專利名稱：霍亂弧菌(vc)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及致病菌的生物檢測技術，具體涉及將特異性靶標捕獲技術和實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術結合的霍亂弧菌(VC)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測中使用的引物、探針及相關試劑盒。
背景技術：
霍亂弧菌(V. cholera)是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表現為劇烈的嘔吐，腹瀉，失水，死亡率甚 高，屬于國際檢疫傳染病。人類在自然情況下是霍亂弧菌的唯一易感者，主要通過污染的水源或食物尤其是水產品經口感染。近年來隨著國家貿易全球化的不斷加劇，我國的進出口貿易逐年增長。而在進口的食品中，出現問題最多的是鮮活或冰凍的水產品。例如，2005年和2006年進口水產品中副溶血性弧菌的檢出率為9%左右，霍亂弧菌的檢出率為2% 3%,其他的弧菌如創傷弧菌等也時有檢出。而且我國長期以來所形成的飲食習慣，對一些水產品如龍蝦、象拔蛘和三文魚等一般生吃，從而對消費者的健康造成潛在威脅，所以有必要加強對水產品中常見致病性弧菌的檢測。霍亂弧菌包含多種毒力相關因子，其中霍亂毒素(CT)是其主要的致病因子。自環境中分離出的霍亂弧菌多數不產生CT。01群和0139群霍亂弧菌是引起疾病發生的兩種主要血清型，另外，近年來的研究顯示部分非01、非0139的霍亂弧菌也可以產生CT。因此，分離鑒定食品中的霍亂弧菌對保護人民健康，保障水產品的安全具有重要的意義。目前常用的霍亂弧菌檢測方法包括1)傳統的培養方法。總體可分為4個階段或步驟。預增菌，選擇性增菌，分離，生化鑒定。需要4 7天，才能得出明確的診斷結果。2)免疫標記技術。利用抗原抗體的特異性反應，并結合一些生物化學或物理學方法進行檢測，但該方法的靈敏度和特異性均較差。3)分子生物學檢測方法。目前有PCR技術，實時熒光定量PCR和LAMP方法。以上幾種方法易引起擴增物的污染，常造成實驗結果的假陽性或假陰性現象，并且不能區分活菌和死菌，阻礙了其大規模推廣使用。實時突光核酸恒溫擴增檢測技術(SimultaneousAmplification and Testing,簡稱SAT)是一種直接快速檢測RNA的方法，與檢測DNA的實時熒光PCR相比，不同之處，前者檢測體系多了一個逆轉錄反應的步驟，核酸擴增在一個溫度下進行(42°C )，無需熱循環。采用M-MLV逆轉錄酶和I7RNA多聚酶進行核酸擴增，相對于其它核酸擴增技術，反應抑制物更少，能有效減少假陰性結果。然而，SAT技術在不同種類致病菌的檢測中應用所面臨的問題各不相同，需要具體分析致病菌的特性進行專門設計。目前尚無針對霍亂弧菌(VC)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術的研究報道。

發明內容
為解決現有的霍亂弧菌(VC)檢測方法靈敏度較低，檢測周期長、易引起擴增物的污染造成實驗結果的假陽性或假陰性以及檢測成本較高的問題，本發明提供了一種檢測周期短、高靈敏度、高特異性、低污染、反應穩定以及檢測成本低、易于推廣應用的霍亂弧菌(VC)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術，包括專用引物、探針、試劑盒及其使用。本發明所提供的霍亂弧菌(VC)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，包含有一條捕獲探針，一對用于在M-MLV反轉錄酶作用下產生VC靶標核酸(VC RNA)的DNA拷貝的VC檢測引物17和nT7，和一條用于與在I7RNA聚合酶作用下根據所述VC靶標核酸(VC RNA)的DNA拷貝產生的RNA拷貝特異結合的VC檢測探針。所述捕獲探針可與如序列表中序列I所示的霍亂弧菌(VC)的靶標核酸(VC RNA)序列特異結合，在有VC內標(VC IC RNA)時，其最好還可與該VC內標序列特異結合，所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述VC檢測引物由T7引物和n!7引物組成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述VC檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標記FAM熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團。進一步，所述試劑盒還包含有M-MLV反轉錄酶和I7RNA聚合酶，所述M-MLV反轉錄 酶和I7RNA聚合酶存在于一 SAT酶液中，所述捕獲探針存在于一核酸提取液中，所述17弓丨物、nT7引物和VC檢測探針存在于一 VC檢測液中。再進一步所述試劑盒還包含有VC內標和內標檢測探針；所述VC內標為競爭性內標，可與捕獲探針特異性結合，并與VC靶標核苷酸(VC RNA)使用同一對引物(17和nT7)，VC內標由序列表中序列7所示的VC IC RNA ;所述內標檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示,5’端標記HEX突光基團,3’端標記DABCYL淬滅基團，且所述內標檢測探針存在于VC檢測液中。更進一步，所述試劑盒包含裂解液、核酸提取液、洗滌液、VC反應液、VC檢測液、SAT酶液、VC陽性對照、VC陰性對照和VC內標，其中裂解液含硫酸銨((NH4) 2S04)和HEPES ；核酸提取液含捕獲探針和磁珠；洗滌液含NaCl和SDS ；VC 反應液含 dNTP 和 NTP ；VC檢測液含T7引物、nT7引物、VC檢測探針和內標檢測探針；SAT酶液含M-MLV反轉錄酶、T7 RNA聚合酶；VC陽性對照；含霍亂弧菌(VC) toxR基因的體外轉錄RNA稀釋物；VC陰性對照不含有霍亂弧菌(VC)靶標核酸(VC RNA)序列或不含有霍亂弧菌的溶液,如生理鹽水；VC內標含VC內標RNA(序列如序列表中序列I所示)稀釋物。具體的，所述試劑盒中一個反應單位中上述各種試劑組成如下(I)裂解液HEPES 25-250mM, (NH4) 2S045_50mM ;(2)核酸提取液HEPES 50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400-2000mM，捕獲探針1-50 u M (優選為 5-25 u M)，磁珠 50-500mg/L (優選為 50-250mg/L)；(3)洗滌液HEPES 5_50mM，NaCl 50-500Mm, 1% SDS, EDTA I-IOmM ；(4) VC 反應液Tris 10_50mM, MgCl2 10_40mM，dNTP 0. I-IOmM(優選為 0. 5_5mM)，NTP l-20mM(優選為 1-lOmM)，PVP40 1-10%, KCl 5-40mM ；
(5)VC檢測液將VC檢測引物和VC檢測探針溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImMEDTA的混合液)中配制而成，各引物和探針濃度在5-15pmol/反應均可；其中17引物濃度優選為12. 5pmol/反應，n!7引物濃度優選為12. 5pmol/反應，VC檢測探針濃度優選為5pmol/反應’內標檢測探針濃度優選為5pmol/反應；(6) SAT 酶液=M-MLV 反轉錄酶 400-4000U/ 反應(優選為 500-1500U/ 反應)、T7 RNA 聚合酶 200-2000U/ 反應(優選為 500-1000U/ 反應)、2_10mM HEPES pH7. 5、10-100mMN-acetyl-L_cysteine、0. 04-0. 4mM zinc acetate、IO-IOOmM trehalose、40-200mMTris-HCl pH8. 0、40_200mM KC1、0. 01-0. 5mM EDTA、0. 1-1% (v/v) Triton X-100和 20-50% (v/v) glycerol ；(7) VC陽性對照；含IO5-IO8拷貝/mL霍亂弧菌(VC) toxR的體外轉錄RNA稀釋物；
⑶VC陰性對照不含有霍亂弧菌(VC)靶標核酸(VC RNA)序列或不含有霍亂弧菌的溶液；(9) VC內標含IO5-IO8拷貝/mL VC IC RNA (序列如序列表中序列7所示)體外轉錄RNA稀釋物。另一種更具體形式，所述試劑盒由A盒即標本處理單元和B盒即核酸擴增檢測單元組成，其中A盒包裝所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌液，B盒包裝所述VC反應液、VC檢測液、SAT酶液、VC陽性對照、VC陰性對照及VC內標。所述VC陽性對照中的體外轉錄的VC RNA以下述方法制備I)用化學合成法合成VC toxR中無二級結構且高度保守區段作為擴增靶序列區域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；2)將片段克隆到pGEM -T載體中，構建VC陽性對照質粒；3) VC陽性對照質粒轉化到大腸桿菌DH5 a中，命名為pGEM -T-VC菌株，貯存于-70。。4)從pGEM -T-VC菌株中提取pGEM -T-VC質粒，將質粒進行轉錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定RNA。所述VC內標中的體外轉錄的VC IC RNA以下述方法制備I)用化學合成法合成一段除探針檢測區域序列不同，其他序列基本同VC靶標序列區域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；2)將片段克隆至ljpGEM -T載體中，構建VC內標質粒；3)VC內標質粒轉化到大腸桿菌DH5a中，命名為pGEM _T_VC IC菌株，貯存于-70。。； 4)從pGEM -T-VC IC菌株中提取pGEM -T-VC IC質粒，將質粒進行轉錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定內標RNA。所述霍亂弧菌(VC)實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒中的專用試劑，為以下表示的物質之一(I)可與序列表中序列I所示的霍亂弧菌(VC)的靶標核酸(VC RNA)序列特異結合的捕獲探針(TCO,Target Capture Oligo),所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示；(2)用于在M-MLV反轉錄酶作用下產生VC靶標核酸(VC RNA)的DNA拷貝的VC檢測引物17和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；(3)用于與在I7RNA聚合酶作用下根據所述VC靶標核酸(VC RNA)的DNA拷貝產生的RNA拷貝特異結合的VC檢測探針，所述VC檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標記FAM熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團；(4)內標和內標檢測探針，內標為VC核苷酸序列(VC RNA)的競爭性內標，可與捕獲探針特異性結合，并使用同一對引物(T7和n!7引物)，內標的核苷酸序列如序列表中序列7所示VC IC RNA,內標檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標記HEX熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團。所述試劑盒的使用方法，用于霍亂弧菌(VC)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測，包括以下操作
I)用裂解液裂解待測樣品中的霍亂弧菌(VC)，得到含有霍亂弧菌(VC)核酸的裂解液；2)向步驟I)的裂解液中加入核酸提取液，試劑盒內存在VC內標時，同時加入VC內標，使捕獲探針與靶標或內標核酸特異結合后再與磁珠結合，用洗滌液洗滌，除去未與磁珠結合的核酸，得到霍亂弧菌(VC)的核酸(RNA)和VC IC RNA ；3)將步驟2)提取的霍亂弧菌(VC)的核酸(RNA)和VC IC RNA加入由VC反應液和VC檢測液組成的第一階段反應物中，在60°C下溫育10分鐘后，再在42°C下溫育5分鐘，然后加入第二階段酶反應物SAT酶液，由此開始在42°C下繼續溫育50分鐘，用檢測儀同步記錄熒光信號的變化；所述第一階段反應物與第二階段酶反應物的體積比為3 I ；4)根據熒光信號產生的時間和強度參照VC陽性對照、VC陰性對照和VC內標檢測結果對待測樣品進行定性檢測。本發明提供了一種霍亂弧菌(VC)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，使用該試劑盒進行檢測，與現有的VC檢測相比，具有以下優點(I)高特異性、高純度、低污染針對VC靶核酸設計的優選捕獲探針，可高效、特異性捕獲VC的RNA。同時，由于采取封閉式的恒溫放大檢測系統，整個過程中無需打開反應體系，因而避免了擴增子的污染。(2)快速檢測將核酸的擴增與檢測在同一封閉體系中同步進行，而且整個過程中沒有溫度的升降及循環，因而所需時間大大縮短，擴增檢測只需要50分鐘。(3)污染易控與實時熒光PCR相比，本發明的擴增產物是RNA，RNA在自然界中極易降解，所以污染控制較容易。(4)設備簡單，成本低與實時熒光定量PCR相比，本發明所用的儀器無需升降溫循環，因而設計和生產成本大幅降低。綜上所述，本發明試劑盒能夠檢測食品中的VC RNA，具有特異性高、靈敏度高(可達100CFU/ml)、污染低(擴增產物RNA在自然環境下易于降解)及快速檢測(50分鐘完成擴增檢測)的特點，將在霍亂弧菌快速檢測中發揮重要作用，應用前景廣闊。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。


圖I顯示靈敏度的檢測結果圖2顯示陰性特異性參考品的檢測結果圖3為食品樣本的靶標熒光檢測結果圖4為食品樣本的內標熒光檢測結果
具體實施例方式本發明霍亂弧菌(VC)檢測技術，將特異性靶標捕獲技術與實時熒光核酸恒溫擴增(SAT)技術結合而形成。由于霍亂弧菌包括的亞型較多，如常見的01、0139，所以要覆蓋如此多的亞型，在 檢測靶標的選擇上就必須考慮試劑盒對各亞型檢測的通用性，因此必須選擇在各個亞型之間保守性較強的基因作為檢測靶標。霍亂弧菌各亞型之間保守性強的基因為toxR，因此本發明的發明人通過研究分析確定了 toxR上一段保守性強的序列作為檢測靶標。本發明通過設計專用的捕獲探針，高效、特異性捕獲VC的RNA;核酸擴增使用M-MLV反轉錄酶和17 RNA多聚酶來同時實現，反轉錄酶用于產生靶標核酸RNA的一個DNA拷貝，17 RNA多聚酶從DNA拷貝上產生多個RNA拷貝，帶有熒光標記的優化檢測探針和擴增后產生的RNA拷貝特異結合，從而產生熒光，該熒光信號可由檢測儀器捕獲。本發明中的專用引物和探針包括(I)捕獲探針一條可與序列表中序列I所示的霍亂弧菌(VC)的靶標核酸(VCRNA)序列特異結合的捕獲探針(TCO，Target Capture Oligo)，在有VC內標(VC IC RNA)時，其還可與該VC內標序列特異結合；所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示。(2) VC檢測引物一對用于在M-MLV反轉錄酶作用下產生VC靶標核酸(VC RNA)的DNA拷貝的VC檢測引物，所述VC檢測引物由T7引物和nT7引物組成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；(3) VC檢測探針一條用于與在I7RNA聚合酶作用下根據所述VC靶標核酸(VCRNA)的DNA拷貝產生的RNA拷貝特異結合的VC檢測探針，所述VC檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端用FAM熒光標記，3’端用DABCYL熒光標記。為便于進行結果分析，還包括(4) 一條內標檢測探針和VC內標，內標檢測探針為在使用VC內標時與該內標配合使用的內標檢測探針，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標記HEX熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團；VC內標為VC核苷酸序列(VC RNA)的競爭性內標，同時與所述捕獲探針特異性結合，并使用同一對引物CT7和n!7引物)。VC內標的核苷酸序列如序列表中序列7所示，命名為VC IC RNAdC含義為內標)。基于以上設計，本發明進一步提供一種霍亂弧菌(VC)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒。該試劑盒，至少包含所述捕獲探針(序列2)，一對所述T7引物(序列3)和n!7引物(序列4)，以及一條所述VC檢測探針(序列5)。進一步，所述試劑盒還可包含有M-MLV反轉錄酶和I7RNA聚合酶，所述M-MLV反轉錄酶和I7RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕獲探針存在于核酸提取液中，所述17引物、nT7引物和VC檢測探針存在于VC檢測液中。再進一步，所述試劑盒還可包含競爭性VC內標(序列7)和內標檢測探針(序列6)，所述的內標檢測探針存在于VC檢測液中。更具體來講，所述試劑盒包含裂解液、核酸提取液、洗滌液、VC反應液、VC檢測液、SAT酶液、VC陽性對照、VC陰性對照和VC內標，各組分說明如下(I)裂解液用于裂解和保存待測樣品中的霍亂弧菌(VC)，為含有去垢劑和HEPES緩沖液的溶液，去垢劑主要為硫酸銨((NH4)2S04，優選為5-50mM)；
(2)核酸提取液用于提取和純化VC菌體RNA，為含捕獲探針1-50 iiM(優選為5-25 u M)和磁珠50-500mg/L(優選為50_250mg/L)的水溶液；(3)洗滌液用于磁珠清洗，為含Iwt % SDS的水溶液。(4) VC反應液SAT擴增所需組分，含dNTP 0. I-IOmM(優選為0. 5_5mM)和NTPl-20mM(優選為I-IOmM)的水溶液；(5) VC檢測液含SAT擴增所需引物和探針的水溶液，各引物或探針的濃度在5-15pmol/反應均可，其中17引物濃度優選為12. 5pmol/反應，nT7引物濃度優選為
12.5pmol/反應,VC檢測探針濃度優選為5pmol/反應’內標檢測探針濃度優選為5pmol/反應；(6) SAT酶液SAT擴增所需多酶反應體系，主要含M-MLV反轉錄酶400-4000U/反應(優選為500-1500U/反應)、I7RNA聚合酶200-2000U/反應(優選為500-1000U/反應)；(7) VC陽性對照；含IO5-IO8拷貝/mL霍亂弧菌(VC) toxR的體外轉錄RNA稀釋物；⑶VC陰性對照不含有霍亂弧菌(VC)靶標核酸(VC RNA)序列或不含有霍亂弧菌的溶液，如生理鹽水；(9) VC內標含IO5-IO8拷貝/mL VC內標RNA (序列7)，是VC核苷酸序列(VC RNA)的競爭性內標，為體外轉錄RNA(VC IC RNA)稀釋物。以上所述試劑盒中各組成的進一步說明如下裂解液的主要有效成分是去垢劑，高濃度去垢劑的存在能夠使RNase迅速失活，有效保存RNA。核酸提取液是利用了磁珠分離法進行核酸提取，其主要成分為磁性顆粒和捕獲探針。捕獲探針一端與靶標互補，一端與磁性顆粒互補連接，在核酸提取過程中，細菌裂解釋放出的核酸與核酸提取液中的磁性顆粒特異結合，在不需要傳統的離心操作的情況下，通過洗滌液清洗磁性顆粒而獲得純凈的細菌靶標核酸(RNA)。細菌RNA的提取通過特異性吸附原理來實現。VC檢測液中VC檢測探針為分子信標，是一類高特異性、高敏感性的分子探針，由兩端分別共價標記有熒光染料和淬滅劑的單鏈核酸分子組成，呈發夾型或莖環結構，分子信標的環部分和靶標互補，兩頭由于互補而成為莖，分子信標探針與線性的TaqMan探針相t匕，因其發夾結構的打開需要一定的力，因而特異性要好于線性探針。由于SAT擴增易受多種因素影響而使擴增失敗，使試劑盒使用人員判斷失誤得出錯誤的結論，本發明的試劑盒中設置了 VC陽性對照、VC陰性對照和VC內標。其中，IVA陽性對照和VC內標為體外轉錄的RNA，不具有生物學活性。通過檢測陽性對照，可證明試劑盒檢測方法及材料無誤，保證檢測的準確性，同時可以監測每次檢測的重復性和穩定性及試劑盒批次間的差異。VC內標作為VC RNA的競爭性內標，其最主要的作用就是控制假陰性結果的發生，通過檢測加入有內標的樣本，可了解整個擴增反應體系是否受抑制，更好的提示假陰性。陰性對照可排除假陽性，在正確使用試劑盒檢測方法和材料情況下，可保證檢測的特異性。利用以上試劑盒對霍亂弧菌(VC)進行實時熒光核酸恒溫擴增檢測，包括以下步驟(I)用裂解液裂解待測樣品中的霍亂弧菌(VC)，得到含有霍亂弧菌(VC)核酸的裂解液； (2)向步驟I)的裂解液中加入核酸提取液，試劑盒內存在VC內標時，同時加入VC內標，使捕獲探針與靶標或內標核酸特異結合后再與磁珠結合，用洗滌液洗滌，除去未與磁珠結合的核酸，得到霍亂弧菌(VC)的核酸(RNA)和VC IC RNA ；(3)將步驟2)提取的霍亂弧菌(VC)的核酸(RNA)和VC IC RNA加入由VC反應液和VC檢測液組成的第一階段反應物中，在60°C下溫育10分鐘后，再在42°C下溫育5分鐘，然后加入第二階段酶反應物SAT酶液，由此開始在42°C下繼續溫育50分鐘，用檢測儀同步記錄熒光信號的變化；所述第一階段反應物與第二階段酶反應物的體積比為3 I ；(4)根據熒光信號產生的時間和強度參照VC陽性對照、VC陰性對照和VC內標檢測結果對待測樣品進行定性檢測。所述步驟4)中的VC陽性對照為含IO5-IO8拷貝/mL霍亂弧菌(VC)toxR的體外轉錄RNA稀釋物；VC陰性對照為不含有霍亂弧菌(VC)靶標核酸(VC RNA)序列或不含有霍亂弧菌的溶液；VC內標為含IO5-IO8拷貝/mL VC內標RNA(序列7)稀釋物。實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例中所用主要原料SAT酶液、陽性對照及內標的體外轉錄RNA由美國RD Biosciences公司提供，7500型PCR儀為美國ABI公司產品，MX3005熒光定量儀為Stratagene公司產品，NTPs、dNTPs等試劑和其他儀器均為常規可商購產品。實施例I、用于實時熒光核酸恒溫擴增檢測霍亂弧菌(VC)的專用引物和探針的設計本發明選擇VC細菌toxR中無二級結構且高度保守區段作為擴增靶序列區域(其核苷酸序列如序列表中序列I所示)，根據引物探針設計原理，使用DNA ATAR,DNAman軟件和人工設計用于實時熒光核酸恒溫擴增檢測霍亂弧菌(VC)的專用引物和探針序列，得到如下具體序列(I) 一條可與如序列表中序列I所示的霍亂弧菌(VC)的靶標核酸(VC RNA)序列特異結合的捕獲探針(TCO,Target Capture Oligo),所述捕獲探針的核苷酸序列為5’-GCCAGCUGGUAUCUUCGACUGACUUCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3，(序列表中序列 2)；(2) 一對用于在M-MLV反轉錄酶作用下產生VC靶標核酸(VC RNA)的DNA拷貝的VC檢測引物，所述VC檢測引物由17引物和n!7弓丨物組成，17引物序列為5，-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAATCACCTCGITTGGACGITGGGCCAGCA-3’ (序列表中序列 3)，n!7 引物序列為5’-TCCCCTAAGCAATACTCTGA3’ (序列表中序列 4)；(3) 一條用于與在I7RNA聚合酶作用下根據所述VC靶標核酸(VC RNA)的DNA拷貝產生的RNA拷貝特異結合的VC檢測探針，所述VC檢測探針的核苷酸序列為5’-CGCAUAGUGAAGAGAUCAUUCGAGUGCG-3’ (序列表中序列5)，5’端用FAM熒光標記，3’端用DABCYL熒光

(4)為便于進行結果分析，還配合試劑盒中增加的競爭性VC內標(序列7)，設計了競爭性內標檢測探針，VC內標與VC靶標核苷酸(VC RNA)擁有相同的引物結合區，兩引物之間的核酸序列或排列不同，使其不能與檢測探針結合，但能與內標探針結合，所述VC內標可通過VC靶標模板定點突變構建獲得，可與捕獲探針特異性結合，所述內標檢測探針為與VC檢測探針序列、突光標記不同，但堿基數一致的探針,所述的內標檢測探針的核苷酸序列為5’ -CGCUGGAGCGUGGUGAGCAGCG-3’ (序列表中序列6)，5’端標記HEX熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團。實施例2、制備霍亂弧菌(VC)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒利用實施例I所提供的專用引物和探針，得到本發明霍亂弧菌(VC)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒。該試劑盒包含有捕獲探針(TCO，Target Capture Oligo)、17引物、n!7引物、VC檢測探針、內標檢測探針、M-MLV反轉錄酶和I7RNA聚合酶。所述捕獲探針存在于核酸提取液中，所述17引物、n!7引物和VC檢測探針、內標檢測探針存在于VC檢測液中，所述M-MLV反轉錄酶和I7RNA聚合酶存在于SAT酶液中，具體來講，所述試劑盒分為2-30°C儲存的A盒(標本處理單元)和-15—-35°C儲存的B盒(核酸擴增檢測單元)，A盒包括裂解液、核酸提取液和洗滌液，B盒包括VC反應液、VC檢測液、SAT酶液、VC陽性對照、VC陰性對照，如果存在內標，B盒還包括VC內標，主要成分如下A盒(標本處理單元)組成為裂解液；含硫酸銨((NH4) 2S04)和HEPES ；核酸提取液含捕獲探針1-50 uM(優選為5-25 u M)和磁珠50_500mg/L (優選為50-250mg/L)；洗滌液主要含Iwt % SDS。B盒(核酸擴增檢測單元)組成為VC 反應液含 dNTP 0. I-IOmM (優選為 0. 5_5mM)，NTP l_20mM(優選為 I-IOmM)；VC檢測液含引物和探針，各引物和探針的濃度在5-15pmol/反應均可，其中17引物濃度優選為12. 5pmol/反應，n!7引物濃度優選為12. 5pmol/反應，VC檢測探針濃度優選為5pmol/反應’內標檢測探針濃度優選為5pmol/反應；SAT 酶液含 M-MLV 反轉錄酶 400-4000U/ 反應(優選為 500-1500U/ 反應)，T7RNA聚合酶200-2000U/反應(優選為500-1000U/反應);VC陽性對照；含IO5-IO8拷貝/mL霍亂弧菌(VC) toxR的體外轉錄RNA稀釋物；VC陰性對照不含有霍亂弧菌(VC)靶標核酸(VC RNA)序列或不含有霍亂弧菌的溶液,如生理鹽水；如果存在內標，VC內標含IO5-IO8拷貝/mL VC IC RNA稀釋物(序列表中序列7)。試劑盒中所包含的所有試劑均可按提示以常規方法制備取得或商業購買得到。具體來講，每一反應單位中，所述試劑盒各種試劑的具體組配如下(I)裂解液為裂解和保存樣本中的霍亂弧菌(VC)，含有硫酸銨和HEPES緩沖液的溶液，具體包含 HEPES 25-250mM, (NH4)2SO4 5-50mM ；
(2)核酸提取液為提取霍亂弧菌(VC)RNA的含有oligo (dT)包被的磁珠和特異結合靶標核酸(VC RNA)的一段RNA序列的溶液，具體包含HEPES 50-400mM, EDTA40-200mM,LiCl 400-2000mM,捕獲探針 1-50 y M(優選為 5_25u M)，磁珠 50_500mg/L(優選為50-250mg/L)；(3)洗滌液為含 SDS、NaCl 的溶液，具體包含 HEPES 5_50mM，NaCl 50-500Mm, 1%SDS 1-lOmM, EDTA I-IOmM ；(4)VC反應液為含dNTPs和NTPs擴增所需組份，具體包含Tris 10_50mM，MgCl210-40mM, dNTP 0. l-10mM(優選為 0. 5_5mM)，NT Pl_20mM(優選為 1-lOmM)，PVP401-10%, KCl 5-40mM ；(5) VC檢測液將恒溫擴增時必需的VC檢測引物和VC檢測探針溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImM EDTA的混合液)中配制而成，引物和探針濃度在5_15pmol/反應均可， 其中T7引物濃度優選為12. 5pmol/反應，nT7引物濃度優選為12. 5pmol/反應，VC檢測探針濃度優選為5pmol/反應’內標檢測探針濃度優選為5pmol/反應；(6) SAT酶液為恒溫擴增時必需的多酶組分體系，含M-MLV反轉錄酶400-4000U/反應(優選為500-1500U/反應)、I7RNA聚合酶200-2000U/反應(優選為500-1000U/反應)、2_10mM HEPES pH7.5、IO-IOOmM N-acetyl-L-cysteine>0. 04-0. 4mM zinc acetate、IO-IOOmM trehalose,40-200mM Tris-HCl pH8. 0、40_200mM KCU0. 01-0. 5mM EDTA、
0.1-1 % (v/v) Triton X-100 和 20-50% (v/v) glycerol ；(7) VC陽性對照；含IO5-IO8拷貝/mL霍亂弧菌(VC) toxR的體外轉錄RNA稀釋物；(8) VC陰性對照不含有霍亂弧菌(VC)靶標核酸(VC RNA)序列或不含有霍亂弧菌的溶液，如生理鹽水；(9)如果存在內標，VC內標含IO5-IO8拷貝/mL VC內標RNA (序列表中序列7)。VC陽性對照中的體外轉錄的VC RNA，可以通過多種方法制備所得，其中一種制備方法如下I)用化學合成法合成VC toxR中無二級結構且高度保守區段作為擴增靶序列區域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；2)將片段克隆到pGEM -T載體中，構建VC陽性對照質粒；3) VC陽性對照質粒轉化到大腸桿菌DH5 a中，命名為pGEM -T-VC菌株，貯存于-70。。；4)從pGEM -T-VC菌株中提取pGEM -T-VC質粒，將質粒進行轉錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定RNA。VC內標中的體外轉錄的VC IC RNA，可以通過多種方法制備所得，其中一種制備方法如下I)用化學合成法合成一段除探針檢測區域序列不同，其他序列基本同VC靶標序列區域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；2)將片段克隆到pGEM -T載體中，構建VC內標質粒；3) VC內標質粒轉化到大腸桿菌DH5 a中，命名為pGEM _T_VC IC菌株，貯存于-70。。；4)從pGEM -T-VCIC菌株中提取pGEM -T-VC IC質粒，將質粒進行轉錄RNA，純化去除DNA，并定量、鑒定內標RNA。實施例3、霍亂弧菌的實時熒光核酸恒溫擴增檢測靈敏度用本發明試劑盒(組成見實施例2，試劑盒內不存在VC內標和檢測液中的內標檢測探針)檢測食品樣本中的霍亂弧菌(VC)，具體方法包括以下步驟(I)菌液稀釋測定濃度為I X 105CFU/mL的霍亂弧菌培養物，10倍梯度稀釋到lOcFU/mL作為霍亂弧菌線性靈敏度參考品。(2)核酸提取2. I在樣品處理管(I. 5mL離心管)中加入200 裂解液(含HEPES 35mM, (NH4) 2S0420mM)，200 ill菌液，用裂解液裂解待測樣品中的霍亂弧菌(VC)，得到含有霍亂弧菌(VC)核酸的裂解液。2. 2在樣品處理管(I. 5mL離心管)中加入100 U I核酸提取液(含HEPES IOOmM,EDTA 50mM, LiCl 500mM,捕獲探針10 u M，磁珠250mg/L)，混勻，60°C保溫5分鐘，室溫放置10分鐘。2. 3將樣品處理管置于磁珠分離裝置上，靜置5-10分鐘。待磁珠吸附于管壁后，保持樣品處理管于磁珠分離裝置上，吸棄液體，保留磁珠。加入ImL洗滌液(含HEPES50mM，NaCl IOOmM, I % SDS, EDTA 5mM)振蕩均勻后靜置5_10分鐘，棄液體，保留磁珠，反復2次。2. 4將樣品處理管移離磁珠分離裝置，管中為磁珠-核酸復合物，備用(此步應清晰可見磁珠)。(3) SAT核酸擴增檢測3. I向樣品處理管中加入40 U I反應檢測液(40 U I VC反應液+2. 5 VC檢測液)洗滌磁珠。VC 反應液具體包含 Tris 30mM,MgCl2 IOmM, dNTP lmm, NTP 2mM,PVP405%,KC125mM ；VC檢測液中T7引物濃度為12. 5pmol, nT7引物濃度為12. 5pmol, VC檢測探針濃度為5pmol。3. 2取振蕩混勻的上述反應檢測液30 U I加至潔凈微量反應管，60°C保溫10分鐘，42°C保溫5分鐘；向微量反應管中加入10 u I已預熱至42°C的SAT酶液，1200rpm振蕩15秒鐘混勻，用7500型PCR儀(美國ABI公司產品)進行實時熒光檢測。SAT酶液中含M-MLV反轉錄酶 750U，T7RNA 聚合酶 500U/ 反應，IOmM HEPES pH7. 5，20mMN-acetyl-L-cysteine (N-乙酸-L-半胱氨酸)，0. ImM zinc acetate (乙酸鋒)、IOmMtrehalose (海藻糖)、IOOmMTris-HCl pH8. 0,IOOmM KCl,0. Imm EDTA,0. 8 % (v/v)Triton X-100 和 40 % (v/v)glycerol (丙三醇)；3. 3將微量反應管快速轉至恒溫熒光檢測儀器(ABI7500熒光定量儀，ABI儀器只可選VIC通道，但VIC與HEX波長相近)，42°C反應50分鐘，設定每I分鐘檢測一次熒光，共檢測50次。(4)結果判定根據PCR擴增結果得到的曲線，設定閥值線，讀取dt值，判定結果。閾值設定以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點。dt表示樣本曲線與閾值線交點的橫坐標讀數(與一般實時熒光PCR實驗結果的ct值類似)①陽性結果判定
VIC通道dt彡45的樣本為陽性；45 < dt < 50的樣本建議重新檢測，檢測結果dt < 50的樣本為陽性。②陰性結果判定VIC通道dt無數值或為50，則為陰性。(5)結果圖I顯示靈敏度的檢測圖，將濃度為IX 105CFU/mL的陽性參考品，按10倍梯度稀釋進行檢測。當陽性參考品的濃度為100CFU/mL的時候，檢測dt值為25，即檢測下限靈敏度可以達到100CFU/mL。實施例4、霍亂弧菌的實時熒光核酸恒溫擴增檢測特異性本檢測模式為本發明的另一個應用試劑盒組成同實施例2，試劑的生產在GMP車 間進行；特異性參考品處理的方法如下6例陰性參考品包括金黃色葡萄球菌(SA)、志賀氏 菌(SH)、大腸桿菌0157 (0157)、單核細胞增生李斯特氏菌(Lm)、沙門氏菌(Sal. spp.)、副溶血弧菌(VP)，另設陰性對照、陽性對照各一個。檢測方法同實施例3，檢測中所用試劑量同實施例3。使用本發明試劑盒的檢測結果如圖2，6個陰性參考品的擴增曲線平直且與基線無交叉，可明確判定為陰性。6例陰性參考品包括金黃色葡萄球菌(SA)、志賀氏菌(SH)、大腸桿菌0157(0157)、單核細胞增生李斯特氏菌(Lm)、沙門氏菌(Sal. spp.)、副溶血弧菌(VP)。實施例5、實際食品樣本的實時熒光核酸恒溫擴增檢測用本發明試劑盒(組成見實施例2，試劑盒含有VC內標，檢測液內含有內標探針)檢測食品樣品中的霍亂弧菌VC，具體方法包括以下步驟(I)樣本處理稱取25g(mL)樣品裝入盛有225mL營養肉湯的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打Imin 2min。若樣品為液態，不需要均質，震蕩混勻。如為冷凍產品，應在45°C以下不超過15min，或2°C 5°C不超過18h解凍。霍亂弧菌樣本編號為VC食品標本1_10，另設陰性對照、陽性對照各一個。(2)核酸提取2. I在樣品處理管(I. 5mL離心管)中加入200iil裂解液(含HEPES 35mM,(NH4) 2S0420mM)，200 ill菌液，用裂解液裂解待測樣品中的霍亂弧菌(VC)，得到含有霍亂弧菌(VC)核酸的裂解液。2. 2在樣品處理管(I. 5mL離心管)中加入100 U I核酸提取液(含HEPES IOOmM,EDTA 150mM, LiCl 1500mM,捕獲探針 20 u M,磁珠 250mg/L), 10 U I 內標溶液(含 I X IO8 拷貝/mL VC內標RNA)，混勻，60°C保溫5分鐘，室溫放置10分鐘。2. 3將樣品處理管置于磁珠分離裝置上，靜置5-10分鐘。待磁珠吸附于管壁后，保持樣品處理管于磁珠分離裝置上，吸棄液體，保留磁珠。加入ImL洗滌液(含HEPES50mM，NaCl IOOmM, I % SDS, EDTA 5mM)振蕩均勻后靜置5_10分鐘，棄液體，保留磁珠，反復2次。2. 4將樣品處理管移離磁珠分離裝置，管中為磁珠-核酸復合物，備用(此步應清晰可見磁珠)。(3) SAT核酸擴增檢測3. I向樣品處理管中加入40 U I反應檢測液(40 U I VC反應液+2. 5 VC檢測液)洗滌磁珠。VC 反應液具體包含 Tris 50mM,MgCl2 2OmM，dNTP 5mM, NTP 10mM,PVP405%,KCl 40mM ;VC檢測液中T7引物濃度為12. 5pmol，nT7引物濃度為12. 5pmol，VC檢測探針濃度為5pmol,內標檢測探針濃度為5pmol。3. 2取振蕩混勻的上述反應檢測液30 Ul加至潔凈微量反應管，60°C保溫10分鐘，42°C保溫5分鐘；向微量反應管中加入IOiU已預熱至42°C的SAT酶液，1200rpm振蕩15秒鐘混勻，用7500型PCR儀(美國ABI公司產品)進行實時熒光檢測。SAT酶液中含 M-MLV 反轉錄酶 1500U，T7RNA 聚合酶 1000U/ 反應，IOmM HEPES pH7. 5，50mMN-acetyl-L-cysteine (N-乙酸-L-半胱氨酸)，0. 4mM zinc acetate (乙酸鋒)、60mMtrehalose (海藻糖)、IOOmM Tris-HCl pH8. 0,200mM KC1,0. 3mM EDTA,0. 8% (v/v) TritonX-100 和 40% (v/v) glycerol (丙三醇)。3. 3將微量反應管快速轉至恒溫熒光檢測儀器(ABI7500熒光定量儀，ABI公司產品，ABI儀器只可選VIC通道，但VIC與HEX波長相近)，42°C反應50分鐘，設定每I分鐘檢測一次熒光，共檢測50次。
(4)結果判定根據PCR擴增結果得到的曲線，設定閥值線，讀取dt值，判定結果。閾值設定以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點。dt表示樣本曲線與閾值線交點的橫坐標讀數(與一般實時熒光PCR實驗結果的ct值類似)③陽性結果判定Fl通道dt ( 45的樣本為陽性；45 < dt < 50的樣本建議重新檢測，檢測結果Fl通道dt < 50的樣本為陽性。④陰性結果判定F1通道dt無數值或為50，同時F2通道dt ( 45，則為陰性。質量控制每次檢測均設置陽性對照和陰性對照，且結果應同時滿足陽性對照Fl通道dt < 45 ;陰性對照Fl通道dt無數值或為50，同時F2通道dt < 45，否則此次檢測結果視為無效。(5)結果根據Fl通道(圖3)和F2通道(圖4)的dt值情況，判定樣本3、7檢測為陽性，樣本1、2、4、5、6、8、9、10為陰性(樣本1、2、4、5、6、8、9、10圖3顯示為陰性，圖4顯示有信號，正說明內標可檢測出，反應體系沒有受環境影響，排除假陰性)。根據本發明的公開內容，本領域的熟練技術人員無須過多實驗即可對本發明所要求保護的霍亂弧菌(VC)實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒進行實施，并達到預期效果。本發明公開的實施例僅是對本發明進行詳細描述，但并不足構成對本發明限制。本領域的熟練技術人員用顯而易見的相似替代物或改造，或用某些在化學上或生物上結構功能相關的制劑替代在此描述的制劑，或對本發明相關內容進行變動，但不超出本發明的精神、范圍和思想，均落入本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種霍亂弧菌(VC)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，包含有一條序列表中序列I所示的霍亂弧菌(VC)的靶標核酸(VC RNA)的捕獲探針，一對用于在M-MLV反轉錄酶作用下產生VC靶標核酸(VC RNA)的DNA拷貝的VC檢測引物17和nT7，和一條用于與在17RNA聚合酶作用下根據所述VC靶標核酸(VC RNA)的DNA拷貝產生的RNA拷貝特異結合的VC檢測探針。
2.根據權利要求I所述試劑盒，其特征在于所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述VC檢測引物由T7引物和n!7引物組成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述VC檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標記FAM熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團。
3.根據權利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包含有M-MLV反轉錄酶和17 RNA聚合酶，所述M-MLV反轉錄酶和I7RNA聚合酶存在于一 SAT酶液中，所述捕獲探針存在于一核酸提取液中，所述T7引物、n!7引物和VC檢測探針存在于一 VC檢測液中。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包含有VC內標和內標檢測探針；所述VC內標為VC核苷酸序列(VC RNA)的競爭性內標，可與捕獲探針特異性結合，并使用同一對引物(T7和n!7引物)，由序列表中序列7所示的VC IC RNA ;所述內標檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標記HEX熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團，且所述內標檢測探針存在于VC檢測液中。
5.根據權利要求I至4任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含裂解液、核酸提取液、洗滌液、VC反應液、VC檢測液、SAT酶液、VC陽性對照、VC陰性對照和VC內標，其中 裂解液含硫酸銨((NH4)2SO4)和HEPES ； 核酸提取液含捕獲探針和磁珠； 洗滌液含NaCl和SDS ； VC反應液含dNTP和NTP ； VC檢測液含17引物、n!7引物、VC檢測探針和內標檢測探針； SAT酶液含M-MLV反轉錄酶、T7 RNA聚合酶； VC陽性對照；含霍亂弧菌(VC) toxR的體外轉錄RNA稀釋物； VC陰性對照不含有霍亂弧菌(VC)靶標核酸(VC RNA)序列或不含有霍亂弧菌的溶液，如生理鹽水； VC內標VC IC RNA (序列如序列表中序列I所示)。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中一個反應單位中各種試劑組成如下(1)裂解液HEPES25-250mM,(NH4)2SO4 5_50mM ； (2)核酸提取液HEPES50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400-2000mM,捕獲探針1-50 u M (優選為 5-25 u M)，磁珠 50-500mg/L (優選為 50-250mg/L)；(3)洗滌液HEPES5-50mM, NaCl 50-500Mm, 1% SDS，EDTA I-IOmM ；(4)VC 反應液Tris 10_50mM，MgCl2 10_40mM，dNTP 0. I-IOmM(優選為 0. 5_5mM)，NTPl-20mM(優選為 I-IOmM)，PVP40 1-10%, KCl 5-40mM ； (5)VC檢測液將VC檢測引物和VC檢測探針溶解在TE溶液(IOmM Tris和ImMEDTA的混合液)中配制而成，各引物和探針濃度在5-15pmol/反應均可；其中17引物濃度優選為.12. 5pmol/反應，nT7引物濃度優選為12. 5pmol/反應，VC檢測探針濃度優選為5pmol/反應，內標檢測探針濃度優選為5pmol/反應； (6)SAT酶液M-MLV反轉錄酶400-4000U/反應(優選為500-1500U/反應)、T7 RNA 聚合酶 200-2000U/ 反應(優選為 500-1000U/ 反應)、2_10mM HEPES pH7. 5、10-100mMN-acetyl-L-cysteine^0. 04-0. 4mM zinc acetate^IO-IOOmM trehalose、40-200mMTris-HCl pH8. 0、40_200mM KC1、0. 01-0. 5mM EDTA、0. 1-1% (v/v) Triton X-100和 20-50% (v/v) glycerol ； (7)VC陽性對照；含IO5-IO8拷貝/mL霍亂弧菌(VC) toxR的體外轉錄RNA稀釋物； (8)VC陰性對照不含有霍亂弧菌(VC)靶標核酸(VC RNA)序列或不含有霍亂弧菌的溶液； (9)VC內標含IO5-IO8拷貝/mL VCIC RNA(序列如序列表中序列7所示)體外轉錄RNA稀釋物。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于由A盒即標本處理單元和B盒即核酸擴增檢測單元組成，其中A盒包裝所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌液，B盒包裝所述VC反應液、VC檢測液、SAT酶液、VC陽性對照、VC陰性對照及VC內標。
8.根據權利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于所述VC陽性對照中的體外轉錄的VC RNA以下述方法制備 (1)用化學合成法合成VCtoxR中無二級結構且高度保守區段作為擴增靶序列區域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)； (2)將片段克隆到pGEW-T載體中，構建VC陽性對照質粒； (3)VC陽性對照質粒轉化到大腸桿菌DH5 a中，命名SpGEMs -T-VC菌株，貯存于_70°C ； (4)純化去除DNA，并定量、鑒定RNA； 存在VC內標時，體外轉錄的VC IC RNA以下述方法制備 (1)用化學合成法合成一段除探針檢測區域序列不同，其他序列基本同VC靶標序列區域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)； (2)將片段克隆到pGEM -T載體中，構建VC內標質粒； (3)VC內標質粒轉化到大腸桿菌DH5 a中，命名為pGEM -T-VC IC菌株，貯存于-70°C; (4)純化去除DNA，并定量、鑒定內標RNA。
9.權利要求1-8任一所述霍亂弧菌(VC)實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒中的專用試劑，為以下表示的物質之一 (1)可與序列表中序列I所示的霍亂弧菌(VC)的靶標核酸(VCRNA)序列特異結合的捕獲探針(TCO,Target Capture Oligo),所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示； (2)用于在M-MLV反轉錄酶作用下產生VC靶標核酸(VCRNA)的DNA拷貝的VC檢測引物17和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示； (3)用于與在17RNA聚合酶作用下根據所述VC靶標核酸(VC RNA)的DNA拷貝產生的RNA拷貝特異結合的VC檢測探針，所述VC檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標記FAM熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團；(4)內標和內標檢測探針，內標為VC核苷酸序列(VC RNA)的競爭性內標，可與(I)所述捕獲探針特異性結合，并使用同一對引物(T7和n!7引物)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示；內標檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示,5’端標記HEX突光基團,3’端標記DABCYL淬滅基團。
10.一種權利要求1-8任一所述的試劑盒的使用方法，用于霍亂弧菌(VC)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測，包括以下操作 (1)用裂解液裂解待測樣品中的霍亂弧菌(VC)，得到含有霍亂弧菌(VC)核酸的裂解液； (2)向步驟I)的裂解液中加入核酸提取液，試劑盒內存在VC內標時，同時加入VC內標，使捕獲探針與靶標或內標核酸特異結合后再與磁珠結合，用洗滌液洗滌，除去未與磁珠結合的核酸，得到霍亂弧菌(VC)的核酸(RNA)和VC IC RNA ； (3)將步驟2)提取的霍亂弧菌(VC)的核酸(RNA)和VCIC RNA加入由VC反應液和VC檢測液組成的第一階段反應物中，在60°C下溫育10分鐘后，再在42°C下溫育5分鐘，然后加入第二階段酶反應物SAT酶液，由此開始在42°C下繼續溫育50分鐘，用檢測儀同步記錄熒光信號的變化；所述第一階段反應物與第二階段酶反應物的體積比為3 I ； (4)根據熒光信號產生的時間和強度參照VC陽性對照、VC陰性對照和VC內標檢測結果對待測樣品進行定性檢測。
全文摘要
本發明公開了一種霍亂弧菌(VC)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒。包括捕獲探針、VC檢測引物T7引物和nT7引物、VC檢測探針、M-MLV反轉錄酶和T7 RNA聚合酶等試劑。本發明試劑盒能夠檢測食品中的VC RNA，具有特異性高、靈敏度高(可達100 CFU/ml)、污染低(擴增產物RNA在自然環境下易于降解)及快速檢測(常規50分鐘完成檢測)的特點，將在霍亂弧菌快速檢測中發揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12N15/11GK102719542SQ20121020330
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月19日 優先權日2012年6月19日
發明者于明輝, 居金良, 張長明, 李豪 申請人:上海仁度生物科技有限公司