專利名稱：一種微生物谷氨酰胺轉胺酶及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及酶工程領域，具體涉及一種微生物谷氨酰胺轉胺酶(MicrobialTransglutaminase,簡稱 MTG)及其應用。
背景技術：
谷氨酰胺轉胺酶(Transglutaminase, EC 2.3.2. 13,簡稱TG)可以催化?；D移反應，催化蛋白內谷氨酰胺Y-甲?；c賴氨酸的e-氨基交聯。在原核生物和真核生物中均存在TG。而微生物谷氨酰胺轉胺酶(MTG)由于其不依賴于鈣的活性，自從被發現以后就被廣泛應用于工業，在食品、化工、醫藥等行業均有廣泛使用。
微生物谷氨酰胺轉胺酶(microbial transglutaminase縮寫MTG)與凝血因子FACTOR XIII同屬于一個家族的酶，具有與其類似的作用效果，很多研究表明了其在凝血反應中的作用。利用MTG可以交聯明膠，形成良好的多空物或者網狀物，可以在多方面應用，例如交聯I型膠原蛋白，形成抗高溫的膠(Nomura Y, Toki S，Ishii Y, ShiraiK. Biosci Biotechnol Biochem. 2001Apr; 65 (4) :982-5), MTG 與明膠作用形成的膠不會受熱溶解(Chen T, Embree HD, Brown EM, Taylor MM, Payne GF. , Biomaterials. 2003Aug;24(17) :2831-41，美國專利5，834，232)并可用于細胞固定(Chen T, Small DA, McDermottMK, Bentley WE, Payne GF.，Biomacromolecules. 2003Nov_Dec; 4 (6) : 1558-63)，生物支架(Broderick EP,0’Halloran DM, Rochev YA, Griffin M, Collighan RJ, Pandit AS. J BiomedMater Res B Appl Biomater. 2005Jan 15;72(I):37-42. ；Chen RN, Ho HO, Sheu MT. Biomaterials. 2005Jul; 26 (20) :4229-35)?？梢杂肕TG增加明膠的交聯，以提高其強度和黏性，從而用于制作止血材料、止血敷料或止血用密封材料(McDermott MK, Chen T, WilliamsCM, Markley KM, Payne GF. Biomacromolecules. 2004 Jul-Aug; 5 (4) : 1270-9 ;中國專利200980131973. 6 和 200780051215. 4 ;美國專利8, 133，484 ；歐洲專利TO2012017415、W02011132153、BRPI0718328、ZA200904470、EP2303344、EP2303341 及 CN102124058)。對于醫療產品來說，酶的穩定性十分重要，特別是對于常溫保存的產品來說更是如此。但是MTG的最佳反應溫度一般在50°C _55°C左右，在常溫(25°C )時酶活只有最佳反應溫度的20%左右，即使是在體溫(37°C )左右，酶活也只有最佳酶活的一半左右(BuettnerK, Hertel TC, Pietzsch M, Amino Acids. 2012,42(2-3):987-96. ；Marx CK,HertelTC, Pietzsch M, J Biotechnol. 2008 Sep 10; 136 (3-4) : 156-62.) 此外，MTG 酶的熱穩定性比較差，60°C 10分鐘可以導致MTG酶活損失80%左右(Marx CK, Hertel TC, Pietzsch M,J Biotechnol. 2008 SeplO;136 (3-4):156-62.) 有文獻報道具有熱穩定性MTG的突變位點包括2位的絲氨酸突變為酪氨酸，23位的絲氨酸突變為纈氨酸或酪氨酸，24位的酪氨酸突變為天冬酰胺，294位的賴氨酸突變為亮氨酸或異亮氨酸；101位的絲氨酸突變為脯氨酸，250位的甘氨酸突變位有氨酸，157位的甘氨酸突變為絲氨酸。本發明提出一種新的微生物谷氨酰胺轉胺酶，其氨基酸序列結構不同于已經文獻報道，突變位點具有特定的組合，且最佳活性溫度向較低溫度偏離，還具有較好熱穩定性。

發明內容
本發明克服現有技術以上缺陷，提出了一種新的微生物酰胺轉氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，其中，第10位上的氨基酸為絲氨酸、組氨酸或蘇氨酸；第241位上的氨基酸為甘氨酸、蘇氨酸或丙氨酸；第284位上的氨基酸為纈氨酸、酪氨酸或丙氨酸。進一步地，所述第10位上的氨基酸為絲氨酸或者蘇氨酸；所述第241位上的氨基酸為丙氨酸或者甘氨酸；所述第284位上的氨基酸纈氨酸或者酪氨酸。進一步地，本發明的第10位氨基酸還可以是谷氨酰胺、脯氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、組氨酸或者蘇氨酸；第241位氨基酸還可以是谷氨酰胺、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸或者丙氨酸；第284位氨基 酸還可以是谷氨酰胺、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、組氨酸、甘氨酸、纈氨酸、酪氨酸或者丙氨酸。本發明中，所述微生物酰胺轉氨酶活性的反應溫度在25-75攝氏度之間。優選地，其酶活性的反應溫度在25-45攝氏度之間。更優選地，其酶活性為在25攝氏度時所述酶活性仍然不低于35U。本發明微生物酰胺轉氨酶的制備方法，包括以下步驟合成如SEQ ID NO. 8所示序列，將其克隆到大腸桿菌表達載體pET-32a并將其轉化到大腸桿菌BL21中，得到基因工程菌。將該基因工程菌發酵表達，并破碎菌體，用親和層析含有突變的MTG的融合蛋白。向融合蛋白溶液中按照融合蛋白的質量加入1/10質量的分散酶，37攝氏度作用30分鐘，用DEAE離子交換法純化。最終可以獲得突變MTG蛋白。本發明還提供了一種微生物酰胺轉氨酶的應用，是將如權利要求I所述的微生物酰胺轉氨酶在10-75攝氏度下交聯明膠。優選地，在25-45攝氏度下交聯明膠。更優選地，在室溫(25攝氏度)下將微生物酰胺轉氨酶與明膠組合應用。本發明微生物酰胺轉氨酶在室溫下催化明膠交聯的效率遠遠高于野生型的微生物酰胺轉氨酶。所述微生物酰胺轉氨酶用于催化明膠交聯，還可用于制備止血劑。本發明微生物谷氨酰胺轉胺酶(MTG)，可通過紫外誘變篩選得到，在70°C高溫條件處理后該MTG仍然體現了很高的殘余酶活。研究表明，本發明微生物谷氨酰胺轉胺酶的最佳活性溫度為40°C -50°C，優選為40°C，而野生型MTG的最佳活性溫度為55°C，可見，本發明微生物谷氨酰胺轉胺酶的最佳活性溫度明顯較低，且在常溫及室溫如25V _37°C時其比酶活顯著高于野生型MTG。通過DNA測序結果顯示，與野生型MTG相比，本發明微生物谷氨酰胺轉胺酶(MTG)發生了突變，例如，突變為第10位的丙氨酸或絲氨酸、第241位的脯氨酸或丙氨酸、第284位的絲氨酸或纈氨酸。發生了突變變異的本發明MTG在常溫下交聯蛋白的能力大大提高，從而可以在常溫高效粘合蛋白，可有效用于明膠制品的交聯。本發明微生物谷氨酰胺轉胺酶(MTG)具有新的氨基酸結構及新性能，在常溫及偏低溫度下具較好比酶活及最佳酶活性。本發明微生物谷氨酰胺轉胺酶的純化過程涉及蛋白質工程相關技術，可以在包括但不限于醫藥、食品等領域中作為包括但不限于輔助材料、藥物或者添加劑等應用。


圖I表示實施例I的本發明微生物谷氨酰胺轉胺酶的酶活測定標準曲線。圖2表示實施例2中部分誘變菌株的篩選結果示意圖。圖3表示實施例3中誘變菌株MTG基因的PCR產物電泳圖。圖4表示誘變的茂源鏈霉菌MTG基因與野生型MTG基因的核苷酸序列對比。圖5表示實施例6中純化的微生物谷氨酰胺轉胺酶蛋白電泳圖。圖6表示本發明微生物谷氨酰胺轉胺酶與野生型MTG在不同溫度下的酶活。
具體實施方式
結合以下具體實施例及附圖，對本發明作進一步的詳細說明。實施本發明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內容之外，均為本領域的普遍知識和公知常識，本發明沒有特別限制內容。實施例I酶活測定I)測酶活試劑配制A 液(0. 5L):將 0. 015mol (5. 06g)底物 Na-CBZ-Gln-Gly,0. 05mol (3. 475g)鹽酸羥胺、0. 005mol (I. 536g)還原型谷胱甘肽加入400ml蒸懼水于燒杯中，用磁力攪拌器攪拌20分鐘后，加入0. Imol (12. llg))Tris，用6mol/L(或lmol/L)鹽酸調pH至6. 0，將溶液移至500ml容量瓶中，用蒸餾水洗滌燒杯3次倒入容量瓶中，定容至500ml。B 液3mol/L HCl,12% 三氯乙酸(W/V)、5% 三氯化鐵(W/V，溶于 0. lmol/L 鹽酸，再過濾)按I: I: I的體積比混合。2)酶活測定放線菌發酵液過濾，取濾液稀釋5倍。實驗組取0.2ml稀釋液，加2ml A液37V溫育10分鐘，再加2ml B液。對照組取0. 2ml稀釋液，加2ml B液37°C溫育10分鐘，再加2mlA液。于525nm測定吸光值。實驗結果如圖I所示酶活測定標準曲線，橫坐標為酶活單位(U/mL)，縱坐標為酶反應液在525nm處的吸光值，圖I表明該曲線的線性較好，相關系數大于99%。實施例2野生菌株的誘變野生型MTG菌株為茂源鏈霉菌(Streptomyces mobaraensis) STK4菌株。野生型MTG的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。培養基配置高氏一號培養基(g/L):可溶性淀粉20，KN031, MgS04 7H20 0. 5，K2HP04 3H20 0. 5，NaCl 0. 5，FeS04 7H20 0. 01，瓊脂 20，pH 7. 2-7. 4。發酵培養基(g/L):甘油 20，酵母膏 6，魚粉蛋白胨 25，MgS04 7H20 2，K2HP04 3H20 2，pH 7.4。向高氏一號培養基中加入IOml冷無菌水，用接種針充分刮取表面菌絲，打散孢子，無菌濾紙過濾。操作在紅燈或避光條件下進行，提前0. 5h開紫外燈，使光源穩定。取濃度約為107個孢子/mL的孢子懸浮液3ml置于直徑為6cm滅菌平皿中，利用磁力攪拌子攪拌，在紫外燈功率15W條件下，不同輻照距離，紫外輻照不同的時間進行誘變。避光Ih后，暗環境中將不同稀釋度的孢子懸液涂布于高氏培養基上。30°C培養7天。
挑取單菌落，在發酵培養基中培養24小時，分別測定37°C時候選菌株和野生菌株的酶活。部分篩選結果如圖2所示，其中，WT表示未經誘變的野生型菌株的發酵酶活；1#-5#分別是5株不同的誘變菌株的發酵酶活。MTG的酶活(U/mL)為發酵液的酶活，測定酶活的反應溫度為37°C。圖2表明2#菌株的酶活較野生菌株高。實施例3突變體MTG基因的獲取基因組抽提將實施例2中液體培養的2#突變菌株的新鮮菌絲體接種于新鮮培養基，培養24小時左右；離心收集IOml菌體；新鮮菌體于研缽(一 20°C預冷)中，反復液氮研磨至細粉狀，迅速平均分裝至2個I. 5mL離心管中；加TE Buffer 550 y L，加65°C預熱的20% SDS溶液30 u L，漩渦振蕩5S，加20mg/mL蛋白酶K 20 u L,輕輕混勻，37°C保溫Ih ;加等體積Tris飽和酹/氯仿/異戍醇(25 24 I)抽提,輕微顛倒混勻，IOOOOr / min離心IOmin ;小心吸取上清至新離心管中,加等體積氯仿/異戍醇(24 I)抽提,IOOOOr / min,離心5min ;吸取上清液與等體積異丙醇(4°C預冷)混勻,然后IOOOOr / min離心5min,棄上清。沉淀用lmL70%乙醇(4°C預冷)洗漆(顛倒、離心Imin),自然風干,加入40uL TE溶解，-20°C保存備用。 引物設計設計了一對引物可以通過聚合酶鏈式反應獲取MTG基因的全序列，如SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2 所示Pf:CTCAACGAAAGCGCTCCGGCCGCTTC ；Pr:CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGC。PCR反應體系及反應條件將上述獲得的基因組DNA和引物混合，按如下條件進行PCR 反應=Taq 酶反應液(2 倍濃度)25 y L、引物 Pf (2. 5mmol/mL) 2 y L、引物 Pr (2. 5mmol/mL) 2 ii L、DNA2 u L及無菌水。94°C變性I分鐘、55 °C退火30秒、72°C 2分鐘，一共40個循環。電泳檢測PCR純度，結果如圖3所示，左邊泳道是分子量標準DNA，右邊泳道為PCR片段電泳結果。PCR片段大小在IOOObp與2000bp之間，與理論值1058bp —致。實施例4突變MTG基因的測序向實施例3中的PCR產物中加入2倍體積的無水乙醇，混勻，室溫放置5分鐘。12000rmp離心10分鐘，棄盡上清；用70%的乙醇洗沉淀一次。干燥，用50 y L無菌水溶解沉淀。按如下體系反應無菌水溶解的PCR產物I y L、pUC19-T載體(Takara公司)0. 5 y L、連接酶0. 5 u L、緩沖液(10倍濃度)5 ii L及無菌水43 u L，混勻，16°C反應20分鐘。將上述反應后的產物取5 iiL，加入到IOOii L大腸桿菌DH5 a感受態細胞(Takara公司)，4°C反應30分鐘，42°C反應90秒，加入LB培養基，37°C培養I小時，將菌液涂布與LB平板上。待菌落形成后，送測序公司測序。測序結果如圖4所示，與野生型MTG基因相比較，實驗獲得的2#突變株的MTG基因發生了突變，其中，第28位的G突變為T，第721位的C突變為G，第850位的A突變為G，第851位的G突變為T，如SEQ ID NO. 4所示。這些突變直接導致了 MTG氨基酸序列中第10位氨基酸Xaa由丙氨酸突變為絲氨酸，第241位氨基酸Yaa由脯氨酸突變為丙氨酸，第284位氨基酸Zaa由絲氨酸突變為纈氨酸，如SEQ ID NO. 5所示。實施例5MTG蛋白的一般純化發酵培養基和菌株同實施例2，將茂源鏈霉菌孢子接種到裝有30mL發酵培養基的，培養28小時。在4°C離心機中12000rmp離心30分鐘，去除菌體和固體雜質，獲得20mL培養基上清。加入40mL無水乙醇，4°C放置I小時。4°C離心機中12000rmp離心30分鐘，棄盡上清，收集沉淀。將沉淀置于安倍瓶，冷凍干燥機中凍干36小時，即得到初步提純的野生型MTG蛋白。
將突變的茂源鏈霉菌孢子接種到裝有30mL發酵培養基的，培養24小時。其他操作步驟同上，純化得到突變MTG蛋白。實施例6本發明突變MTG蛋白的精細純化將實施例5中得到的蛋白利用離子交換柱進行蛋白精細純化。填料為DEAE-825，平衡液為0. 05M的tris緩沖液，pH7. 4。流動相為pH6. 0的0. lmol/L磷酸二氫鈉緩沖液。收集各個組分，電泳檢測，得到純度較好的MTG蛋白。將該組分脫鹽后凍干。電泳結果如圖5所示，左邊泳道顯示的是分子量標準蛋白質，右邊泳道顯示的是純化后的MTG蛋白。實驗結果顯示該蛋白大小與預期37. 9kDa的分子量大小一致，而且純度很高，電泳只有單一的條帶，純度大于99%。實施例6不同溫度下突變MTG蛋白的比活性測定 將純化得到的野生型MTG蛋白和本發明突變MTG蛋白分別在25 °C、37 °C >45 V、55°C、75°C下測定酶活。測定酶活所用方法同實施例I所述。測活使用的溶液在反應前分別在對應的溫度下預熱2分鐘。實驗結果如圖6所示，在不同反應溫度下，本發明突變MTG的比酶活表現出了與野生型MTG完全不同的走勢。本發明突變MTG最佳反應溫度在45°C左右，而野生型MTG最佳反應溫度在55°C左右，本發明MTG最佳反應溫度明顯低于野生型MTG0而且，在25°C _75°C下，本發明MTG比酶活均顯著高于野生型。在37°C時本發明MTG比酶活達到了 41U/mg，比野生型MTG酶活高了 51. 9%。此外，在55°C以上的高溫條件下野生型MTG活性急劇下降而本發明MTG仍保留較高酶活。65°C _75°C時本發明MTG仍保留較高酶活，而此時野生型MTG幾乎已經失活?？梢?，比野生型MTG相比較，本發明突變MTG具有顯著良好的酶活力以及耐熱穩定性。實施例7本發明突變MTG蛋白與明膠的作用(I)不同濃度的本發明MTG和野生型MTG與明膠的相互作用將含有20%低熔點明膠的溶液加熱至60°C并劇烈攪拌，然后將溶液置于37°C保溫過夜備用，制備得到明膠溶液。在50mL上述明膠溶液中分別加入0. lmg、ImgUOmg野生型MTG (對照組)、本發明MTG (實驗組)，測定粘度。粘度測試在每次粘度計測試中，將上述加入MTG的明膠溶液置于燒杯中，追蹤混合的明膠-MTG溶液經歷膠凝時的粘度。通過記錄每個測試組達到最大粘度的30%和90%所需的時間來比較不同的測試組，所述最大粘度能夠在比速下且具有用于那個測試的特定轉自的粘度計記錄。本實驗采用具有T-E“t-bar”轉子的DV II+PR0數字粘度計(Brolkfield公司)轉子最大可記錄粘度是10 X 106cP,因此，30%和90%點分別為3 X 106cP和9 X 106cP。整個反應過程測試溶液都浸沒在37°C水浴中。NT表示10分鐘后仍未達到預定粘度。結果如表I所示，在相同MTG酶濃度下本發明突變MTG的膠凝效果遠遠優于野生型MTG，且隨著酶濃度提高，凝膠效果也隨之極大地提高。實驗結果還表明，在較低濃度(0. Img)時，本發明仍然可以使明膠凝固，而野生型不能使明膠凝固。表I本發明突變MTG和野生型MTG對凝膠時間的影響
權利要求
1.一種微生物酰胺轉氨酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，其中，第10位上的氨基酸為絲氨酸、組氨酸或蘇氨酸；第241位上的氨基酸為甘氨酸、蘇氨酸或丙氨酸；第284位上的氨基酸為纈氨酸、酪氨酸或丙氨酸。
2.如權利要求I所述的微生物酰胺轉氨酶，其特征在于，所述第10位上的氨基酸為絲氨酸或蘇氨酸；所述第241位上的氨基酸為丙氨酸或甘氨酸；所述第284位上的氨基酸為纈氨酸或酪氨酸。
3.如權利要求I所述的微生物酰胺轉氨酶，其特征在于，其酶活性的反應溫度在25-75攝氏度之間。
4.如權利要求3所述的微生物酰胺轉氨酶，其特征在于，其酶活性的反應溫度在25-45攝氏度之間。
5.如權利要求3所述的微生物酰胺轉氨酶，其特征在于，其酶活性為在25攝氏度時的酶活性不低于35U。
6.一種微生物酰胺轉氨酶的應用，其特征在于，將如權利要求I所述的微生物酰胺轉氨酶在25-75攝氏度下交聯明膠。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于，將所述微生物酰胺轉氨酶在25-45攝氏度下交聯明膠。
8.—種微生物酰胺轉氨酶的應用，其特征在于，將如權利要求I所述的微生物酰胺轉氨酶與明膠交聯用于止血。
全文摘要
本發明提供一種新的微生物谷氨酰胺轉胺酶(MTG)，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其中，第10位上的氨基酸為絲氨酸、組氨酸或蘇氨酸；第241位上的氨基酸為甘氨酸、蘇氨酸或丙氨酸；第284位上的氨基酸為纈氨酸、酪氨酸或丙氨酸。所述微生物谷氨酰胺轉胺酶在常溫下具有強比活力，用于交聯明膠，可用作止血材料。
文檔編號C12R1/465GK102719411SQ201210202170
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月18日 優先權日2012年6月18日
發明者劉明耀, 金明飛, 高紅亮 申請人:華東師范大學