專利名稱：一種重組工程介導的大腸桿菌基因組點突變的方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體是涉及一種高效的運用重組工程手段實現大腸桿菌基因組點突變的方法。
背景技術：
大腸桿菌是遺傳學研究的最為透徹的微生物菌株，廣泛用于生物學的基礎研究。大腸桿菌同時也是工業生產中最重要的微生物菌株之一，是合成生物學和代謝工程的首選菌株。大腸桿菌在生產藥物、精細化工產品以及具工業催化價值的酶等方面有著廣泛的用途。這些實際的功能均與基因組上的基因密切關聯，因此闡述這些基因的功能和改善這些基因的品質是發揮大腸桿菌功能的重要途徑。在諸多研究手段中，基因組的點突變(即基因位點的點突變)是關鍵的一種。
經典的大腸桿菌基因組點突變的方法有兩種。均首先是通過重疊一延伸聚合酶鏈式反應等方法將引入突變位點的基因克隆在載體上，突變位點兩側含有與基因組序列一致的同源片段(設為A和B)。第一種方法選擇的是含有溫度敏感型復制子的載體。大腸桿菌的生長溫度是37° C，溫度敏感型復制子只能在30° C時進行復制，在37° C時，含溫度敏感型復制子的質粒因為不能復制而失去。當含有突變位點的含溫度敏感型復制子的質粒轉化至大腸桿菌后，首先在30° C培養，通過抗性選擇得到質粒游離于基因組的菌株，隨后提高培養溫度至37° C或42° C，迫使質粒通過突變位點一側的同源片段(任為A或B)整合至基因組上，隨后在30° C之下進行培養，篩選失去抗性(即失去質粒的)菌株，此時菌株有兩種類型，一種類型是用于第一步整合的片段(A或B)再次用于發生同源重組，而得到回復至原株基因組的菌株；另外一種類型是第二個同源片段(第一次為A，則此時為B ;第一次為B,則此時為A)發生同源重組，而得到目的位點發生突變的突變株。第二種方法選擇的是含有不能在常規大腸桿菌中復制的復制子(如需要Pir蛋白才能復制的R6K復制子)和含有負篩選標記的質粒。一種典型的負篩選標記是編碼6-果糖基轉移酶的sacB基因，含有此基因的菌株(在質粒上或基因組上)不能在含10%的蔗糖培養基中生存。將克隆有突變位點和同源片段的重組質粒轉化至大腸桿菌后，由于質粒不能復制，在抗性篩選之下，迫使突變位點一側的同源片段(任為A或B)整合至基因組上。隨后將菌株在負篩選的條件下進行培養，與第一種方法類似，如相同的同源片段再次發生同源重組，則得到原株基因型的菌株；如不同的同源片段方式重組，則得到目的位點發生突變的菌株。由此可見，這兩個經典的方法的不足是1.因為所需的同源片段較長(一般需lkb)，故需要步驟煩瑣和耗時長的基因克隆步驟；2.在最終菌株中發生突變的比例可能相差較大，即需要篩選較多的克隆才能得到正確的突變株。隨著重組工程方法學的興起，直接合成含突變位點的寡核苷酸，將之轉化大腸桿菌后篩再選點突變的菌株成為可能。重組工程一般使用來源于lambda噬菌體的三個基因。其中exo基因編碼5’->3外切酶，其作用于雙鏈DNA而得到3’端突出的DNA分子；bet基因編碼3’突出端的單鏈結合蛋白，同時促進同源片段之間的同源重組；gam基因編碼抑制內源性核酸酶的Gam蛋白，使得轉化的DNA分子免受菌株本身的核酸酶所降解，這三個基因共同行使重組酶的活性。重組工程突出優點是可以催化短至36bp之間的同源片段(稱為同源臂)之間的同源重組而實現DNA的克隆和修飾。突變寡核苷酸的方法雖然簡便，但迄今報道的突變率往往很低，在1%左右甚至更少，這就需要篩選大量的克隆才能得到正確的突變株。因此突變寡核苷酸的方法目前只具有基礎研究意義，目前難以推廣應用。

發明內容
為克服上述不足，本發明申請提出了一種基于重組工程的大腸桿菌基因組的點突變方法。本方法的基本原理是首先通過重組工程的手段在基因組上引入含突變位點(單個或數個堿基)、30bp同源片段、兩側為歸巢核酸酶I-SceI酶切位點的卡那霉素抗性基因，隨后誘導表達的I-SceI作用于整合在基因組上的I-SceI酶切位點，促使30bp同源片段之間發生同源重組而將一個30bp同源片段、兩個I-SceI酶切位點和卡那霉素抗性基因去除，最 終得到不含有任何冗余序列的、發生點突變的大腸桿菌突變株。本發明所采用的技術方案包括以下步驟(I)通過重疊-延伸聚合酶鏈式反應獲得一個DNA修飾片段，所述DNA修飾片段依次由下列結構組成基因組上靶位點(即待突變位點)上游50bp序列一致的50bp同源臂、突變位點(即突變成功的位點)、與靶位點下游30bp序列一致的30bp同源片段、兩側為兩個歸巢核酸酶I-SceI酶切位點的卡那霉素抗性基因、與祀位點下游50bp序列一致的50bp同
源臂；(2)將含重組酶基因和I-SceI基因的質粒pLS134轉化至大腸桿菌MG1655中；所述的質粒PLS134是將PCR擴增的tetR-ptetA-1-SceI基因盒片段以NsiI酶切后，克隆至pBAD322的NsiI位點，得到重組克隆pLS133 ;再將exo，bet和gam三個重組酶基因從lambda噬菌體DNA中PCR擴增后，以NcoI和XhoI酶切后，克隆至pLS133的NcoI和SaII位點，得到目的質粒pLS134 ；(3)將步驟(I)得到的DNA修飾片段電轉化至以終濃度為O. 15%的L-阿拉伯糖誘導下表達Red重組酶基因的步驟(2)的大腸桿菌電轉化感受態細胞中，通過重組酶介導的同源臂和大腸桿菌基因組上相同序列之間的同源重組，將所述DNA修飾片段中，左右50bp同源臂之間的片段整合至大腸桿菌基因組，在卡那霉素抗性篩選之下，獲得整合有突變位點、30bp同源片段和兩側為I-SceI酶切位點的卡那霉素抗性基因的卡那霉素抗性突變株；(4)將步驟(3)得到的菌株在含終濃度為20μ g/ml熱處理的氯四環素的培養基中進行培養，熱失活的氯四環素誘導I-SceI酶的表達，I-SceI酶作用于整合在基因組上的I-SceI酶切位點，基因組發生雙鏈斷裂，促使菌株利用自身的重組功能催化30bp同源片段與靶位點下游30bp之間發生同源重組，從而將30bp同源片段、兩個I-SceI酶切位點及卡那霉素抗性基因消除，最終獲得發生點突變的大腸桿菌突變株。本發明中所述的靶位點，可以是一個或數個堿基，相應地，突變位點也可以是一個或數個堿基。I-SceI基因來源于酵母，所編碼的I-SceI酶作用于18個堿基對的5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’序列，在AC位點之間進行切割。此18個堿基對的序列在大腸桿菌基因組中不存在，故I-SceI不會作用于大腸桿菌的基因組，也就不會影響大腸桿菌的生存。I-SceI基因克隆在ptetA啟動子之下，ptetA啟動子受tetR調節基因所控制，在四環素及其類似物存在時，TetR解除對ptetA啟動子的抑制，ptetA啟動子開始啟動I-SceI基因的表達。將PCR擴增得到的tetR-ptetA-1-SceI基因盒片段以NsiI酶切后，克隆至低拷貝質粒PBAD322的NsiI位點，得到重組克隆pLS133。重組酶基因選擇是來自于lambda卩遼菌體的exo,bet和gam,將這三個重組酶基因從lambda噬菌體DNA中擴增，以NcoI和XhoI酶切后，克隆至pLS133的NcoI和SaII位點，得到目的質粒PLS134。PLS134在L-阿拉伯糖誘導下表達red重組酶基因，在失活的氯四環素誘導下表達I-SceI。優選實施例是對大腸桿菌基因組上的IacZ基因位點和nanA基因位點的點突變。IacZ為β -半乳糖苷酶基因，在MG1655基因組上的基因編號是b0344，突變的是單個位點，即開放閱讀框的第70位堿基C突變為T，這使得第24位的氨基酸谷氨酰胺突變為終止密·碼子。nanA為神經氨酸醛縮酶基因，在MG1655基因組上的基因編號是b3225，突變的是三個位點(盡管中間的一個堿基是一致的，但原理上來說是三個堿基發生了突變)，即開放閱讀框的第574-576堿基GAA突變為AAC，這使得第192位的氨基酸谷氨酸突變為天冬酰胺。兩個點突變實驗充分證明了本發明方法的可行性和較常規方法的優越性。本方法非常簡捷，無需克隆和測序，只涉及PCR、轉化和培養等步驟，因此可以同時進行多個位點的突變實驗；方法也非常高效，第一步的重組酶催化的同源重組的效率在60%左右，第二步同源重組的效率可達100%，只要篩選幾個克隆就足以得到點突變菌株。本方法無需任何特殊的設備，整個實驗周期在一周之內，有可能成為通用的大腸桿菌基因組點突變的方法，有著良好的基礎研究和實際應用的經濟前景。


圖I是本發明所采用的方法的示意圖。圖2MG16551acZ點突變和nanA點突變的原株和變株的基因型分析的凝膠電泳結
果OI. DL2000 分子量標準2. O, I. O, O. 75，O. 5，O. 25，O. Ikb ；2.以MG1655的基因組為模板，R1165和R1166擴增得到595bp;3.以含IacZ點突變的卡那霉素抗性菌株的基因組為模板，Rl 165和Rl 166擴增得到 1750bp ；4.以IacZ點突變變株的基因組為模板，Rl 165和Rl 166擴增得到595bp ；5. DL2000 分子量標準2. O, I. O, O. 75，O. 5，O. 25，O. Ikb ；6.以MG1655的基因組為模板，R1175和R1176擴增得到349bp;7.以含nanA點突變的卡那霉素抗性菌株的基因組為模板，Rl 175和Rl 176擴增得到 1505bp ；8.以nanA點突變變株的基因組為模板，R1175和R1176擴增得到349bp。圖3是MG1655原株和IacZ突變株突變位點區域的測序圖。圖的上部分和下部分分別為以R1165為測序引物，對MG1655和IacZ點突變變株的基因組為模板，R1165和R1166擴增得到595bp進行測序的結果?？梢娫跍y序圖譜中，在MG1655原株的第231位置處的堿基為C，而IacZ點突變變株的堿基為T，表明實現了 C突變為T。圖4是MG1655原株和nanA突變株突變位點區域的測序圖。圖的上部分和下部分分別為以R1175為測序引物，對MG1655和nanA點突變變株的基因組為模板，R1175和R1176擴增得到349bp進行測序的結果。可見在測序圖譜中，在MG1655原株的第131至133位置處的堿基為GAA，而nanA點突變變株的第131至133位置處的堿基為AAC，表明實現了 GAA突變為AAC。
具體實施例方式在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。 下面結合具體的實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。實施例中所用到的菌株和質粒，均為已公開的菌株和質粒I. Escherichia coli MG1655?；蛐虵 LAM-rph-l,來自美國大腸桿菌保藏中心。2. Escherichia coli DH10B。 基因型 FlncrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80dlacZΔM15ΔlacX74deoR recAl araD139Δ (ara,leu)7697galU galK rpsLendAlnupG.。文獻Life Technologies, Inc. Focus, 1990,12:19。購自美國 Invitrogen 公司。3. pST98_AS。 文獻Posfai G. , Kolisnychenko V. , Bereczki Z, BlattnerFR.Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by adouble-strand break in the chromosome. Nucleic Acids Res. 1999，27(22):4409-15。來 自美國 University of Wisconsin, Madison 的 Frederick Blattner 教授。4.pBAD322。文獻Cronan JE. A family of arabinose-inducible Escherichiacoli expression vectors having pBR322copy control. Plasmid. 2006，55(2):152-7。來自美國 University of Illinois at Urbana-Champaign 的 John Cronan 教授。5. pKD4 和 Escherichia coli BW25141。文獻Datsenko KA, Wanner BL. One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A. 2000，97 (12) : 6640-5。來自美國 Purdue 大學 Barry Wanner的教授。本發明的方法示意圖如圖1，圖中各符號的意義如下。X為靶位點(即待突變位點)；Y為突變位點(即突變成功的位點)；A為靶位點上游50bp用于重組工程的同源臂序列；B為靶位點下游30bp序列；C為30bp序列下游的20bp序列；A，X，B和C序列在基因組上相連；I-SceI為歸巢核酸酶I-SceI基因；S為Ι-Scel的酶切位點；neo為卡那霉素抗性基因；5’ -neo為卡那霉素抗性基因的5’端；3’ -neo為卡那霉素抗性基因的3"端；Red表示重組工程；雙交叉號表示同源重組重組工程介導的同源重組；Kan表示卡那霉素篩選；雙箭頭表示B片段之間的同源重組；PCR表示聚合酶鏈式反應；OE-PCR表示重疊一延伸聚合酶鏈式反應。Pl至P8為PCR引物，Pl由A，Y，B和擴增S位點和5’ -neo的序列所組成；P2為neo中間的一段序列；P3為P2的反向互補序列；P4由C和B的反向互補序列以及擴增S位點和3’ -neo的序列所組成；P5為Pl前端約21個堿基的序列；P6為P2前端約21個堿基的序列。簡要的實驗過程是以含兩側為S位點的卡那霉素抗性基因的質粒為模板，Pl和P2擴增出A-Y-B-S-5’ -neo的片段，P3和P4擴增出3’ -neo-S-B-C的片段，以這兩個片段為模板，P5和P6通過OE-PCR擴增出A-Y-B-S-neo-S-B-C的重組工程修飾片段。將此約I. 2kb的片段點轉化至表達重組酶的大腸桿菌原株MG1655中，重組酶催化50bp同源臂(上游為A序列，下游為B+C序列)和基因組上相同序列之間發生同源重組，在卡那霉素的抗性篩選之下，修飾片段中兩個同源臂之間的序列取代了基因組上兩個同源臂之間的序列，靶位點X突變為Y，同時將30bp同源片段和兩側為I-SceI酶切位點的卡那霉素小基因組整合至基因組。P7為A上游相隔約150至300個堿基的序列，P8為C下游相隔約150至300個堿基的序列。以抗性菌株的基因組DNA為模板，P7和P8為引物，擴增得到突變區域的片段，通過測序確證靶位點X突變為Y。將含卡那霉素抗性基因的突變株在含熱失活的氯四環素培養基進行培養，熱失活的氯四環素誘導I-SceI的表達，隨后作用的S位點，導致大腸桿菌基因組發生雙鏈斷裂，迫使大腸桿菌利用自身的重組系統催化30bp同源片段之間的同源重組而將一段30bp同源片段、兩個S位點序列及其中間的卡那霉素抗性基因去除，最后獲得不含任何溶于序列的點突變變株。P7和P8用于原株和點突變變株的基因型驗證，并以P7為測序引物對擴增片段測序以確證驗證突變的發生。實施例I.載體的構建I.重組酶和I-SceI表達載體的構建設計引物IPMl :5’ -GGGATGCATTTAAGACCCACTTTCACATTTAAG-3’，(SEQ ID NO. I)；IPM2 :5’ -GGGATGCATTTATTTCAGGAAAGTTTCGGAG-3’，(SEQ ID NO. 2)。以 pST98_AS 為模板，IPMl和IPM2擴增得到I. 4kb的tetR-ptetA-I-Scel片段。將I. 4kb片段以NsiI酶切后，克隆至PBAD322的NsiI位點，得到重組克隆pLS133。設計引物IPM3 :5，-GGGCCATGGATATTAATACTGAAACTG-3，，(SEQ ID NO. 3) ；IPM4 5’ -GGGCTCGAGCTATCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3'，(SEQ ID NO. 4)。以 HindIII 酶切的 lambda噬菌體DNA (購自大連寶生物公司)為模板，IPM3和IPM4擴增得到I. 9kb的red基因片段，將之以NcoI和XhoI酶切后，克隆至pLS133的NcoI和SaII位點，得到目的克隆pLS134。XhoI和SaII是同尾酶，酶切后可以連接克隆，連接后兩個酶切位點均消失。PLS134在L-阿拉伯糖誘導下表達Red重組酶，在失活的氯四環素誘導下表達I-SceI。以上質粒的克隆宿主菌均為大腸桿菌DH10B，所有克隆均經酶切和測序驗證所得序列正確性。
2.抗性基因和I-SceI酶切位點的模板載體的構建設計引物IPM5 :5’-GGAATCGATTAGGGATAACAGGGTAATTATGGACAGCAAGCGAACCGG-3 ' , (SEQ ID NO. 5) ;IPM6 :5’-GGGTCTAGAATTACCCTGTTATCCCTATCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3/，(SEQ ID NO. 6)。以 pKD4 為模板，IPM5 和 IPM6 擴增 I. Ikb 的片段，以 ClaI 和 XbaI雙酶切后，與以ClaI和XbaI雙酶切的pKD4相連，轉化大腸桿菌BW25141的感受態細胞，獲得重組克隆PLS135。pLS135即為克隆兩側含有I-SceI酶切位點的卡那霉素抗性基因的載體，此載體用做大腸桿菌基因組點突變實驗中擴增兩側兩個I-SceI酶切位點和卡那霉素抗性基因的模板。PLS135使用R6K復制子，因為R6K復制子需要Pir蛋白才能行使復制的功能，而常規的大腸桿菌如MG1655不含Pir蛋白，以pLS135做模板就沒有質粒背景的干擾，PCR產物可以直接沉淀回收。實施例2 IacZ基因開放閱讀框的第70位堿基C突變為TI.表達Red重組酶基因的大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化pLS134轉化至MG1655，以含50 μ g/ml的氨芐青霉素抗性進行篩選。將所得菌株單菌落接種至3ml LB液體培養基中，37° C振蕩過夜，以1/50體積轉至50ml LB，振蕩培養至菌體0D_約為O. 2時，加入終濃度為O. 15%的L-阿拉伯糖以誘導重組酶，繼續培養至OD600約為O. 4，將菌液倒入預冷的離心管，冰浴10分鐘，4° C，5000rpm離心5分鐘，棄上清。以冰冷的10%甘油洗滌沉淀兩次最后懸浮于200 μ I冰冷的10%甘油中，50 μ I每管分裝。
將溶解于雙蒸水的DNA加至50 μ I重組酶表達的電轉化感受態細胞中，輕彈混勻。將混合液轉移至冰上預冷的1_電轉杯中進行電擊轉化。電轉化條件200 Ω，1800V，美國Bio-Rad公司Gene Pulser IIk電轉化儀。加Iml LB液體培養基至電轉杯，吹打混勻，將溶液轉移至一個無菌的I. 5ml離心管中，37° C振蕩培養60分鐘后，轉化液涂布在含相應抗生素的抗性平板上，37° C培養。挑取單菌落，菌落PCR驗證基因型，擴增產物進行測序確證其突變。2. IacZ基因開放閱讀框的第70位堿基C突變為T在此實施例中，靶位點為IacZ基因開放閱讀框的第70位堿基C，突變位點為T，即將C突變為T。設計弓 I 物 R1161 5' - cactggccgicgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttaccT.4^ ( T
TAA TCGCCTTGCAGCACATCCCX Y IT. AACAAATAGGGGTTCCGCGC-3，, ( SEQ ID NO. 7),在此引物中，靶位點上游的50bp同源臂以小寫字母表示，突變位點以粗體字母表示，靶位點下游的30bp同源片段以斜體字母表示，擴增引物以下劃線字母表示；Rl 162 :5，-GCTATTACGCCAGCTGGCGA AA(Ki(；(；(；AT(；n；CT(； CAAGGCUAUAAC,ITTCCTTAGTTCCTATTCCGAAG-3’，(SEQ ID NO. 8)，在此引物中，靶位點下游的 30bp 同源片段下游的20bp的反向互補序列以常規字母表示，靶位點下游的30bp同源片段的反向互補序列以斜體字母表示，擴增引物以下劃線字母表示。R1161和R1162分別對應圖 I 中的 Pl 和 P4。R1102 :5’-GCCTCGTCCTGCAGTTCATTC-3’，(SEQ ID NO. 9), R1103 5’ -GAATGAACTGCAGGACGAGGC-3’，(SEQ ID NO. 10)，Rl 102 為卡那霉素抗性基因中 326至346的21bp序列，Rl 103為Rl 102的反向互補序列。Rl 102和Rl 103分別對應圖I 中的 P2 和 P3。R1163 :5，-CACTGGCCGTCGTTTTACAAC-3，，(SEQ ID NO. 11) ；R1164 5’ -GCTATTACGCCAGCTGGCGAAAG-3’，(SEQ ID NO. 12)，R1163 為 R1161 前端的 21bp 序列，R1164為R1162前端的23bp序列。R1163和R1164分別對應圖I中的P5和P6。以pLS135為模板，R1161和R1102為引物，PCR擴增得到O. 5kb的DNA片段，R1103和R1162為引物，PCR擴增得到O. 8kb的DNA片段。凝膠回收O. 5kb和O. 8kb，合并作為模板，以R1163和R1164為引物，0E-PCR擴增得到I. 3kb的DNA片段，電轉化至由上所得重組酶表達的電轉化感受態細胞，在含50 μ g/ml的氨節青霉素和30 μ g/ml卡那霉素的抗性平板上篩選。設計引物R1165 :5’-AACCGCCTCTCCCCGCGCGTTG-3’，(SEQ ID NO. 13) ；R1166 5’ -CATCAACATTAAATGTGAGCG-3’，(SEQ ID NO. 14)，Rl 165 為靶位點 C 上游 270bp 的序列，R1166為靶位點C下游203bp的序列。R1165和R1166分別對應圖I中的P7和P8。隨機挑選5個抗性克隆，分別以之基因組為模板，R1165和R1166為引物，5個克隆均經PCR擴增得到I. 7kb的DNA片段。將此I. 7kb以R1165和R1166為測序引物進行測序，序列分析表明其中的三個克隆發生了點突變。此時即得到IacZ點突變的、30bp同源片段以及兩側為I-SceI酶切位點的卡那霉素抗性基因整合至大腸桿菌基因組上的菌株。其中一個正確克隆的擴增產物為圖2中的第3泳道。將含點突變的抗性菌株接種至含20 μ g/ml熱處理的氯四環素的3ml液體LB中培養20小時，稀釋10_6后，涂布LB平板。隨機挑選25個克隆同時劃線至含30 μ g/ml卡那霉素和不含抗生素的LB固體平板進行培養，結果顯示所有的克隆均沒有卡那霉素抗性，這表 明卡那霉素抗性基因區域已失去。以MG1655原株和任意挑取5個沒有抗性的克隆，以R1165和R1166為引物菌落PCR擴增，擴增均得到595bp，MG1655原株和一個變株的擴增結果分別為圖2中的第2和第4泳道。分別以Rl 165為測序引物對MG1655原株和一個變株的Rl 165和Rl 166的擴增產物進行測序，測序圖譜見圖3的上半部分和下半部分?？梢娫跍y序圖譜中，在MG1655原株測序圖譜的第231位置處(即IacZ基因開放閱讀框的第70位堿基)為C，而IacZ點突變變株的第231位置處(即IacZ基因開放閱讀框的第70位堿基)為T，表明實現了 C突變為T，即點突變完成。實施例3nanA基因開放閱讀框的第574-576堿基GAA突變為AAC在此實施例中，靶位點為nanA基因開放閱讀框的第574-576堿基GAA，突變位點為AAC,即將GAA突變為AAC。設計弓 I 物 R1171 5' - agcagatccgtcgtgaacatcctgatcttgtgctctaraacggttacgacAAC^rCTTCGCCTCTGGTCTGCTGG(7 AACAAATAGGGGTTCCGCGC—3’，(SEQ ID NO. 15)，在此引物中，靶位點上游的50bp同源臂以小寫字母表示，突變位點以粗體字母表示，靶位點下游的30bp同源片段以斜體字母表示，擴增引物以下劃線字母表示；R1172 5’ -GTACTGCCGATACCACCATCAGC (；('('(('( (；( 'AGACC 'AGAGCK 'GAAGATTC 'C TTAGTTCCTATTCCGAAG-3’，(SEQ ID NO. 16)，在此引物中，靶位點下游的30bp同源片段下游的20bp的反向互補序列以常規字母表示，靶位點下游的30bp同源片段的反向互補序列以斜體字母表示，擴增引物以下劃線字母表示。R1171和R1172分別對應圖I 中的 Pl 和 P4。R1102 :5’-GCCTCGTCCTGCAGTTCATTC-3’，(SEQ ID NO. 9), R1103 5’ -GAATGAACTGCAGGACGAGGC-3’，(SEQ ID NO. 10)，Rl 102 為卡那霉素抗性基因中 326至346的21bp序列。Rl 103為Rl 102的反向互補序列，Rl 102和Rl 103分別對應圖
I中的 P2 和 P3。R1173 :5’-AGCAGATCCGTCGTGAACATC-3’，(SEQ ID NO. 17)；R1174 5’ -GTACTGCCGATACCACCATCAG-3’ (SEQ ID NO. 18)。R1173 為 R1161 前端的 21bp 序列，R1174為R1162前端的22bp序列，R1173和R1174分別對應圖I中的P5和P6。以pLS135為模板，R1171和R1102為引物，PCR擴增得到O. 5kb的DNA片段，R1103和R1172為引物，PCR擴增得到O. 8kb的DNA片段(R1102和R1103與實施例2中的引物相同)。凝膠回收O. 5kb和O. 8kb，合并作為模板，以Rl 173和Rl 174為引物，OE-PCR擴增得到I. 3kb的DNA片段，電轉化至由重組酶表達的電轉化感受態細胞(與實施例2相同)，在含50 μ g/ml的氨芐青霉素和30 μ g/ml卡那霉素的抗性平板上篩選。設計弓丨物R1175 :5’-TACAACATTCCAGCCCTGAG-3’，(SEQ ID NO. 19) ；R1176 5’ -GGAATACGCCCGTTTTGATC-3’，(SEQ ID NO. 20)，R1175 為靶位點 GAA 上游 164bp 的序列，R1176為靶位點GAA下游161bp的序列。R1175和R1176分別對應圖I中的P7和P8。隨機挑選5個抗性克隆，分別以之基因組為模板，R1175和R1176為引物，5個克隆均經PCR擴增得到I. 5kb的DNA片段。將此I. 5kb以R1175和R1176為測序引物進行測序，序列分析表明其中的三個克隆發生了點突變。此時即得到nanA點突變的、30bp同源片段以及兩側為I-SceI酶切位點的卡那霉素抗性基因整合至大腸桿菌基因組上的菌株。其中一個正確克隆的擴增產物為圖2中的第7泳道。將含點突變的抗性菌株接種至含20 μ g/ml熱處理的氯四環素的3ml液體LB中培養20小時，稀釋10_6后，涂布LB平板。隨機挑選25個克隆同時劃線至含30 μ g/ml卡那霉 素和不含抗生素的LB固體平板進行培養，結果顯示所有的克隆均沒有卡那霉素抗性，這表明卡那霉素抗性基因區域已失去。任意挑取5個沒有抗性的克隆，以R1175和R1176為引物菌落PCR，擴增均擴增得到349bp。MG1655原株和一個變株的擴增結果分別為圖2中的第6和第8泳道。分別以Rl 175對MG1655原株和一個變株的Rl 175和Rl 176擴增產物進行測序，測序圖譜見圖4的上半部分和下半部分?？梢娫跍y序圖譜中，在MG1655原株測序圖譜的第131-134位置處(即nanA基因開放閱讀框的第574-576堿基)為GAA，而nanA點突變變株測序圖譜的第131-134位置處(即nanA基因開放閱讀框的第574-576堿基)為AAC，表明實現了 GAA突變為AAC，即點突變完成。
權利要求
1.一種基于重組工程的大腸桿菌基因組點突變的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)通過重疊一延伸聚合酶鏈式反應獲得一個DNA修飾片段，所述DNA修飾片段依次由下列結構組成與基因組上位點待突變靶位點上游50bp序列一致的左端50bp同源臂、突變位點、與靶位點下游30bp序列一致的30bp同源片段、兩側為兩個歸巢核酸酶I-SceI酶切位點的卡那霉素抗性基因和與靶位點下游50bp序列一致的右端50bp同源臂所組成； (2)將含重組酶基因和I-SceI基因的質粒PLS134轉化至大腸桿菌MG1655中；所述的質粒PLS134是將PCR擴增的tetR-ptetA-1-SceI基因盒片段以NsiI酶切后，克隆至pBAD322的NsiI位點，得到重組克隆pLS133 ;再將exo，bet和gam三個重組酶基因從lambda噬菌體DNA中PCR擴增后，以NcoI和XhoI酶切后，克隆至pLS133的NcoI和SaII位點，得到目的質粒pLS134 ； (3)將步驟(I)得到的DNA修飾片段電轉化至以終濃度為O.15%的L-阿拉伯糖誘導下表達Red重組酶基因的步驟(2)的大腸桿菌電轉化感受態細胞中，通過重組酶介導的同源臂和大腸桿菌基因組上相同序列之間的同源重組，將所述DNA修飾片段中，左右50bp同源臂之間的片段整合至大腸桿菌基因組，在卡那霉素抗性篩選之下，獲得整合有突變位點、30bp同源片段和兩側為I-SceI酶切位點的卡那霉素抗性基因的卡那霉素抗性突變株； (4)將步驟(3)得到的菌株在含終濃度為20μg/ml熱處理的氯四環素的培養基中進行培養，熱失活的氯四環素誘導I-SceI酶的表達，I-SceI酶作用于整合在基因組上的I-SceI酶切位點，基因組發生雙鏈斷裂，促使菌株利用自身的重組功能催化30bp同源片段與靶位點下游30bp之間發生同源重組，從而將30bp同源片段、兩個I-SceI酶切位點及卡那霉素抗性基因消除，最終獲得發生點突變的大腸桿菌突變株。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于所待突變位點和突變位點是一個或多個堿基。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，首先通過一個聚合酶鏈式反應得到含左側50bp同源臂、突變位點、30bp同源片段、一個I-SceI酶切位點和5’端卡那霉素抗性基因的DNA片段，再通過另外一個PCR反應得到3’端卡那霉素抗性基因、一個I-SceI酶切位點和右側50bp同源臂的DNA片段，在5’端卡那霉素抗性基因和3’端卡那霉素抗性基因之間含21bp的重疊序列；隨后通過重疊一延伸聚合酶鏈式反應獲得兩側為50bp同源臂的含突變位點、30bp同源片段以及兩側為I-SceI酶切位點的卡那霉素抗性基因的融合DNA修飾片段。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，同源臂用于通過重組酶催化的同源重組將含突變位點的DNA修飾片段整合至大腸桿菌的基因組；右側的50bp同源臂為靶位點下游的50bp序列，此50bp序列的前30bp為同源片段；30bp同源片段用于同源重組以去除一段30bp序列、兩個I-SceI酶切位點及卡那霉素抗性基因的冗余序列，所得變株的基因組不含突變位點外任何序列。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于，重組酶基因是來自于lambda噬菌體的exo，bet和gam基因，重組酶基因是克隆在受L-阿拉伯糖所誘導啟動子之下；I-SceI基因克隆在受熱處理的氯四環素誘導的啟動子之下。含重組酶基因和I-SceI基因的質粒pLS134游離于大腸桿菌MG1655的基因組。
全文摘要
本發明涉及一種基于重組工程的大腸桿菌基因組點突變的方法。本方法是先通過重疊－延伸聚合酶鏈式反應獲得一個兩端為與靶位點兩側序列一致的各50bp同源臂，中間為突變位點、與靶位點下游序列一致的30bp同源片段、兩側為兩個歸巢核酸酶I-SceI酶切位點的卡那霉素抗性基因的修飾片段；然后將50bp同源臂之間的片段整合至大腸桿菌基因組，突變位點取代基因組上的靶位點，獲得卡那霉素抗性突變株。隨后熱失活的氯四環素誘導I-SceI酶的表達，催化30bp同源片段與靶位點下游30bp之間發生同源重組，從而將30bp同源片段、兩個I-SceI酶切位點及卡那霉素抗性基因消除，獲得發生點突變的大腸桿菌突變株。
文檔編號C12N15/63GK102703424SQ20121020321
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月19日 優先權日2012年6月19日
發明者尚廣東, 張飛飛, 石牡丹, 蔣伏歡 申請人:南京師范大學