專利名稱：Rosea 1和Delila作為篩選標記在菊花轉基因育種中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種菊花可視標記基因Rosea I和Delila在菊花轉基因育種中的應用。
背景技術：
菊花是我國的傳統名花，具有重要的觀賞價值和經濟價值。目前轉基因工程技術由于其巨大的優越性，正成為觀賞植物育種的重要手段。但是在遺傳轉化過程中，使用的標記基因會產生潛在的生態環境和食品安全性問題，因此使用安全標記基因或去除選擇標記已成為基因工程育種的重要目標和發展趨勢。
標記基因的安全性問題是近年來國際上關注的熱點，截止目前解決轉基因植物安全性的主要策略有兩種1、開發使用無爭議的生物安全標記基因或對抗性基因標記進行一定修飾；2、在轉化時仍使用傳統的抗性標記基因，但獲得轉基因植株后再將其去除。目前，利用無爭議的生物安全標記基因是提高標記基因的安全性最為有效的辦法，是基因工程發展的必然趨勢(王永飛，2004)。與常規標記基因相比，生物安全標記基因沒有抗生素或除草劑抗性，相對來說對生物是安全的，目前有應用前景的安全標記基因可以分成兩大類負向選擇系統和正選擇系統，主要包括化合物解毒酶基因、糖類代謝酶基因、激素代謝酶基因、報告基因等。去除轉基因植物中標記基因的方法主要有共轉化法、位點特異重組酶系統、轉座子法、多元自主轉化載體系統和同源重組等方法。花青素可視標記基因屬于生物安全標記基因。花青素代謝調節基因導入植物細胞之后，細胞可能變成紅色，無需進行組織化學測試而殺死植物組織，用一般的解剖鏡甚至肉眼即可觀測，在眾多的植物遺傳轉化報告基因中是最方便的一種。目前，這些基因已被廣泛應用到單子葉植物遺傳轉化條件的優化上。單立波等(2009)研究了玉米花色素苷合成調節基因Cl-R在小麥幼胚、玉米愈傷組織、水稻愈傷組織、煙草葉片中的瞬時表達情況。由于調節基因Cl-R激活了植物體細胞內花色素苷的合成，因此不需任何生色底物，即可活體觀察到花素苷的表達。結果表明，對于小麥、水稻、玉米，槍擊48小時后，放大2倍便可見紅色斑點，且其表達強度遠高于⑶S的表達，證明Cl-R基因可以作為一個很好的衡量打槍效果的指示，同時還證明其在雙子葉植物煙草葉片的基因槍轉化瞬時表達體系中也起同樣的作用。目前對于植物花青素的時空合成機制已有深入的研究，不同植物中的花青素生物合成受兩類基因的控制一類是結構基因，編碼合成代謝中的酶類；另一類是調節基因，調節結構基因的表達強度和程式。在花青素合成途徑中，調節基因影響著結構基因的表達方式和表達強度，每一步酶促反應均是調節基因作用的靶位點。目前植物中已分離和鑒定了 3類花青素合成的轉錄因子(Ramsay and Glover, 2005): (I) R2R3-MYB 蛋白；(2) MYC 家族的 bHLH 蛋白；(3)WD40蛋白。利用轉座子標簽等技術現已從金魚草、玉米、矮牽牛、紫蘇和擬南芥等多種植物中分離出相應的調節基因(劉仕蕓等，2006):如屬于MYB型的玉米cl/pl基因，矮牽牛an2、an4基因，金魚草roseal/2、venosa基因；bHLH型的玉米r/b基因、ini基因，紫蘇myc_rp/gp、mycf3gl基因，金魚草Delila, mutabilis基因；WD40型的矮牽牛anil基因、紫蘇pfwd基因、擬南芥ttgl等。研究表明，多數調節基因對花青素途徑的調控是在結構基因轉錄水平上的調控，并且多數的調控是轉錄激活，只有少數幾種調節基因為轉錄抑制調控。金魚草中3個調控基因Deli la、eluta和rosea主要對花青素合成途徑的后階段起調節作用，而對早期CHS和CHI階段表現微量調控(Martin et al.，1991)。
隨著轉基因工程中抗生素標記基因帶來的問題，目前研究安全標記基因成為人們解決這一問題的主要方法。因此尋求安全標記基因成為轉基因工程的熱點和難點。花青素可視標記的應用為安全轉基因提供了一種新的方法。

發明內容
為了解決上述問題，本發明的目的在于提供Rosea I和Delila作為篩選標記在菊花轉基因育種中的應用。本發明提供的Rosea I和Delila作為篩選標記在菊花轉基因育種中的應用，具體是將金魚草的花青素調節基因Rosea I和Delila共轉化到菊花中，與未轉化的對照相比，出現花青素積累或花青素積累量增加的即可初步判斷為轉基因陽性植株。在一個實施方案中，Rosea I基因的啟動子為擬南芥根部特異性啟動子ATH-root,Delila基因的啟動子為組成型35S啟動子。莖部出現花青素積累或花青素積累量增加的即可初步判斷為轉基因陽性植株。其中，所述的菊花為地被菊‘地毯粉’。本發明還提供一種菊花轉基因的方法。本發明提供的菊花轉基因的方法，其為通過農桿菌介導的方法將金魚草花青素調節基因Rosea I和Delila共轉化到菊花中。其中，所述的Rosea I基因的啟動子為擬南芥根部特異性啟動子ATH-root，Delila基因的啟動子為組成型35S啟動子。其中，所述的菊花為地被菊‘地毯粉’。本發明通過將外源基因Rosea I和Delila整合進菊花基因組，轉基因植物莖部在自然條件下出現明顯紫紅色，與對照有明顯差異。而且表型觀察與分子鑒定的符合率為75%，表明Rosea I和Delila可以作為菊花轉基因工程中的安全標記基因，避免抗生素等標記基因對生態環境產生危害。


圖I所示為質粒pJAM-root-Ros/DEL載體構建流程。圖2 所示為質粒 pJAM-root-Ros/DEL 的 PCR 鑒定。圖3所示為轉基因植株的PCR鑒定。M，Marker DL15000 ；1為陰性對照水；2_3為陽性對照質粒；4為陰性對照植株；5-8為pJAM-root-Ros/Del轉化陽性植株。圖4所示為轉基因植株的Southern檢測。I為陰性對照水；2_3為陽性對照質粒；4為陰性對照質粒；5-8為pJAM-root-Ros/Del轉化陽性植株。圖5所示為對目的基因Delila的表達進行了 RT-PCR檢測。M，Marker DL15000 ；I為陰性對照水；2為陽性對照質粒；3為陰性對照植株；4-5為pJAM-root-Ros/Del轉化陽性植株。圖6所示為轉Roseal/Delila基因菊花莖段。A、B為對照植株；C、D為轉化植株。圖7所示為轉Roseal/Delila基因菊花不同時期莖段圖片。A、B為移栽植株；C、D為組培苗。
權利要求
1.Rosea I和Delila作為篩選標記在菊花轉基因育種中的應用。
2.如權利要求I所述的應用，其特征在于，將金魚草的花青素調節基因RoseaI和Delila共轉化到菊花中，與未轉化的對照相比，出現花青素積累或花青素積累量增加的即可初步判斷為轉基因陽性植株。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的RoseaI基因的啟動子為擬南芥根部特異性啟動子ATH-root，莖部出現花青素積累或花青素積累量增加的即可初步判斷為轉基因陽性植株。
4.如權利要求f3任一項所述的應用，其特征在于，所述的菊花為地被菊‘地毯粉’。
5.一種菊花轉基因的方法，其特征在于，通過農桿菌介導的方法將金魚草花青素調節基因Rosea I和Delila共轉化到菊花中。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的RoseaI基因的啟動子為擬南芥根部特異性啟動子ATH-root。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述的菊花為地被菊‘地毯粉’。
全文摘要
本發明涉及金魚草花青素調節基因Rosea 1和Delila在菊花轉基因育種中的應用。Rosea 1和Delila基因轉入菊花后可在菊花莖中產生可視標記，從而區別轉基因與非轉基因植株。在菊花轉基因工程中可以用該基因代替抗生素標記基因，避免抗生素等標記基因對生態環境產生危害。
文檔編號C12N15/29GK102719450SQ20121020191
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月15日 優先權日2011年6月17日
發明者張啟翔, 張秀海, 王葉, 石少川, 程堂仁, 高亦珂 申請人:北京林業大學