材料，用于量/TAIL-PCR的插入位點的檢測。2、突變材料的DNA提取 具體過程為
首先，取玉米葉片I. Og于液氮中研磨，轉入1.5ml離心管中；
然后，加預熱至 95 0C 的 CTAB 緩沖液(I. 17MNaCL、0. 0016M EDTA-8. O, O. 835MTtis-7. 5，I. 6%CTAB, 1% β -疏基乙醇)10ml，混勻；然后，在65°C水浴鍋內反應40分鐘,不時輕搖離心管；
取出離心管，待冷至室溫后，加入等體積氯仿與異戊醇混合液，混合液內氯仿與異戊醇的比例為24 :1，小心搖動試管5分鐘；
再以8000rpm的轉速進行離心5分鐘，然后，將上清液轉至另一 I. 5ml離心管中；
最后，加2/3體積異丙醇，小心混勻，室溫靜置20分，8000rpm離心5分鐘，棄上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2-3次，倒掉70%乙醇，將DNA晾干，加入50 μ I TE溶解；
待DNA完全溶解后，用于ifoTAIL-PCR方法的檢測或于_20°C長期保存。3、利用JfoTAIL-PCR技術檢測JfoDR插入側翼序列 3. UifoTAIL-PCR 設計原理
根據JfoDR的TIR序列的保守序列設計2個嵌套的特異性巢式引物，并能與玉米基因組序列匹配的簡并引物(Arbitrary Degenerate primer, AD)組合,利用引物長度、退火溫度(Tm值)的差異設計不對稱的溫度循環，經分級反應來擴增ifoDR插入的目標序列，JfoTAIL-PCR流程參圖I所示。3. 2、引物設計
2個嵌套的特異性巢式引物是根據本發明材料的特點以及ifoDR-TIR保守序列設計，有別于已報道的麗/家族的TIR保守序列，是本發明的重要改良之一，其序列及命名見如下表
Io表I JfoTail-PCR的引物及序列
權利要求
1.一種玉米ifoDR轉座子插入側翼序列的分離方法，其特征在于包括如下步驟 第一、JfoDR誘變材料的制取用雜交方式構建誘變群體，并篩選出突變體材料； 第二、突變體材料的DNA提取； 第三、巢式引物和簡并引物設計在#"DR轉座子TIR序列的保守序列設計巢式引物TIR9-1 和 TIR9-2 序列，所述 TIR9-1 序列為ATAGAAGCCAACGCCATGGCCTCCATTTCGTC，所述TIR9-2序列為GGCCTCCATTTCGTCGAATCCCTT ;簡并引物是根據物種共享的蛋白質的保守氨基酸序列設計； 第四、進行ifoTAIL-PCR反應，并在反應中添加甘油和二甲基亞砜； 第五、JfoDR轉座子插入側翼序列的真實性檢測。
2.根據權利要求I所述的分離方法，其特征在于所述巢式引物TIR9-1和TIR9-2的序列，是根據對突變體材料DNA的測序和JfoDR特異性引物擴增的結果，獲得JfoDR的TIR序列；然后，將ifoDR的TIR序列與Mutator轉座子家族其他成員的TIR進行比對，獲得了JfoDR-TIR特異性序列區域，并以此為基礎設計了巢式引物TIR9-1和TIR9-2。
3.根據權利要求2所述的分離方法，其特征在于所述分離方法還包括對ifoTAIL-PCR反應的產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
4.根據權利要求3所述的分離方法，其特征在于所述ifoTAIL-PCR反應包括第一輪反應和第二輪反應，所述第一輪反應中包括利用巢式引物TIR9-2和簡并引物進行預擴增，并進行高特異性循環。
5.根據權利要求4所述的分離方法，其特征在于所述第二輪反應中包括利用巢式引物TIR9-2和簡并引物進行擴增，并進行超級循環。
全文摘要
本發明提供了一種玉米MuDR轉座子插入側翼序列的分離方法，包括第一、MuDR誘變材料的制取；第二、突變體材料的DNA提取；第三、巢式引物設計在MuDR轉座子TIR序列的保守序列設計巢式引物TIR9-1和TIR9-2序列，所述TIR9-1序列為ATAGAAGCCAACGCCATGGCCTCCATTTCGTC，所述TIR9-2序列為GGCCTCCATTTCGTCGAATCCCTT。本發明玉米MuDR轉座子插入側翼序列的分離方法通過巢式引物TIR9-1和TIR9-2的設計，能有效、便捷的實現MuDR轉座子插入的側翼序列的分離。
文檔編號C12N15/11GK102876667SQ20121020190
公開日2013年1月16日 申請日期2012年6月19日 優先權日2012年6月19日 公開號201210201905.發明者陶勇生, 張祖新, 王婷婷, 楊偉峰 申請人:陶勇生