專利名稱：一株降解纖維素的大腸埃希氏菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株大腸埃希氏菌。
背景技術(shù)：
作為農(nóng)業(yè)大國，我國每年產(chǎn)生的農(nóng)作物秸桿的量居全世界首位，但農(nóng)作物秸桿等纖維素的利用率與發(fā)達(dá)國家仍有很大差距，所以纖維素資源的綜合利用已經(jīng)迫在眉睫。纖維素的利用前期處理是關(guān)鍵，前期處理方法主要有酸化法、堿化法、氧化法、物理法和生物法等方法。與其它方法相比，生物法處理纖維素具有綠色環(huán)保、方法簡便、處理成本低等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株降解纖維素的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，可在低溫下降解纖維素，為纖維素降解提供微生物資源基礎(chǔ)。本發(fā)明降解纖維素的大腸埃希氏菌為大腸埃希氏菌(Escherichia coli) J-019,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2012年5月21日，保藏號為CGMCC No. 6126 ;本發(fā)明大腸埃希氏菌J-019為革蘭氏陰性菌，桿狀，細(xì)胞大小為(O. 3 μ m O. 4 μ m) X (I μ m 3 μ m)，無芽孢，周身鞭毛，能運(yùn)動；在肉汁胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈圓形，顏色為乳白色(如圖I所示)。本發(fā)明大腸埃希氏菌J-019接觸酶試驗(yàn)呈陽性，氧化酶試驗(yàn)呈陰性，甲基紅反應(yīng)呈陽性，V-P反應(yīng)呈陰性。本發(fā)明大腸埃希氏菌J-019可分解葡萄糖產(chǎn)酸，能夠分解D-蜜二糖、甲基葡糖苷、糊精、D-棉子糖、L-鼠李糖、蔗糖、D-海藻糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、D半乳糖和D-山梨醇。本發(fā)明的大腸埃希氏菌(Escherichia coli) J-019通過16S rDNA序列比對分析，保守區(qū)相似性為99%，與埃希氏菌屬(Escherichia)的16S rDNA序列的同源性最高，通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結(jié)果確定大腸埃希氏菌J-019屬于埃希氏菌屬(Escherichia)。本發(fā)明大腸埃希氏菌J-019能夠產(chǎn)纖維素酶，可在低溫下降解纖維素。本發(fā)明的大腸埃希氏菌(Escherichia coli) J-019屬于埃希氏菌屬(Escherichia),保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2012年5月21日，保藏號為CGMCCNo.6126。


圖I為本發(fā)明大腸埃希氏菌J-019的菌落形態(tài)照片；圖2為具體實(shí)施方式
二中大腸埃希氏菌J-019在剛果紅纖維素鑒別培養(yǎng)基上生長的照片；圖3為大腸埃希氏菌J-019隨培養(yǎng)時間變化的產(chǎn)酶曲線圖；圖4為大腸埃希氏菌J-019隨起始pH值變化的產(chǎn)酶曲線圖；圖5為大腸埃希氏菌J-019隨培養(yǎng)基不同氮源變化的產(chǎn)酶曲線圖；圖6為大腸埃希氏菌J-019隨接種量變化的產(chǎn)酶曲線圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式降解纖維素的大腸埃希氏菌為大腸埃希氏菌(Escherichia coli) J-019,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2012年5月21日，保藏號為 CGMCC No. 6126。
本實(shí)施方式大腸埃希氏菌(Escherichia coli) J-019為革蘭氏陰性菌，桿狀，細(xì)胞大小為(O. 3 μ m O. 4 μ m) X (I μ m 3 μ m),無芽孢,周身鞭毛,能運(yùn)動；在肉汁胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈圓形，顏色為乳白色。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第八版和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對大腸埃希氏菌J-019進(jìn)行生理生化鑒定大腸埃希氏菌J-019接觸酶試驗(yàn)呈陽性，氧化酶試驗(yàn)呈陰性，甲基紅反應(yīng)呈陽性，V-P反應(yīng)呈陰性。大腸埃希氏菌J-019可分解葡萄糖產(chǎn)酸，能夠分解D-蜜二糖、甲基葡糖苷、糊精、D-棉子糖、L-鼠李糖、蔗糖、D-海藻糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、D半乳糖和D-山梨醇。本實(shí)施方式大腸埃希氏菌J-019可在肉汁胨培養(yǎng)基上生長，肉汁胨培養(yǎng)基由3g牛肉膏、Og蛋白胨、5g NaCl和IOOOmL蒸餾水組成，pH為7. 2 7. 4。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式大腸埃希氏菌(Escherichia coli) J-019是由哈爾濱道里區(qū)太平鎮(zhèn)農(nóng)戶養(yǎng)殖的牛糞中篩選得到。篩選按以下步驟進(jìn)行取5g牛糞，用無菌水稀釋成KT1 10_9的各級濃度的稀釋液，將裝有初篩培養(yǎng)基的試管編號為I至9號,然后在每個試管中加入一張濾紙條(5X0. 7cm或7X Iem),使濾紙條貼于試管內(nèi)壁，濾紙條的一半進(jìn)入試管中的初篩培養(yǎng)基中，一半暴露于空氣中，然后將試管于121°C滅菌20-30min。用無菌移液管各吸取ImL各級濃度的稀釋液對號接種到裝有初篩培養(yǎng)基的試管中，于5°C培養(yǎng)至濾紙條上出現(xiàn)潰爛斑，選擇濾紙潰爛程度高的試管，從潰爛處挑取菌落于分離培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，分離至得到純化的單菌落，將得到的單菌落點(diǎn)種于剛果紅纖維素鑒別培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h，測量分解纖維素的透明圈直徑大小，進(jìn)行初篩，得到4株細(xì)菌菌株。將初篩得到的4株細(xì)菌菌株接入細(xì)菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，采用3，5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)分別測定4株菌株產(chǎn)纖維素酶的酶活，酶活分別為523U、422U、466U和407U，其中酶活最高的菌株即為大腸埃希氏菌J-019。所述初篩培養(yǎng)基由Ig Κ2ΗΡ04、0· Ig FeCl3 · 5Η20、0· 3g MgSO4 · 7Η20、0· Ig CaCl2,O. Ig NaCl、2. 5g NaNO3 和 IOOOmL 蒸餾水組成，pH 為 7. 2 7. 4。所述分離培養(yǎng)基平板由質(zhì)量濃度為O. 5%的CMC-Na、IOOmL營養(yǎng)鹽和質(zhì)量濃度為2% 的瓊脂組成，pH 為 7. 2 ;其中所述營養(yǎng)鹽由 O. 5g(NH4)H2PO4,2. 5g MnSO4 *H20,2g K2HPO4,
7.5mg FeSO4 · 7H20、2g MgS04、0. 3g NaCl 和 IOOOmL 自來水組成。所述剛果紅纖維素鑒別培養(yǎng)基由O. 5g K2HPO4^O. 25g MgSO4^O. 24g剛果紅、14. OOg瓊脂、I. 88g纖維素粉、2. OOg明膠、IOOmL 土壤浸汁和900mL蒸餾水組成，pH為7. O。剛果紅纖維素鑒別培養(yǎng)基在配制前應(yīng)對纖維素粉進(jìn)行預(yù)處理，纖維素粉應(yīng)加lmol/L的HCL溶液浸泡12h，然后蒸餾水洗多次至pH值中性，烘干。所述土壤浸汁的制備方法為取土壤50克，加水200毫升，15磅蒸煮I小時，經(jīng)濾紙過濾后加水補(bǔ)足到200毫升。所述細(xì)菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基由O. 3 %蛋白胨、O. 03 % MgSO4 · 7Η20、0· 05 %酵母膏、
O.03% CaCl2 ·2Η20、0· 4% ΚΗ2Ρ04、0· 5% CMC-Na 和蒸餾水組成，pH 為 7. 2 7. 3 (以上為質(zhì)量百分含量)。對篩選得到的大腸埃希氏菌J-019進(jìn)行分子鑒定，按以下步驟進(jìn)行用熱破壁法提取菌株的總DNA，采用細(xì)菌的16S rDNA通用引物，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后利用膠回收試劑盒(購自于大連寶生物工程有限公司)回收純化PCR產(chǎn)物，之后進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆子菌落，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后委托上海生工生物技術(shù)有限公司測序。大腸埃希氏菌J-019的16SrDNA序列長度為1404bp，其序列如SEQ ID NO 1所示，將序列與GenBank中的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對，同源性分析結(jié)果表明，該序列與埃希氏菌屬(Escherichia)的16S rDNA序列的同源性最高，保守區(qū)相似性為99%，通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結(jié)果確定大腸埃希氏菌J-019屬于埃希氏菌屬(Escherichia)。大腸埃希氏菌J-019的菌體形態(tài)、生理生化和16S rDNA序列數(shù)據(jù)由中國科學(xué)院微生物研究所鑒定完成。PCR引物購買自上海生工生物技術(shù)有限公司，其他試劑購自于大連寶生物工程有限公司。將大腸埃希氏菌J-019接種到剛果紅纖維素鑒別培養(yǎng)基上培養(yǎng)，5°C溫度培養(yǎng)48h，在菌落周圍形成透明水解圈，水解圈的直徑如表I所示，照片如圖2所示。說明大腸埃希氏菌J-019可在低溫下降解纖維素。
權(quán)利要求
1.一株降解纖維素的大腸埃希氏菌，其特征在于解纖維素的大腸埃希氏菌為大腸埃希氏菌(Escherichia coli) J-019,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2012年5月21日，保藏號為 CGMCC No. 6126。·
全文摘要
一株降解纖維素的大腸埃希氏菌，本發(fā)明涉及一株大腸埃希氏菌。本發(fā)明提供了一株降解纖維素的大腸埃希氏菌，可產(chǎn)生纖維素酶，為纖維素降解提供微生物資源基礎(chǔ)。本發(fā)明解纖維素的大腸埃希氏菌為大腸埃希氏菌J-019，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2012年5月21日，保藏號為CGMCC No.6126。大腸埃希氏菌J-019能夠產(chǎn)纖維素酶，可高效降解纖維素。用于纖維素的生物降解。
文檔編號C12R1/19GK102965297SQ201210209568
公開日2013年3月13日 申請日期2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月25日
發(fā)明者張先成, 孟利強(qiáng), 殷博 申請人:黑龍江省科學(xué)院微生物研究所