專利名稱：酶法制備谷胱甘肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備谷胱甘肽的方法，尤其涉及一種酶法制備谷胱甘肽的方法。
背景技術(shù)：
谷胱甘肽廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，是生物體內(nèi)最重要的非蛋白巰基化合物之一，具有還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，生物體內(nèi)大量存在并起主要作用的是GSH，廣泛用于治療肝臟疾病、腫瘤、氧中毒、衰老和內(nèi)分泌疾病，并作為生物活性添加劑及抗氧化劑用于食品領(lǐng)域。
GSH由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)通過肽鍵形成，分子中有一特殊的Y肽鍵，即由谷氨酸的Y-COOH與半胱氨酸的α-ΝΗ2縮合成的肽鍵，它不同于蛋白質(zhì)分子中的普通肽鍵。GSH為白色晶體，易溶于水、低濃度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺。 兩分子GSH脫氫后以二硫鍵相連形成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，又稱谷胱甘肽二硫化物，多以水合物形式存在，是溶于水的白色晶體。
目前谷胱甘肽的主要制備方法有溶劑萃取法、化學(xué)合成法、生物發(fā)酵法和酶法。 從谷物胚芽中提取GSH，由于GSH得率低、成本高、有機(jī)溶劑污染嚴(yán)重、純度不高，而且消耗大量糧食，現(xiàn)已很少使用。化學(xué)合成法合成GSH，由于活性產(chǎn)物不易分離，需要化學(xué)拆分，產(chǎn)品純度不高，難以推廣。
近年頗受重視的是將編碼GSH合成酶系的基因克隆到大腸桿菌或酵母中，使用微生物發(fā)酵生產(chǎn)GSH。酵母發(fā)酵法，工藝較成熟，但產(chǎn)量有待提高，而且下游工藝處理復(fù)雜。與三磷酸腺苷(ATP)再生體系偶聯(lián)合成GSH，乙酰激酶盡管效率較高，但乙酰磷酸的高價(jià)格及穩(wěn)定性限制了此法的產(chǎn)業(yè)化；酵母糖酵解途徑成本低廉，雖在胞二磷膽堿和NADP的合成方面獲得成功，但合成GSH的效率較低，主要是ATP再生反應(yīng)效率不高，反應(yīng)條件與GSH酶系催化合成GSH的條件不協(xié)調(diào)以及由此造成的成本較高限制了此方法潛力的發(fā)揮。
近年來國內(nèi)外GSH生產(chǎn)基本采用發(fā)酵法，酶法生產(chǎn)GSH的技術(shù)還未成形。有研究者提出用固定化酶技術(shù)生產(chǎn)GSH，通過調(diào)節(jié)GSH I和GSH II兩種酶的比例，將兩種酶固定在載體上，通過加入底物和ATP來生產(chǎn)GSH。但是該方法存在以下問題，直接限制了該技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用
I) GSH I和GSH II兩種酶固定在一起，無法解決兩步反應(yīng)之間的相互抑制，影響了生產(chǎn)速度；
2)固定化酶技術(shù)未解決酶活性的穩(wěn)定性問題，提高了生產(chǎn)酶的成本；以及
3)酶法合成的最大問題是ATP的來源，由于ATP價(jià)格昂貴，使得利用酶法合成GSH 的成本比傳統(tǒng)發(fā)酵法高很多。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種大規(guī)模、低成本、工業(yè)化生產(chǎn) GSH的方法，解決目前酶法生產(chǎn)GSH存在的問題。
本發(fā)明提供了一種酶法制備谷胱甘肽的方法，包括以下步驟
(I)在反應(yīng)罐A中生成Y-谷氨酰半胱氨酸；
(2)在過濾器El中分離GSH I酶；
(3)在反應(yīng)iip B中生成谷胱;甘妝；
(4)在過濾器Ε2中分離GSH II酶；以及
(5)分尚產(chǎn)物 GSH。
本發(fā)明方法進(jìn)一步包括以下步驟
(6)在再生罐C中利用二磷酸腺苷(ADP)和/或磷酸腺苷(AMP)再生ΑΤΡ，并分離生成的ATP。
本發(fā)明方法還可進(jìn)一步包括以下步驟
(7)所述步驟(2)中分離的GSH I酶的循環(huán)利用，即將分離的GSH I酶添加至反應(yīng)罐A中生成Y-谷氨酰半胱氨酸的連續(xù)反應(yīng)；以及
(8) GSH I酶的連續(xù)分離，即在過濾器El中連續(xù)分離GSH I酶。
本發(fā)明方法還可進(jìn)一步包括以下步驟
(9)所述步驟(4)中分離的GSH II酶的循環(huán)利用，即將分離的GSH II酶添加至反應(yīng)罐B中生成谷胱甘肽的連續(xù)反應(yīng)；以及
(10) GSH II酶的連續(xù)分離，即在過濾器Ε2中連續(xù)分離GSH II酶。
本發(fā)明方法還進(jìn)一步包括以下步驟
(11)產(chǎn)物GSH的連續(xù)分離。
在本發(fā)明方法中，循環(huán)利用GSH I酶和GSH II酶、以及再生ATP至少一次，即重復(fù)所述步驟(6)至所述步驟(11)至少一次，優(yōu)選重復(fù)多次，例如重復(fù)2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、25、30、40、50 次等。
本發(fā)明方法中，在反應(yīng)罐A中生成Y-谷氨酰半胱氨酸的反應(yīng)如下
反應(yīng)溫度為25_60°C，優(yōu)選30-55°C，更優(yōu)選35_50°C，最優(yōu)選37-45°C ；
反應(yīng)PH為5-10，優(yōu)選6-10，更優(yōu)選7-9的條件下；
反應(yīng)體系I為含有底物谷氨酸或其鹽和半胱氨酸或其鹽、以及鎂離子、鉀離子、鈉離子和Tris的水溶液；
在反應(yīng)體系I中添加ATP和GSH I酶，或者添加再生的ATP和分離的GSHI酶，反應(yīng)一段時(shí)間，例如1-10小時(shí),優(yōu)選2-8小時(shí),最優(yōu)選3-6小時(shí)生成Y-谷氨酰半胱氨酸；
其中所述鎂離子源自氯化鎂、硫酸鎂、亞硫酸鎂或硝酸鎂中的一種或多種；所述鉀離子源自氯化鉀、硫酸鉀、硝酸鉀、氫氧化鉀、亞硫酸鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、醋酸鉀或檸檬酸鉀中的一種或多種；所述鈉離子源自氯化鈉、硫酸鈉、硝酸鈉、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、碳酸鈉、 碳酸氫鈉、醋酸鈉或檸檬酸鈉中的一種或多種。
本發(fā)明方法中在反應(yīng)罐B中生成谷胱甘肽的反應(yīng)如下
反應(yīng)溫度為25-60°C，優(yōu)選30-55°C，更優(yōu)選35_50°C，最優(yōu)選37-45°C ；
反應(yīng)PH為5-10，優(yōu)選6-10，更優(yōu)選7-9的條件下；
反應(yīng)體系2為添加了底物甘氨酸或其鹽的所述步驟(2)的濾出液I ;
在反應(yīng)體系2中添加ATP和GSH II酶，或者添加再生的ATP和分離的GSHII酶， 反應(yīng)一段時(shí)間，例如1-10小時(shí)，優(yōu)選2-8小時(shí)，最優(yōu)選2-5小時(shí)生成谷胱甘肽。
本發(fā)明方法中在再生罐C中的再生反應(yīng)如下
反應(yīng)溫度為25_50°C，優(yōu)選 25_40°C ；
反應(yīng) PH 為 4-9，優(yōu)選 5-8 ；
再生反應(yīng)體系為包含葡萄糖、酵母、鎂離子、鉀離子、鈉離子和磷酸根離子的水溶液；
向再生罐C中添加的ADP和/或AMP為所述步驟(5)分離出產(chǎn)物GSH之后的反應(yīng)液的濃縮液；
在再生罐C反應(yīng)一段時(shí)間生成再生的ATP，再生的ATP通過離心或過濾方法分離；
其中所述酵母選自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和/或畢赤酵母 (Pichia pastoris)，所述磷酸根離子源自磷酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀或磷酸鈉或磷酸鉀中的一種或多種。
本發(fā)明方法中過濾器El或E2具有進(jìn)料口、出料口和回流口，內(nèi)設(shè)過濾膜，在循環(huán)利用GSH I酶或GSH II酶時(shí)，反應(yīng)體系通過過濾器El或E2添加至反應(yīng)罐的方式如下
向反應(yīng)罐A或反應(yīng)罐B中添加完分離的GSH I酶或GSH II酶之后，將補(bǔ)加的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液或反應(yīng)體系2的反應(yīng)液經(jīng)過濾器El或過濾器E2的回流口、過濾器El或 E2、和過濾器El或E2的進(jìn)料口添加至反應(yīng)罐A或反應(yīng)罐B。
本發(fā)明方法中所提及的氨基酸或其鹽都為L型氨基酸或其鹽。
更具體地，本發(fā)明方法包括以下步驟
(I)在反應(yīng)罐A中生成Y -谷氨酰半胱氨酸(Y -GluCys )
在反應(yīng)體系I中添加ATP和GSH I酶，在25_60°C、PH為5-10的條件下反應(yīng)生成 Y-谷氨酰半胱氨酸，其中所述反應(yīng)體系I為含有底物谷氨酸或其鹽和半胱氨酸或其鹽、以及鎂離子、鉀離子、鈉離子和Tris的水溶液；
(2)在過濾器El中分離GSH I酶
通過超濾方法，從所述步驟(I)的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液中分離出GSH I酶，經(jīng)過濾器El的濾出液I為分離出GSH I酶之后的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液，其中所述過濾器El具有進(jìn)料口、出料口和回流口，內(nèi)設(shè)截留分子量小于56kDa的膜；
(3)在反應(yīng)iig B中生成谷胱;甘妝
在反應(yīng)體系2中添加ATP和GSH II酶，在25_60°C、PH為5-10的條件下反應(yīng)生成谷胱甘肽，其中所述反應(yīng)體系2為添加了底物甘氨酸或其鹽的所述步驟(2)的濾出液I ;
(4)在過濾器E2中分離GSH II酶
通過超濾方法，從所述步驟(3)的反應(yīng)體系2的反應(yīng)液中分離出GSH II酶，經(jīng)過濾器E2的濾出液2為分離出GSH II酶之后的反應(yīng)體系2的反應(yīng)液，其中所述過濾器E2具有進(jìn)料口、出料口和回流口，內(nèi)設(shè)截留分子量小于35kDa的膜；以及
(5)分離產(chǎn)物GSH
通過離子交換方法，從所述步驟(4)的濾出液2中分離產(chǎn)物GSH，經(jīng)離子交換后的穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP。
本發(fā)明方法還可進(jìn)一步包含以下步驟
(6)在再生罐C中利用ADP和/或AMP再生ATP，并分離生成的ATP
將所述步驟(5)的穿出液濃縮之后，將其含有的ADP和/或AMP在20_50°C、PH值為4-9的條件下在再生反應(yīng)體系中再生為ATP，所述再生反應(yīng)體系為包含葡萄糖、酵母、鎂離子、鉀離子、鈉離子和磷酸根離子的水溶液；再生的ATP通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的離心或過濾方法分離，將再生反應(yīng)體系中的酵母去除；
(7)反應(yīng)罐A中生成Y-谷氨酰半胱氨酸的連續(xù)反應(yīng)，即步驟(I)的連續(xù)反應(yīng)
將所述步驟(2)中分離出的GSH I酶經(jīng)由過濾器El的回流口添加至反應(yīng)罐A，
將一定量所述步驟(6)中再生的ATP量添加至反應(yīng)罐A，
添加完分離的GSH I酶之后，將補(bǔ)加的的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液經(jīng)由過濾器El的回流口、過濾器E1、和過濾器El的進(jìn)料口添加至反應(yīng)罐A，
在25_60°C、PH為5_10的條件下進(jìn)行生成Y -谷氨酰半胱氨酸的連續(xù)反應(yīng)；以及
(8)在過濾器El中連續(xù)分離GSH I酶，即步驟(2)的連續(xù)分離
通過超濾方法，從所述步驟(7)即步驟(I)的連續(xù)反應(yīng)步驟中的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液中分離出GSH I酶，經(jīng)過濾器El的濾出液I為分離出GSH I酶之后的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液。
(9)反應(yīng)罐B中生成谷胱甘肽的連續(xù)反應(yīng)，即步驟(3)的連續(xù)反應(yīng)
所述步驟(4)中分離出的GSH II酶經(jīng)由過濾器E2的回流口添加至反應(yīng)罐B，
將一定量所述步驟(6)中再生的ATP添加至反應(yīng)罐B，
添加完分離的GSH II酶之后，將反應(yīng)體系2經(jīng)由過濾器E2的回流口、過濾器E2、 和過濾器E2的進(jìn)料口添加至反應(yīng)罐B，其中所述反應(yīng)體系2為添加了底物l-10g/L甘氨酸或其鹽的所述步驟(2)的連續(xù)分離步驟，即所述步驟(8)的濾出液1，
在25_60°C、PH為5_10的條件下進(jìn)行反應(yīng)生成谷胱甘肽的連續(xù)反應(yīng)；
(10)在過濾器E2中連續(xù)分離GSH II酶，即步驟(4)的連續(xù)分離
通過超濾方法，從所述步驟(3)的連續(xù)反應(yīng)步驟，即所述步驟(9)的反應(yīng)體系2的反應(yīng)液中分離出GSH II酶，經(jīng)過濾器E2的濾出液2為分離出GSH II酶之后的反應(yīng)體系2 的反應(yīng)液；以及
(11)分離產(chǎn)物GSH，即步驟(5)的連續(xù)分離
通過離子交換方法，從所述步驟(4)的連續(xù)分離步驟，即所述步驟(10)的濾出液2 中分離產(chǎn)物GSH，經(jīng)離子交換后的穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP。
本發(fā)明的方法中所述步驟(6)至所述步驟(11)可以重復(fù)至少一次，優(yōu)選重復(fù)多次，例如重復(fù) 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50 次等。
本發(fā)明所采用的GSH I酶和GSH II酶來源于任何生物，或者是經(jīng)過人工改造具有同樣催化功能的酶。
本發(fā)明方法步驟(I)添加的ATP為l_20g/L，優(yōu)選2_15g/L ;添加的GSHI酶的濃度為O. 01-0. 2g/L，優(yōu)選O. 05g/L ;所述步驟(I)或步驟(I)的連續(xù)反應(yīng)步驟中，反應(yīng)溫度為 30-55°C，優(yōu)選35-50°C，更優(yōu)選37_45°C，反應(yīng)PH為6_10，優(yōu)選7_9，反應(yīng)體系I為含有底物l-8g/L谷氨酸或其鹽，優(yōu)選2-6g/L谷氨酸或其鹽；l-8g/L半胱氨酸或其鹽，優(yōu)選2_5g/L 半胱氨酸或其鹽；以及O. 01-0. IM鎂離子，優(yōu)選O. 01-0. 08M鎂離子；0. 01-0. 3M鉀離子，優(yōu)選O. 05-0. 2M鉀離子；0. 01-0. 3M鈉離子，優(yōu)選O. 05-0. 2M鈉離子；和2_12g/L Tris,優(yōu)選 4-8g/L Tris 的溶液。
本發(fā)明方法步驟(2)和步驟(4)中采用的膜選自醋酸纖維素膜、聚砜膜、聚丙烯腈膜、聚氯乙烯膜、聚偏氟乙烯膜、聚酰胺膜或陶瓷膜。
本發(fā)明方法步驟(3)添加的ATP為l_20g/L，優(yōu)選2_15g/L ;添加的GSHII酶的濃度為O. 01-0. 2g/L，優(yōu)選O. 05g/L ;所述步驟(3)或步驟(3)的連續(xù)反應(yīng)步驟中，反應(yīng)溫度為 30-550C，優(yōu)選30-50°C，更優(yōu)選35-45°C，反應(yīng)的pH值為6_10，優(yōu)選7_9，添加的底物濃度為 l-10g/L甘氨酸或其鹽，優(yōu)選2-8g/L甘氨酸或其鹽。
本發(fā)明方法步驟(6)的反應(yīng)溫度為25-40 °C、PH為5-8，所述再生反應(yīng)體系包含l_60g/L葡萄糖，優(yōu)選10-50g/L葡萄糖，更優(yōu)選10-40g/L葡萄糖；l_60g/L酵母，優(yōu)選 10-50g/L,更優(yōu)選 20-40g/L 酵母；0. 01-0. IM 鎂離子，優(yōu)選 O. 02-0. 08M 鎂離子；0. 01-0. 5M 鉀離子，優(yōu)選O. 05-0. 3M鉀離子；0. 01-1M鈉離子，優(yōu)選O. 05-0. 8M鈉離子；以及O. 01-0. 5M 磷酸根離子，優(yōu)選O. 1-0. 5M磷酸根離子；所述酵母選自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和/或畢赤酵母(Pichia pastoris),所述磷酸根離子源自磷酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀或磷酸鈉或磷酸鉀中的一種或多種。
本發(fā)明方法將合成GSH的兩步反應(yīng)，即生成Y-谷氨酰半胱氨酸的反應(yīng)和生成GSH 的反應(yīng)，分別在不同的反應(yīng)罐中進(jìn)行，并且每步反應(yīng)之后都分離出反應(yīng)使用的酶即Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH-I)和谷胱甘肽合成酶(GSH-II)，使得GSH I和GSH II兩種酶的酶活力得到最大程度利用，降低了兩種酶促反應(yīng)之間的相互抑制。本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了 GSH I 和GSH II的循環(huán)利用，并且使用了適合制備GSH的反應(yīng)所需的ATP再生系統(tǒng)，降低了制備 GSH的生產(chǎn)成本，提高了 GSH產(chǎn)率，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
在本發(fā)明方法中，按實(shí)施例3計(jì)算，僅使用約5克GSH I酶和5克GSH II酶和約 2400克ATP，在100升反應(yīng)體系中，連續(xù)循環(huán)反應(yīng)10次，在40小時(shí)內(nèi)可以生產(chǎn)8000克GSH。 如果用以前報(bào)道的工藝進(jìn)行生產(chǎn)，至少需要使用ATP24960克，生產(chǎn)時(shí)間至少200小時(shí)。因此，用我們的發(fā)明方法生產(chǎn)GSH節(jié)約了約90%的ATP，相比于以前報(bào)道的固定化酶法制備 GSH技術(shù)，效率提高了 10倍以上。綜上所述，本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)
I)拋棄固定化技術(shù)，將合成GSH所需的兩種酶Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH-I) 和谷胱甘肽合成酶(GSH-II)分開反應(yīng)，降低了兩種酶促反應(yīng)之間的相互抑制，同時(shí)使每種酶的酶活力最大程度的得到充分使用；
2)兩步反應(yīng)可以方便檢測GSH I和GSH II兩種酶的活性變化，有利于生產(chǎn)監(jiān)控；
3)建立了適合GSH生產(chǎn)的ATP再生系統(tǒng)，降低了生產(chǎn)成本；
4)建立了適合GSH I和GSH II兩種酶保持高活性的反應(yīng)體系，可以大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)；
5)采用連續(xù)反應(yīng)體系，分兩步合成GSH，利用連續(xù)分離體系和ATP再生體系使酶促合成GSH連續(xù)穩(wěn)定生產(chǎn)；以及
6 )本發(fā)明方法縮短了反應(yīng)時(shí)間。


圖I為本發(fā)明方法制備GSH的工藝流程圖。
圖2為本發(fā)明所表達(dá)的GSH I酶和GSH II酶的SDS-PAGE圖。
圖3為生成Y-谷氨酰半胱氨酸反應(yīng)在起始O小時(shí)10倍稀釋反應(yīng)液的HPLC圖譜。
圖4為生成Y -谷氨酰半胱氨酸反應(yīng)3小時(shí)10倍稀釋反應(yīng)液的HPLC圖譜。
圖5為反應(yīng)罐A中Y -谷氨酰半胱氨酸生成量與時(shí)間關(guān)系圖
圖6為分離的GSH I和GSH II酶的SDS-PAGE圖。
圖7為生成谷胱甘肽反應(yīng)2. 5小時(shí)20倍稀釋反應(yīng)液的HPLC圖譜。
圖8為反應(yīng)罐B中谷胱甘肽生成量與時(shí)間關(guān)系圖
圖9為陽離子交換穿出液的HPLC圖譜
圖10為ATP再生體系反應(yīng)O小時(shí)的HPLC圖譜。
圖11為ATP再生體系反應(yīng)3小時(shí)的HPLC圖譜。
圖12為循環(huán)反應(yīng)次數(shù)與Y-GluCys生成量關(guān)系圖。
圖13為循環(huán)反應(yīng)次數(shù)與GSH生成量關(guān)系圖。實(shí)施例
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)能理解，以下實(shí)施例是示意性的而非限制性的。
實(shí)施例IGSH I酶和GSH II酶的制備
本發(fā)明方法中的GSH I酶和GSH II酶可以商購獲得，或者是經(jīng)過人工改造具有同樣催化功能的酶。
GSH I酶和GSH II酶的制備過程如下
根據(jù)gsh I與gsh II基因序列(GenBank:X03954. I和X01666),設(shè)計(jì)兩對(duì)擴(kuò)增引物，由中美泰和生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如下
gshl 正義引物5’ -CCCATGGTCCCGGACGTATCACAGGCGCTG-3’ ；
gshl 反義引物5’ -CGGATCCTCAGGCGTGTTTTTCCAGCCACAC-3> ；
gsh II 正義引物5’ -CCCATGGTCAAGCTCGGCATCGTGATGG-3，；
gsh II 反義引物5’ -CGGATCCTTACTGCTGCTGTAAACGTGC-3’。
提取大腸桿菌(Escherichia coli)K12菌株(購于天根生化科技有限公司)DNA,以其為模板，通過PCR擴(kuò)增出gsh I與gsh II基因片段，并將其分別連接至pET 28a載體(購于Invitrogen公司),經(jīng)測序正確后,分別轉(zhuǎn)入E. coli BL21 (DE3)菌株(購于天根生化科技有限公司)。
將轉(zhuǎn)化后的E. coli BL21 (DE3)單克隆接入LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，加入ImM 異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)5小時(shí)后，收集菌體，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE )篩選高表達(dá)菌株。
將篩選出的高表達(dá)菌株在無菌條件下接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后接入含5L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后接入含50L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)5小時(shí)后加入ImM IPTG誘導(dǎo)5小時(shí)后，離心收集菌體約1000g。
其中LB培養(yǎng)基成分為1%蛋白胨、0. 5%酵母粉和l%NaCl ;種子培養(yǎng)基成分為1% 蛋白胨、0. 5%酵母粉和1%氯化鈉；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為1%蛋白胨、0. 5%酵母粉、1%氯化鈉、 5%磷酸氫二鈉、1%磷酸二氫鈉、0. 01%硫酸鎂和1%甘油。
收獲的菌體經(jīng)超聲或高壓勻漿破菌后，離心收集上清。然后加30%飽和的硫酸銨， 離心收集沉淀。經(jīng)Tris緩沖液pH 8. O溶解后，使用G25柱(購于通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)有限公司)脫鹽，再經(jīng)DEAE-Sepharose FF (購于通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)有限公司)層析可得到初步純化的GSH I酶和GSH II酶。參見圖2為所制備酶的SDS-PAGE圖，泳道I為GSH I 酶，約56kDa ;泳道2為GSH II酶，約35kDa ;泳道3為蛋白標(biāo)志物14_97kDa(購于北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司)。IOOOg菌體獲得約10-30g粗純的酶。使用現(xiàn)有技術(shù)記載的公知的測定GSH I酶和GSH II酶活性的方法，檢測到GSH I酶和GSH II酶活性分別為7000U和 100001其中將1111底物完全轉(zhuǎn)化定義為I個(gè)活性單位(U)。
實(shí)施例2反應(yīng)時(shí)間的確定
參見圖1，根據(jù)本發(fā)明制備GSH的工藝流程圖進(jìn)行如下反應(yīng)
(I)在反應(yīng)罐A中生成Y -谷氨酰半胱氨酸(Y -GluCys)
在反應(yīng)罐A中，100L無菌水的反應(yīng)體系I為含有底物600g谷氨酸和400g半胱氨酸，以及600g TrisUlOOg氯化鉀、870g氯化鈉和800g氯化鎂的溶液，在反應(yīng)體系I中添加5g GSH I酶，加氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至8. 5，流加ATP開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH恒定為 8. 5，溫度為40。。。
使用高效液相色譜(HPLC)檢測反應(yīng)第0、1、2、3、4、5小時(shí)Y-谷氨酰半胱氨酸的生成量，參見參見圖3、圖4和圖5。圖3為反應(yīng)起始O小時(shí)10倍稀釋反應(yīng)液的HPLC圖譜， 圖4為反應(yīng)3小時(shí)10倍稀釋反應(yīng)液的HPLC圖譜，圖中未標(biāo)出峰為氨基酸。圖5為反應(yīng)罐A 中Y-谷氨酰半胱氨酸生成量與時(shí)間關(guān)系圖。HPLC檢測條件為Kromasi I C18色譜柱(購于AKZO NOBEL公司)(250X4. 6mm)，檢測波長210nm。流動(dòng)相為含有6. 8g/L磷酸二氫鉀、 2. Og/L庚烷磺酸鈉和3%甲醇的水溶液，pH=3. O。
從結(jié)果可以看出3小時(shí)后，Y-谷氨酰半胱氨酸生成量達(dá)到約6. 6g/L，反應(yīng)增長緩慢，ATP用量約為1200g。繼續(xù)補(bǔ)充ATP，5小時(shí)后，ATP用量約為2000g，Y -谷氨酰半胱氨酸生成量約7g/L。從中可以看出，反應(yīng)3小時(shí)后，由于產(chǎn)物的抑制作用，Y-谷氨酰半胱氨酸生成速度明顯降低。由此確定，反應(yīng)罐A中生成Y-谷氨酰半胱氨酸的反應(yīng)時(shí)間為3 小時(shí)。
(2)在過濾器El中分離GSH I酶
通過超濾方法，將步驟(I)的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液經(jīng)過濾器El的進(jìn)料口至過濾器 El過濾分離GSH I酶，過濾器El內(nèi)裝膜包(購于Pall公司，截留分子量IOkDa),從濾器El 的出料口流出的濾出液I為分離出GSH I酶之后的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液。
分離的GSH I酶參見圖6酶的SDS-PAGE圖，泳道I為膜包截留的GSH I酶，約 56kDa ;泳道2為濾出液I,無蛋白濾出；泳道3為蛋白標(biāo)志物14_97kDa(購于北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司)。使用實(shí)施例I中描述方法，檢測GSH I酶的活性約為7000U。
(3)在反應(yīng)iig B中生成谷胱;甘妝
在反應(yīng)罐B中，向反應(yīng)體系2中添加5g GSH II，反應(yīng)體系2為添加了底物300g甘氨酸的實(shí)施例2步驟(2)的濾出液1，控制pH恒定為8. 5，溫度為35°C，流加ATP開始反應(yīng)。 使用高效液相色譜(HPLC)檢測反應(yīng)第O、I、2、2. 5、3、4、5小時(shí)GSH的生成量，參見參見圖7 和圖8。圖7為生成谷胱甘肽反應(yīng)2. 5小時(shí)20倍稀釋反應(yīng)液的HPLC圖譜，圖中未標(biāo)出峰為氨基酸。圖8為反應(yīng)罐B中谷胱甘肽生成量與時(shí)間關(guān)系圖。HPLC檢測條件同上述步驟(I)。
從結(jié)果可以看出2. 5小時(shí)后，谷胱甘肽生成量達(dá)到約8g/L，98%以上Y -谷氨酰半胱氨酸被耗盡，ATP用量約為1200g。繼續(xù)補(bǔ)充ATP，5小時(shí)后，ATP用量約為2000g，谷胱甘肽生成量沒有明顯增加。由此確定，反應(yīng)罐B中生成谷胱甘肽的反應(yīng)時(shí)間為2. 5小時(shí)。
實(shí)施例3谷胱甘肽的制備
參見圖1，根據(jù)本發(fā)明制備GSH的工藝流程圖按照如下步驟制備谷胱甘肽
(I)在反應(yīng)罐A中生成Y -谷氨酰半胱氨酸(Y -GluCys)
在反應(yīng)罐A中，100L無菌水的反應(yīng)體系I為含有底物600g谷氨酸和400g半胱氨酸，以及600g TrisUlOOg氯化鉀、870g氯化鈉和800g氯化鎂的溶液，在反應(yīng)體系I中添加5g GSH I酶，加氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至8. 5，流加ATP開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH恒定為 8. 5，溫度為40°C。3小時(shí)后，ATP用量約為1200g。
高效液相色譜(HPLC)檢測Y-谷氨酰半胱氨酸的生成量約為6. 6g/L，90%以上 ATP轉(zhuǎn)化為ADP (AMP)，參見圖4，為反應(yīng)3小時(shí)10倍稀釋反應(yīng)液的HPLC圖譜，圖中未標(biāo)出峰為氨基酸。HPLC檢測條件同上述實(shí)施例2中的步驟(I)。
(2)在過濾器El中分離GSH I酶
通過超濾方法，將步驟(I)的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液經(jīng)過濾器El的進(jìn)料口至過濾器 El過濾分離GSH I酶，過濾器El內(nèi)裝膜包(購于Pall公司，截留分子量IOkDa),從濾器El 的出料口流出的濾出液I為分離出GSH I酶之后的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液。
使用實(shí)施例I中描述方法，檢測GSH I酶的活性約為7000U。
(3)在反應(yīng)iig B中生成谷胱;甘妝
在反應(yīng)罐B中，向反應(yīng)體系2中添加5g GSH II，反應(yīng)體系2為添加了底物300g甘氨酸的步驟(2)的濾出液1，控制pH恒定為8. 5，溫度為35°C，流加ATP開始反應(yīng)。2. 5小時(shí)后，ATP用量約為1200g。
HPLC檢測GSH的生成量約為8g/L，90%以上ATP轉(zhuǎn)化為ADP(AMP)，參見圖7，為反應(yīng)2. 5小時(shí)20倍稀釋反應(yīng)液的HPLC圖譜，圖中未標(biāo)出峰為氨基酸。HPLC檢測條件同上述實(shí)施例2中的步驟(I)。
(4)在過濾器E2中分離GSH II酶
通過超濾方法，將步驟(3)的反應(yīng)體系2的反應(yīng)液經(jīng)過濾器E2的進(jìn)料口至過濾器 E2過濾分離GSH II酶，過濾器E2內(nèi)裝膜包(購于Pall公司，截留分子量IOkDa),從濾器E2 的出料口流出的濾出液2為分離出GSH II酶之后的反應(yīng)體系2的反應(yīng)液。
分離的GSH II酶參見圖6酶的SDS-PAGE圖，泳道3為為蛋白標(biāo)志物14-97kDa(購于北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司);泳道4為濾出液2，無蛋白濾出；泳道5為膜包截留的GSH II酶，約35kDa。使用實(shí)施例I中描述的方法，檢測GSH II酶的活性約為10000Uo
(5)分離產(chǎn)物谷胱甘肽
使用鹽酸調(diào)節(jié)濾出液2的pH值至3. 0，在離子交換柱中通過DOOl大孔強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(購于天津樹脂廠)，溶液中的GSH、部分氨基酸及陽離子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物質(zhì)，參見圖9，為陽離子交換穿出液的HPLC圖譜。HPLC檢測條件為KromasiI C18色譜柱(購于AKZO NOBEL公司)(250X4. 6_)，檢測波長254nm。 流動(dòng)相為50mM磷酸鹽緩沖液，pH=6. O。穿出液經(jīng)濃縮后含有ATP、ADP和/或AMP。
使用O. 2M NaOH,0-0. 8M NaCl梯度洗脫陽離子交換樹脂上的GSH，GSH產(chǎn)量共計(jì) 720g，收率可達(dá)90%。
(6)在再生罐C中利用ADP和/或AMP再生ATP，并分離生成的ATP
將步驟(5)的穿出液在蒸餾塔中減壓蒸餾濃縮至約5倍，至ADP和/或AMP約O. 24M后，將其含有的ADP和/或AMP在30°C、PH值為5. 5的條件下在再生反應(yīng)體系中再生為ATP，所述再生反應(yīng)體系為20L無菌水中包含600g葡萄糖、320g氯化鎂、360g氯化鉀、 600g氯化鈉、320ml 85%H3P04和500g干燥處理過的釀酒酵母，加NaOH調(diào)pH至5. 5。3小時(shí)后，ATP再生轉(zhuǎn)化率為90%以上，參見圖10和圖11。圖10為ATP再生體系反應(yīng)O小時(shí)的 HPLC圖譜，從圖10可以看出，步驟(5)的穿出液中主要含有ADP和AMP。圖11為ATP再生反應(yīng)體系反應(yīng)3小時(shí)的HPLC圖譜，從圖11可以看出，90%的ADP和AMP已再生轉(zhuǎn)化為ATP， 共計(jì)2200g ATP。HPLC檢測條件同上述步驟(5)。
再生的ATP在離心機(jī)中以5000rpm轉(zhuǎn)速通過離心從再生反應(yīng)體系中分離，將再生反應(yīng)體系中的酵母去除。
(7)反應(yīng)罐A中生成Y-谷氨酰半胱氨酸的連續(xù)反應(yīng)，即步驟(I)的連續(xù)反應(yīng)
將步驟(2)中分離出的GSH I酶經(jīng)由過濾器El的回流口添加至反應(yīng)罐A，
將一定量步驟(6)中再生的ATP添加至反應(yīng)罐A，例如按補(bǔ)加的反應(yīng)體系I所需量，約1200g以流加方式添加ATP至反應(yīng)罐A，
添加完分離的GSH I酶之后，將補(bǔ)加的反應(yīng)體系I經(jīng)由過濾器El的回流口、過濾器E1、和過濾器El的進(jìn)料口添加至反應(yīng)罐A，以便將過濾器El中的膜上吸附的少量GSH I 酶反沖至反應(yīng)罐A ；
在40°C、PH為8. 5的條件下進(jìn)行生成Y _谷氨酰半胱氨酸的連續(xù)反應(yīng)；3小時(shí)后， HPLC檢測Y -谷氨酰半胱氨酸的生成量約為6. 5g/L，90%以上ATP轉(zhuǎn)化為ADP(AMP)。HPLC 檢測條件同上述實(shí)施例2中的步驟(I)。
在該步驟中，ATP和GSH I酶被循環(huán)利用。GSH I酶循環(huán)反應(yīng)10次后，酶活性約降低15%，需補(bǔ)加15%新酶。參見圖12，為循環(huán)反應(yīng)次數(shù)與Y-GluCys生成量關(guān)系圖。
(8)在過濾器El中連續(xù)分離GSH I酶，即步驟(2)的連續(xù)分離
通過超濾方法，從所述步驟(7)的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液中分離出GSH I酶，經(jīng)過濾器El的濾出液I為分離出GSH I酶之后的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液。
(9)反應(yīng)罐B中生成谷胱甘肽的連續(xù)反應(yīng)，即步驟(3)的連續(xù)反應(yīng)
將步驟(4)中分離出的GSH II酶經(jīng)由過濾器E2的回流口添加至反應(yīng)罐B ；
將一定量步驟(6)中再生的ATP添加至反應(yīng)罐B，例如按反應(yīng)體系2所需量，約 1200g以流加方式添加ATP至反應(yīng)罐B，
添加完分離的GSH II酶之后，將反應(yīng)體系2 (為添加了底物l_10g/L甘氨酸的步驟(2)的連續(xù)分離步驟，即步驟(8)的濾出液I)經(jīng)由過濾器E2的回流口、過濾器E2、和過濾器E2的進(jìn)料口添加至反應(yīng)罐B，以便將膜包中吸附的少量GSH II酶反沖至反應(yīng)罐B ;
在35°C、PH為8. 5的條件下進(jìn)行反應(yīng)生成谷胱甘肽的連續(xù)反應(yīng)；2. 5小時(shí)后，HPLC 檢測GSH的生成量約為8g/L，共計(jì)800g。90%以上ATP轉(zhuǎn)化為ADP (AMP)0 HPLC檢測條件同上述實(shí)施例2中的步驟(I)。
在該步驟中，實(shí)現(xiàn)了 ATP以及GSH II的循環(huán)利用。GSH II循環(huán)反應(yīng)10次后，酶活性約降低11%，需補(bǔ)加11%新酶。參見圖13，為循環(huán)反應(yīng)次數(shù)與GSH生成量關(guān)系圖。
(10)在過濾器E2中連續(xù)分離GSH II酶，即步驟(4)的連續(xù)分離
通過超濾方法，從步驟(3)的連續(xù)反應(yīng)步驟，即步驟(9)的反應(yīng)體系2的反應(yīng)液中分離出GSH II酶，經(jīng)過濾器E2的濾出液2為分離出GSH II酶之后的反應(yīng)體系2的反應(yīng)液。
(11)分離產(chǎn)物谷胱甘肽，即步驟(5)的連續(xù)分離
使用鹽酸調(diào)節(jié)步驟(4)的連續(xù)分離步驟，即步驟(10)的濾出液2的pH值至3. 0， 在離子交換柱中通過DOOl大孔強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(購于天津樹脂廠)，溶液中的GSH、部分氨基酸及陽離子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物質(zhì)。
使用O. 2M NaOH, 0-0. 8M NaCl梯度洗脫GSH，GSH產(chǎn)量共計(jì)720g，收率可達(dá)90%。
重復(fù)步驟(6)至步驟(11)8次，參見圖12和圖13，分別為為循環(huán)反應(yīng)次數(shù)與 Y -GluCys生成量關(guān)系圖和循環(huán)反應(yīng)次數(shù)與GSH生成量關(guān)系圖。
實(shí)施例4使用氨基酸鹽生成Y -谷氨酰半胱氨酸
在反應(yīng)罐A中，100L無菌水的反應(yīng)體系I為含有底物763g谷氨酸鈉和580g半胱氨酸鹽酸鹽，以及600g TrisUlOOg氯化鉀、870g氯化鈉和800g氯化鎂的溶液，在反應(yīng)體系 I中添加5g GSH I酶，加氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至8. 5，流加ATP開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH 恒定為8. 5，溫度為40°C。3小時(shí)后，ATP用量約為1200g。
HPLC檢測Y-谷氨酰半胱氨酸的生成量約為6. 6g/L，90%以上ATP轉(zhuǎn)化為ADP (AMP)0 HPLC檢測條件同上述實(shí)施例2中的步驟(I)。
從結(jié)果可以看出使用谷氨酸鹽和半胱氨酸鹽替代相同摩爾濃度的谷氨酸和半胱氨酸對(duì)反應(yīng)結(jié)果沒有影響。生產(chǎn)中可使用谷氨酸鹽和半胱氨酸鹽替代谷氨酸和半胱氨酸。
實(shí)施例5使用氨基酸鹽生成谷胱甘肽
在反應(yīng)罐B中，向反應(yīng)體系2中添加5g GSH II，反應(yīng)體系2為添加了底物388g甘氨酸鈉的實(shí)施例2步驟(2)的濾出液1，控制pH恒定為8. 5，溫度為35°C，流加ATP開始反應(yīng)。2. 5小時(shí)后，ATP用量約為1200g。
HPLC檢測GSH的生成量約為8g/L，90%以上ATP轉(zhuǎn)化為ADP (AMP)0 HPLC檢測條件同上述實(shí)施例2中的步驟(I)。
從結(jié)果可以看出使用甘氨酸鹽替代相同摩爾濃度的甘氨酸對(duì)反應(yīng)結(jié)果沒有影響。生產(chǎn)中可使用甘氨酸鹽替代甘氨酸。
實(shí)施例6谷胱甘肽的制備
參見圖1，根據(jù)本發(fā)明制備GSH的工藝流程圖按照如下步驟制備谷胱甘肽
(I)在反應(yīng)罐A中生成Y -谷氨酰半胱氨酸(Y -GluCys)
在反應(yīng)罐A中，100L無菌水的反應(yīng)體系I為含有底物IOOg谷氨酸和IOOg半胱氨酸，以及200g Tris、2200g氯化鉀、60g氯化鈉和200g氯化鎂的溶液，在反應(yīng)體系I中添加 Ig GSH I酶，加氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至10，流加ATP開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH恒定為10， 溫度為60°C。3小時(shí)后，ATP用量約為100g。
HPLC檢測Y-谷氨酰半胱氨酸的生成量約為O. 5g/L，95%以上ATP轉(zhuǎn)化為ADP (AMP)0 HPLC檢測條件同上述實(shí)施例2中的步驟(I)。
(2)在過濾器El中分離GSH I酶
通過超濾方法，將步驟(I)的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液經(jīng)過濾器El的進(jìn)料口至過濾器 El過濾分離GSH I酶，過濾器El內(nèi)裝膜包(購于Pall公司，截留分子量IOkDa),從濾器El 的出料口流出的濾出液I為分離出GSH I酶之后的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液。
(3)在反應(yīng)iig B中生成谷胱;甘妝
在反應(yīng)罐B中，在反應(yīng)體系2中添加Ig GSH II，反應(yīng)體系2為添加了底物IOOg甘氨酸的步驟(2)的濾出液1，控制pH恒定為10，溫度為60°C，流加ATP開始反應(yīng)。2. 5小時(shí)后，ATP用量約為IOOgo
HPLC檢測GSH的生成量約為O. 6g/L，90%以上ATP轉(zhuǎn)化為ADP (AMP)0 HPLC檢測條件同上述步驟(I)。
(4)在過濾器E2中分離GSH II酶
通過超濾方法，將步驟(3)的反應(yīng)體系2的反應(yīng)液經(jīng)過濾器E2的進(jìn)料口至過濾器 E2過濾分離GSH II酶，過濾器E2內(nèi)裝膜包(購于Pall公司，截留分子量IOkDa),從濾器E2 的出料口流出的濾出液2為分離出GSH II酶之后的反應(yīng)體系2的反應(yīng)液。
(5)分離產(chǎn)物谷胱甘肽
使用鹽酸調(diào)節(jié)濾出液2的pH值至3. 0，在離子交換柱中通過DOOl大孔強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(購于天津樹脂廠)，溶液中的GSH、部分氨基酸及陽離子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和AMP。
使用O. 2M NaOH, 0-0. 8M NaCl梯度洗脫GSH，GSH產(chǎn)量共計(jì)55g，收率可達(dá)90%。
(6)在再生罐C中利用ADP和/或AMP再生ATP，并分離生成的ATP
將步驟(5)的穿出液在蒸餾塔中減壓蒸餾濃縮約5倍，至ADP和/或AMP約O. 02M 后，將其含有的ADP和/或AMP在20°C、PH值為9. O的條件下在再生反應(yīng)體系中再生為ATP， 所述再生反應(yīng)體系為20L反應(yīng)液中包含20g葡萄糖、40g氯化鎂、750g氯化鉀、12g氯化鈉、 13. 6ml 85%H3P04和20g干燥處理過的釀酒酵母，加NaOH調(diào)pH至9. O。5小時(shí)后，ATP再生轉(zhuǎn)化率為90%以上。HPLC檢測條件同上述實(shí)施例2中的步驟(6)。
再生的ATP在離心機(jī)中以5000rpm轉(zhuǎn)速通過離心分離。
(7)反應(yīng)罐A中生成Y-谷氨酰半胱氨酸的連續(xù)反應(yīng)，即步驟(I)的連續(xù)反應(yīng)
將步驟(2)中分離出的GSH I酶經(jīng)由過濾器El的回流口添加至反應(yīng)罐A，
將步驟(6)中再生的ATP約IOOg以流加方式添加至反應(yīng)罐A，
添加完分離的GSH I酶之后，將補(bǔ)加的的反應(yīng)體系I經(jīng)由過濾器El的回流口、過濾器E1、和過濾器El的進(jìn)料口添加至反應(yīng)罐A，以便將過濾器El中的膜上吸附的少量GSH I酶反沖至反應(yīng)罐A ;
在60°C、PH為10的條件下進(jìn)行生成Y _谷氨酰半胱氨酸的連續(xù)反應(yīng)；3小時(shí)后， HPLC檢測Y -谷氨酰半胱氨酸的生成量約為O. 5g/L，95%以上ATP轉(zhuǎn)化為ADP(AMP)。HPLC 檢測條件同上述步驟(I)。
該步驟中，ATP以及GSH I酶的循環(huán)利用。GSH I酶循環(huán)反應(yīng)10次后，酶活性約降低25%，需補(bǔ)加25%新酶。
(8)在過濾器El中連續(xù)分離GSH I酶，即步驟(2)的連續(xù)分離
通過超濾方法，從所述步驟(7)的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液中分離出GSH I酶，經(jīng)過濾器El的濾出液I為分離出GSH I酶之后的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液。
(9)反應(yīng)罐B中生成谷胱甘肽的連續(xù)反應(yīng)，即步驟(3)的連續(xù)反應(yīng)
將步驟(4)中分離出的GSH II酶經(jīng)由過濾器E2的回流口添加至反應(yīng)罐B ；
將步驟(6)中再生的ATP約IOOg以流加方式添加至反應(yīng)罐B ；
添加完分離的GSH II酶之后，將反應(yīng)體系2 (為添加了底物l_10g/L甘氨酸的步驟(2)的連續(xù)分離步驟，即步驟(8)的濾出液I)經(jīng)由過濾器E2的回流口、過濾器E2、和過濾器E2的進(jìn)料口添加至反應(yīng)罐B，以便將膜包中吸附的少量GSH II酶反沖至反應(yīng)罐B ;
在60°C、PH為10的條件下進(jìn)行反應(yīng)生成谷胱甘肽的連續(xù)反應(yīng)；2. 5小時(shí)后，HPLC 檢測GSH的生成量約為O. 6g/L，90%以上ATP轉(zhuǎn)化為ADP (AMP)0
在該步驟中，實(shí)現(xiàn)了 ATP以及GSH II的循環(huán)利用。GSH II循環(huán)反應(yīng)10次后，酶活性約降低17%，需補(bǔ)加17%新酶。
(10)在過濾器E2中連續(xù)分離GSH II酶，即步驟(4)的連續(xù)分離
通過超濾方法，從步驟(3)的連續(xù)反應(yīng)步驟，即步驟(9)的反應(yīng)體系2的反應(yīng)液中分離出GSH II酶，經(jīng)過濾器E2的濾出液2為分離出GSH II酶之后的反應(yīng)體系2的反應(yīng)液。
(11)分離產(chǎn)物谷胱甘肽，即步驟(5)的連續(xù)分離
使用鹽酸調(diào)節(jié)步驟(4)的連續(xù)分離步驟，即步驟(10)的濾出液2的pH值至3.0， 在離子交換柱中通過DOOl大孔強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(購于天津樹脂廠)，溶液中的GSH、部分氨基酸及陽離子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物質(zhì)。使用O. 2M NaOH, 0-0. 8M NaCl梯度洗脫GSH，GSH產(chǎn)量共計(jì)54g，收率可達(dá)90%。
重復(fù)步驟(6)至步驟(11) 10次。
實(shí)施例7谷胱甘肽的制備
參見圖1，根據(jù)本發(fā)明制備GSH的工藝流程圖按照如下步驟制備谷胱甘肽
(I)在反應(yīng)罐A中生成Y -谷氨酰半胱氨酸(Y -GluCys)
在反應(yīng)罐A中，100L無菌水的反應(yīng)體系I為含有底物800g谷氨酸和800g半胱氨酸，以及1200g Tris、75g氯化鉀、1750g氯化鈉和2000g氯化鎂的溶液，在反應(yīng)體系I中添加20g GSH I酶，加氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至5，流加ATP開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH恒定為 5，溫度為25°C。3小時(shí)后ATP用量約為2000g。
HPLC檢測Y-谷氨酰半胱氨酸的生成量約為5g/L，50%以上ATP轉(zhuǎn)化為ADP(AMP)。 HPLC檢測條件同上述實(shí)施例2中的步驟(I)。
(2)在過濾器El中分離GSH I酶
通過超濾方法，將步驟(I)的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液經(jīng)過濾器El的進(jìn)料口至過濾器 El過濾分離GSH I酶，過濾器El內(nèi)裝膜包(購于Pall公司，截留分子量IOkDa),從濾器El 的出料口流出的濾出液I為分離出GSH I酶之后的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液。
(3)在反應(yīng)iig B中生成谷胱；甘妝
在反應(yīng)罐B中，在反應(yīng)體系2中添加20g GSH II，反應(yīng)體系2為添加了底物IOOOg 甘氨酸的步驟(2)的濾出液1，控制pH恒定為5，溫度為25°C，流加ATP開始反應(yīng)。2. 5小時(shí)后，ATP用量約為2000g。
HPLC檢測GSH的生成量約為6. 5g/L，55%以上ATP轉(zhuǎn)化為ADP (AMP)0 HPLC檢測條件同上述步驟(I)。
(4)在過濾器E2中分離GSH II酶
通過超濾方法，將步驟(3)的反應(yīng)體系2的反應(yīng)液經(jīng)過濾器E2的進(jìn)料口至過濾器 E2過濾分離GSH II酶，過濾器E2內(nèi)裝膜包(購于Pall公司，截留分子量IOkDa),從濾器E2 的出料口流出的濾出液2為分離出GSH II酶之后的反應(yīng)體系2的反應(yīng)液。
(5)分離產(chǎn)物谷胱甘肽
使用鹽酸調(diào)節(jié)濾出液2的pH值至3. 0，在離子交換柱中通過DOOl大孔強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(購于天津樹脂廠)，溶液中的GSH、部分氨基酸及陽離子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物質(zhì)。
使用O. 2M NaOH, 0-0. 8M NaCl梯度洗脫GSH，GSH產(chǎn)量共計(jì)600g，收率可達(dá)90%。
(6)在再生罐C中利用ADP和/或AMP再生ATP，并分離生成的ATP
將步驟(5)的穿出液在蒸餾塔中減壓蒸餾濃縮約5倍，至ATP、ADP和/或AMP約 O. 4M后，將其含有的ADP和/或AMP在50°C、PH值為4. O的條件下在再生反應(yīng)體系中再生為ATP，所述再生反應(yīng)體系為20L無菌水中包含1200g葡萄糖、400g氯化鎂、15g氯化鉀、 1200g氯化鈉、680ml 85%H3P04和1200g干燥處理過的釀酒酵母，加NaOH調(diào)pH至4. O。3小時(shí)后，ATP再生轉(zhuǎn)化率為85%以上。HPLC檢測條件同上述實(shí)施例2中的步驟(6)。
再生的ATP在離心機(jī)中以5000rpm轉(zhuǎn)速通過離心分離。
(7)反應(yīng)罐A中生成Y-谷氨酰半胱氨酸的連續(xù)反應(yīng)，即步驟(I)的連續(xù)反應(yīng)
將步驟(2)中分離出的GSH I酶經(jīng)由過濾器El的回流口添加至反應(yīng)罐A，
將步驟(6)中再生的ATP約2000g以流加方式添加至反應(yīng)罐A，
添加完分離的GSH I酶之后，將補(bǔ)加的的反應(yīng)體系I經(jīng)由過濾器El的回流口、過濾器E1、和過濾器El的進(jìn)料口添加至反應(yīng)罐A，以便將過濾器El中的膜上吸附的少量GSH I酶反沖至反應(yīng)罐A ;
在25V、PH為5的條件下進(jìn)行生成Y _谷氨酰半胱氨酸的連續(xù)反應(yīng)；3小時(shí)后， HPLC檢測Y-谷氨酰半胱氨酸的生成量約為5g/L，50%以上ATP轉(zhuǎn)化為ADP (AMP)0 HPLC 檢測條件同上述步驟(I)。
該步驟中，ATP以及GSH I酶的循環(huán)利用。GSH I酶循環(huán)反應(yīng)10次后，酶活性約降低16%，需補(bǔ)加16%新酶。
(8)在過濾器El中連續(xù)分離GSH I酶，即步驟(2)的連續(xù)分離
通過超濾方法，從所述步驟(7)的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液中分離出GSH I酶，經(jīng)過濾器El的濾出液I為分離出GSH I酶之后的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液。
(9)反應(yīng)罐B中生成谷胱甘肽的連續(xù)反應(yīng)，即步驟(3)的連續(xù)反應(yīng)
將步驟(4)中分離出的GSH II酶經(jīng)由過濾器E2的回流口添加至反應(yīng)罐B ；
將步驟(6)中再生ATP約2000g以流加方式添加至反應(yīng)罐B ；
添加完分離的GSH II酶之后，將反應(yīng)體系2 (為添加了底物l_10g/L甘氨酸的步驟(2)的連續(xù)分離步驟，即步驟(8)的濾出液I)經(jīng)由過濾器E2的回流口、過濾器E2、和過濾器E2的進(jìn)料口添加至反應(yīng)罐B，以便將膜包中吸附的少量GSH II酶反沖至反應(yīng)罐B ;
在25°C、PH為5的條件下進(jìn)行反應(yīng)生成谷胱甘肽的連續(xù)反應(yīng)；2. 5小時(shí)后，HPLC檢測GSH的生成量約為6. 6g/L，55%以上ATP轉(zhuǎn)化為ADP (AMP)0
在該步驟中，實(shí)現(xiàn)了 ATP以及GSH II的循環(huán)利用。GSH II循環(huán)反應(yīng)10次后，酶活性約降低13%，需補(bǔ)加13%新酶。
(10)在過濾器E2中連續(xù)分離GSH II酶，即步驟(4)的連續(xù)分離
通過超濾方法，從步驟(3)的連續(xù)反應(yīng)步驟，即步驟(9)的反應(yīng)體系2的反應(yīng)液中分離出GSH II酶，經(jīng)過濾器E2的濾出液2為分離出GSH II酶之后的反應(yīng)體系2的反應(yīng)液。
(11)分離產(chǎn)物谷胱甘肽，即步驟(5)的連續(xù)分離
使用鹽酸調(diào)節(jié)步驟(4)的連續(xù)分離步驟，即步驟(10)的濾出液2的pH值至3. 0，在離子交換柱中通過DOOl大孔強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(購于天津樹脂廠)，溶液中的GSH、部分氨基酸及陽離子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物質(zhì)。使用O. 2M NaOH, 0-0. 8M NaCl梯度洗脫GSH，GSH產(chǎn)量共計(jì)600g，收率可達(dá)90%。
重復(fù)步驟(6)至步驟(11) 9次。
對(duì)比例I
在100L無菌水中，加入600g谷氨酸、400g半胱氨酸、300g甘氨酸、600g Tris, IlOOg氯化鉀、870g氯化鈉、800g氯化鎂，加氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至8. 5，加入5g GSH I、5g GSH II，流加ATP開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH恒定為8. 5，溫度為37°C。3小時(shí)后，ATP用量約為2400g，HPLC檢測GSH的生成量約為2. 5g/L，共計(jì)600g，30%以上ATP轉(zhuǎn)化為ADP (AMP), HPLC檢測條件同上述實(shí)施例2中步驟(I)。
從對(duì)比例I可以看出，由于GSH I與GSH II反應(yīng)條件例如溫度、時(shí)間等略有不同， 以及GSH對(duì)GSH I的抑制作用，兩種酶放在一起催化底物生成GSH的產(chǎn)量低于本發(fā)明方法中將兩種酶分開反應(yīng)的產(chǎn)量。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)能理解，在實(shí)際應(yīng)用中，在本發(fā)明的啟示下，其他人員也可能作出與本發(fā)明相似的設(shè)計(jì)或?qū)Ρ景l(fā)明進(jìn)行一些添加或改變。特別需要指出的是，只要不脫離本發(fā)明的設(shè)計(jì)宗旨，所有顯而易見的改變以及具有等同替換的相似設(shè)計(jì)，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.ー種酶法制備谷胱甘肽的方法，包括以下步驟 (1)在反應(yīng)罐A中生成Y-谷氨酰半胱氨酸； (2)在過濾器El中分離GSHI酶； (3)在反應(yīng)B中生成谷胱;甘妝； (4)在過濾器Ε2中分離GSHII酶；以及 (5)分離產(chǎn)物GSH。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，進(jìn)ー步包括以下步驟 (6)在再生罐C中利用ADP和/或AMP再生ΑΤΡ，并分離生成的ΑΤΡ。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，進(jìn)ー步包括以下步驟 (7)所述步驟(2)中分離的GSHI酶的循環(huán)利用，即將分離的GSH I酶添加至反應(yīng)罐A中生成Y-谷氨酰半胱氨酸的連續(xù)反應(yīng)；以及 (8)GSH I酶的連續(xù)分離，即在過濾器El中連續(xù)分離GSH I酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)ー步包括以下步驟 (9)所述步驟(4)中分離的GSHII酶的循環(huán)利用，即將分離的GSH II酶添加至反應(yīng)罐B中生成谷胱甘肽的連續(xù)反應(yīng)；以及 (10)GSHII酶的連續(xù)分離，即在過濾器Ε2中連續(xù)分離GSH II酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)ー步包括以下步驟 (11)產(chǎn)物GSH的連續(xù)分離。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，循環(huán)利用GSHI酶和GSH II酶、以及再生ATP至少ー次，即重復(fù)所述步驟(6)至所述步驟(11)至少一次，優(yōu)選重復(fù)多次，例如重復(fù)2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50 次等。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法，在反應(yīng)罐A中生成Y-谷氨酰半胱氨酸的反應(yīng)如下 反應(yīng)溫度為25-60°C，優(yōu)選30-55°C，更優(yōu)選35_50°C，最優(yōu)選37-45°C ； 反應(yīng)PH為5-10，優(yōu)選6-10，更優(yōu)選7-9的條件下； 反應(yīng)體系I為含有底物谷氨酸或其鹽和半胱氨酸或其鹽、以及鎂離子、鉀離子、鈉離子和Tris的水溶液； 在反應(yīng)體系I中添加ATP和GSH I酶，或者添加再生的ATP和分離的GSHI酶，反應(yīng)ー段時(shí)間生成Y-谷氨酰半胱氨酸； 其中所述鎂離子源自氯化鎂、硫酸鎂、亞硫酸鎂或硝酸鎂中的ー種或多種；所述鉀離子源自氯化鉀、硫酸鉀、硝酸鉀、氫氧化鉀、亞硫酸鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、醋酸鉀或檸檬酸鉀中的ー種或多種；所述鈉離子源自氯化鈉、硫酸鈉、硝酸鈉、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、醋酸鈉或檸檬酸鈉中的ー種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法，在反應(yīng)罐B中生成谷胱甘肽的反應(yīng)如下 反應(yīng)溫度為25-60°C，優(yōu)選30-55°C，更優(yōu)選35_50°C，最優(yōu)選37-45°C ； 反應(yīng)PH為5-10，優(yōu)選6-10，更優(yōu)選7-9的條件下； 反應(yīng)體系2為添加了底物甘氨酸或其鹽的所述步驟(2)的濾出液I ; 在反應(yīng)體系2中添加ATP和GSH II酶，或者添加再生的ATP和分離的GSHII酶，反應(yīng)一段時(shí)間生成谷胱甘肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)所述的方法，在再生罐C中的再生反應(yīng)如下 反應(yīng)溫度為25-50°C，優(yōu)選25-40°C ； 反應(yīng)PH為4-9，優(yōu)選5-8 ； 再生反應(yīng)體系為包含葡萄糖、酵母、鎂離子、鉀離子、鈉離子和磷酸根離子的水溶液； 向再生罐C中添加的ADP和/或AMP為所述步驟(5)分離出產(chǎn)物GSH之后的反應(yīng)液的濃縮液； 在再生罐C反應(yīng)一段時(shí)間生成再生的ATP，再生的ATP通過離心或過濾方法分離； 其中所述酵母選自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和/或畢赤酵母(Pichiapastori s )，所述磷酸根離子源自磷酸、磷酸ニ氫鈉、磷酸氫ニ鈉、磷酸ニ氫鉀、磷酸氫ニ鉀或磷酸鈉或磷酸鉀中的ー種或多種。
10.根據(jù)權(quán)利要求3-9任一項(xiàng)所述的方法，過濾器El或E2具有進(jìn)料ロ、出料口和回流ロ，內(nèi)設(shè)過濾膜，在循環(huán)利用GSH I酶或GSH II酶時(shí)，反應(yīng)體系通過過濾器El或E2添加至反應(yīng)罐的方式如下 向反應(yīng)罐A或反應(yīng)罐B中添加完分離的GSH I酶或GSH II酶之后，將補(bǔ)加的反應(yīng)體系I的反應(yīng)液或反應(yīng)體系2的反應(yīng)液經(jīng)過濾器El或過濾器E2的回流ロ、過濾器El或E2、和過濾器El或E2的進(jìn)料ロ添加至反應(yīng)罐A或反應(yīng)罐B。
全文摘要
本發(fā)明提供一種酶法制備谷胱甘肽(GSH)的方法，該方法將合成GSH的兩步反應(yīng)，即生成γ-谷氨酰半胱氨酸的反應(yīng)和生成GSH的反應(yīng)，分別在不同的反應(yīng)罐中進(jìn)行，并且每步反應(yīng)之后都分離出反應(yīng)使用的酶即γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH-I)和谷胱甘肽合成酶(GSH-II)，使得GSH I和GSH II兩種酶的酶活力得到最大程度利用，降低了兩種酶促反應(yīng)之間的相互抑制。本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了GSH I和GSH II的循環(huán)利用，并且使用了適合制備GSH的反應(yīng)所需的ATP再生系統(tǒng)，降低了制備GSH的生產(chǎn)成本，提高了GSH產(chǎn)率，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)效益顯著。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102978267SQ20121020169
公開日2013年3月20日 申請日期2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月15日
發(fā)明者劉珊珊, 秦永發(fā) 申請人:北京天開易達(dá)生物科技有限公司