專利名稱：一株沙雷氏菌株及其處理土壤和果蔬表面殺撲磷農藥殘留的方法
技術領域：
本發明屬于環境微生物修復技術領域，具體涉及到沙雷氏菌株SPL-2及其處理土壤和果蔬表面殺撲磷農藥殘留的方法。
背景技術：
農藥為糧食的增產起到了重要的保障作用，也因此在世界各國的農業生產中被廣泛使用。但是，農藥的過分使用產生了嚴重的負面影響。農藥殘留很難降解，人們在使用農藥防止病蟲草害的同時，也使糧食、蔬菜、瓜果等農藥殘留超標，污染嚴重，同時給非靶生物 帶來傷害。在我國，影響蔬菜、水果等鮮食農產品質量安全諸多因素中，最突出的也正是農藥殘留超標，特別是禁限用高毒農藥殘留超標問題。近年來全國因誤食有殘留農藥果蔬中毒案也屢屢發生，日益遞增；
研究表明，果蔬中殘留農藥在人體內長期蓄積滯留會引發慢性中毒，比急性中毒更為可怕，其主要是通過生物濃縮，果蔬殘留兩個方面的途徑對人體健康帶來威脅，以致誘發許多慢性疾病，如心腦血管病，糖尿病、肝病、癌癥等。更讓人難以始料和防范的是農藥在人體內的蓄積，還會通過懷孕和哺乳傳給下一代，殃及子孫后代的健康；
農藥不合理的大量使用給人類及生態環境造成了越來越嚴重的不良后果，農藥的污染問題已成為全球關注的熱點。因此，加強農藥的生物降解研究、解決農藥對環境及食物的污染問題，是人類當前迫切需要解決的課題之一。農藥殘留廣泛分布于土壤，水體，大氣以及農產品中，難以利用大規模的工程措施消除污染，而控制農藥污染源和開發去除農藥新技術是解決農藥殘留的基本方法。自然界中，微生物可以對農藥污染進行降解，這是依靠自然力量、同時不產生二次污染的最理想途徑。因此利用微生物技術處理農藥殘留，并對受污染的果蔬與水體進行生物修復是一種行之有效的方法；
殺撲磷是ー種廣譜的有機磷殺蟲劑，具有觸殺、胃毒和滲透作用，能滲入植物組織內，對咀嚼式和刺吸式ロ器害蟲均有殺滅效力，使用十分廣泛。但也因其殘留嚴重，并進入食物鏈，危害人類及其他動物健康，而受到廣泛關注。殺撲磷屬高度毒性殺蟲劑，能抑制人體膽堿酯酶活性，蓄積于神經系統后導致惡心、頭暈、甚至神志不清，高濃度暴露可造成呼吸麻痹和死亡。因此，尋找ー種去除環境中殺撲磷農藥殘留高效安全的方法成為關注的焦點，而利用殺撲磷高效降解菌劑應用于其污染環境的治理具有重要的現實意義和應用前景。

發明內容
本發明的目的是針對目前農業生產中農藥殘留污染的實際問題和需要，提供ー種殺撲磷殺蟲劑降解菌。本發明的另一目的是提供了使用殺撲磷降解菌制備油包水菌劑的方法，從而通過緩釋作用緩慢維持菌種營養物質的供給，大大延長產品的保質期，使用本菌劑產品可以使田間殺撲磷殘留量降低85%以上，且生產成本低廉，使用方便，具有廣闊的市場前景。
技術方案
本發明提供ー種殺撲磷降解菌，該菌株為革蘭氏染色陰性的沙雷氏菌屬(Serratiasp.)，主要生物學特性為G-，兼性厭氧細菌，大小為0.7-0. 9μπι X I. 0-1. 2 μ m，呈桿狀，無芽孢，周生鞭毛有動力，單個或短鏈狀排列。在LB固體培養基上培養18h后的菌落呈紅色，凸狀，不透明，濕潤，不規則；能夠利用葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇；能夠還原硝酸鹽；利用檸檬酸鹽可使明膠水解；甲基紅、氧化酶、苯丙氨酸反應實驗呈陰性；VP反應、過氧化氫酶反應顯陽性；三塘鐵瓊脂試驗不產生硫化氫。該菌株16SrDNA的Genbank登錄號為JN400353。該菌的最適生長pH為7. 2-8.0，最適生長溫度為37°C。該降解菌可以通過發酵エ業通用發酵設備進行生產，成本低廉，菌劑直接噴灑使用方便，易于推廣大規模應用；
使用上述殺撲磷降解菌生產菌劑產品的エ藝流程為斜面種一藥瓶種子液一種子罐一發酵罐一菌劑產品；
本發明的詳細實施步驟為
(O挑取殺撲磷殘留降解菌Serratia sp. SPL-2的單菌落接種于試管斜面；
(2)將殺撲磷殘留降解菌SPL-2的斜面種接種于LB培養基搖瓶中，振蕩培養至對數生長期；
(3)將上述培養好的菌液按15%體積接種量轉入種子罐，繼續培養至對數生長期；
(4)將達到對數生長期的種子液按15%的接種量接入生產罐中培養；
(5)發酵完成后將細菌培養液制成油包水劑型，并用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型產品；
步驟2中所述LB培養基配方為酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L, pH 7. 0-7. 2 ；
步驟3與4中種子罐和發酵罐的培養基相同，配方為葡萄糖5g/L，NH4NO3 10g/L,K2HPO4 2 g/L, MgSO4*7H20 0.5 g/L, Na2HPO4 2 g/L, CaCO3 3g/L，NaCl I. 0 g/L，酵母膏 0.5g/L，pH 7. 0-7. 2 ；
種子罐和發酵罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:0. 8-1. 5，攪拌速度為150-220轉/分鐘，培養溫度為28-35°C，全程培養時間為48-72小吋，結束后菌體60億個/ml ；
步驟5所研制的油包水劑型中添加的油相為10號白油，乳化劑為span80，助溶劑為吐溫80。將發酵液制成油包水后可使其中的營養物質懸浮穩定地包裹在降解菌周圍，通過緩釋提供營養底物保持菌種的活性，防止降解菌的沉淀，并且油相可以給降解菌提供適宜的濕潤環境，從而大大延長菌劑產品的保質期。使用時直接噴灑到果蔬表面，由于油包水的保水特性可以使營養物的緩慢釋放從而維持菌的活性，提高果蔬表面農殘的降解率，同時還可防止果蔬失水、褐變等現象的發生。本發明的有益效果
I本發明提供一種有機磷農藥殺撲磷的降解菌，田間土壤和果蔬修復實驗結果表明，對殺撲磷的降解率達到85%以上；
2使用該方法生產的殺撲磷降解菌劑具有生產成本低，使用方便，降解效果好的優點，適合在糧食蔬菜水果生產出ロ基地和緑色食品生產基地大規模使用。該發明對于保護生態環境，保護人民的身體健康，增加農產品的附加值有著重要的意義。
具體實施方式
實施例I
采集成都農泉驛區連續幾年施用殺撲磷殺蟲劑的桃園田表層土壤。稱取采集的農藥污染土樣5g，過20目篩后加到IOOml含50mg/l殺撲磷的滅菌基礎鹽培養基中，基礎鹽培養基的配方為(均為 g/L) =NH4NO3 I. O, MgSO4*7H20 O. 5，(NH4)2SO4 O. 5，KH2PO4 O. 5，NaCl O. 5，K2HPO4 1.5，PH:7. 0-7. 2，于37°C，180r/min振蕩培養。7d后取5ml菌液接入同樣培養基中37°C下培養，傳代過程中殺撲磷的濃度逐步提高到400mg/l，傳代6次，大約7d傳代I次。將富集的農藥降解菌菌液用無菌水作10倍梯度(10_7、10_8、10_9 )稀釋，分別取O. ImL菌懸液涂布在含有50 mg/L殺撲磷的無機鹽固體培養基上，37°C培養；當平板出現菌落時，將單菌落在無機鹽農藥平板上劃線分離、純化菌株。將生長快、菌落規則、傳代穩定的單菌落斜面保存。將初篩得到的4株菌活化，接入100mg/l殺撲磷基礎鹽培養基中，37°C，180r/min培養10d，測其降解率。通過復篩，得到降解率最高的菌株SPL-2。經16SrDNA序列分析，發現菌株SPL-2與Serratia sp. FS014的序列相似性為99%,與Serratia sp. HAl的序列相似性也為99%，GenBank登錄號JN400353。因此SPL-2應歸屬于沙雷氏菌屬，主要生物學特性為G-，兼性厭氧細菌，大小為0.7-0. 9μπι X I. 0-1. 2μπι，呈桿狀，無芽孢，周生鞭毛有動力，單個或短鏈狀排列。在LB固體培養基上培養18h后的菌落呈紅色，凸狀，不透明，濕潤，不規則；能夠利用葡萄糖、半乳糖、鹿糖、麥芽糖、山梨醇；能夠還原硝酸鹽；利用檸檬酸鹽可使明膠水解；甲基紅、氧化酶、苯丙氨酸反應實驗呈陰性；VP反應、過氧化氫酶反應顯陽性；三塘鐵瓊脂試驗不產生硫化氫；
實施例2
取實施例I中革蘭氏染色陰性的沙雷氏菌的斜面接種于IOOmlLB培養基中，LB培養基(g/Ι)配方如下蛋白胨10，酵母提取物5, NaCl 10，pH 7. 0-7. 2，恒溫振蕩培養至對數期，獲得菌液。將上述培養好的菌液按15%體積接種量轉入已經121°C高壓濕熱滅菌并冷卻至35°C左右的種子罐，種子罐培養基配方為葡萄糖5g/L，NH4NO3 10g/L , K2HPO4 2 g/L, MgSO4 ·7Η20 O. 5 g/L, Na2HPO4 2 g/L, CaCO3 3g/L, NaCl I. 0 g/L，酵母膏 0.5 g/L, pH:7. 0-7. 2 ;繼續培養至對數生長期，培養過程中無菌空氣的通氣量為1:1.5，攪拌速度為200轉/分鐘，培養溫度為35°C。將達到對數生長期的種子液按15%的接種量接入生產罐培養，發酵罐所用培養基與種子罐相同，接種后的發酵溫度控制在28-35°C，無菌空氣的通氣量為1:0. 8-1. 5，攪拌速度為150-220轉/分鐘，全程發酵培養時間為48-72小時，發酵結束后菌體數量達到60億個/ml。發酵完成后按照一定的油水比例在乳化劑的作用下將細菌培養液制成油包水劑型，然后用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型；
應用例I
選取龍泉生產的枇杷為實驗對象，噴灑一定濃度的殺撲磷，待農藥液滴消失后，采樣測其農藥初始含量。實驗組噴灑降解菌劑SPL-2，對照組不噴灑降解菌劑。經過7天的降解，采樣測其農藥殘留含量。降解前樣品上殺撲磷的含量為6. 26 mg/kg，降解后實驗組含量為O. 88mg/kg降解率為85. 9%，而對照組殺撲磷的含量為4. 89 mg/kg,降解率僅為21. 9%，實驗組降解率是對照組的3. 9倍。(見表I); 表I.沙雷氏菌在實驗室條件下對枇杷表面殺撲磷殘留的降解
權利要求
1.一種殺撲磷農藥殘留降解菌，其特征在于該微生物是革蘭氏染色陰性的沙雷氏菌屬(Serratia sp.)的SPL-2菌株，主要生物學特性為G-，兼性厭氧細菌，大小為O. 7-0. 9 μ mX I. 0-1. 2 μ m，呈桿狀，無芽孢，周生鞭毛有動力，單個或短鏈狀排列；在LB固體培養基上培養18h后的菌落呈紅色，凸狀，不透明，濕潤，不規則；能夠利用葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇；能夠還原硝酸鹽；利用檸檬酸鹽可使明膠水解；甲基紅、氧化酶、苯丙氨酸反應實驗呈陰性；VP反應、過氧化氫酶反應顯陽性；三塘鐵瓊脂試驗不產生硫化氫；該菌株16SrDNA 的 Genbank 登錄號為 JN400353。
2.利用權利要求I所述的沙雷氏降解菌株研制成殺撲磷殘留降解菌劑，其特征在干，具體制備エ藝如下 (O挑取殺撲磷殘留降解菌Serratia sp. SPL-2的單菌落接種于試管斜面； (2)將殺撲磷殘留降解菌SPL-2的斜面種接種于LB培養基搖瓶中，振蕩培養至對數生長期； (3)將上述培養好的菌液按10-15%體積接種量轉入種子罐，繼續培養至對數生長期；種子罐所用的培養基配方為葡萄糖5g/L，NH4NO3 10g/L , K2HPO4 2 g/L, MgSO4·7Η20 0.5g/L, Na2HPO4 2 g/L，CaCO3 3g/L，NaCl I. 0 g/L，酵母膏 0.5 g/L, pH -J. 0-7. 2 ； (4)將達到對數生長期的種子液按10-15%的接種量接種入生產罐中培養；生產罐所用的培養基配方與種子罐ー樣； (5)在種子罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:0.8-1. 5，攪拌速度為150-220轉/分鐘，培養溫度為28-35°C，全程培養時間為48-72小吋，結束后菌體60億個/ml ； (6)發酵完成后將細菌培養液制成油包水劑型；油相制備取6份span-80和94份10號白油混勻高壓滅菌備用；水相制備向活化好的細菌發酵液中加入4%的滅菌吐溫80并充分溶解；乳化制劑先將油相傾入置立式膠體磨中，在低速攪拌下緩慢加入水相(油相和水相按I :3的比例充分混合)，然后高速攪拌3min-5min，快速乳化成油包水狀，用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成油包水液體劑型。
3.根據權利要求2所述的殺撲磷殘留高效降解菌劑的制備方法，其特征在于步驟(6)所述發酵液制成油包水產品吋，需加入一定比例的span80作為乳化劑，其HLB值為4. 3，能使互不相溶的油水兩相相互混溶，并形成均勻分散的油包水乳化體系；微生物菌劑施用到環境中以后容易受環境因素影響而喪失活性，這些因素中最重要的是營養元素和水分供給；將發酵液制成油包水后可使其中的營養物質懸浮穩定地包裹在降解菌周圍，通過緩釋提供營養底物保持菌種的活性，防止降解菌的沉淀，并且油相可以給降解菌提供適宜的濕潤環境，從而大大延長菌劑產品的保質期；使用時直接噴灑到果蔬表面，由于油包水的保水特性可以使營養物的緩慢釋放從而維持菌的活性，提高果蔬表面農殘的降解率，同時還可防止果蔬失水、褐變等現象的發生。
4.如權利要求I所述的沙雷氏菌株SPL-2在處理土壌及果蔬表面殺撲磷農藥殘留上的應用。
全文摘要
本發明提供了一株能降解殺撲磷農藥殘留的微生物新菌種——沙雷氏菌(Serratiasp.)SPL-2，Genbank登錄號為JN400353，以及利用該降解菌株研制的殺撲磷農藥殘留降解菌劑。本發明降解菌劑是利用微生物的技術降解化學農藥，屬于環境微生物修復技術領域，生產工藝為斜面種→搖瓶種子液→種子罐→發酵罐→產品，其制備工藝簡單、生產成本低廉易于大面積推廣應用，施用時直接噴灑非常方便，解決了農業生產中農藥噴灑該菌劑產品后可快速、高效地降解土壤及果蔬表面的殘留殺撲磷含量，從而殘留超標問題，可生產出無毒無公害的綠色農產品，有效提高農產品的品質和經濟價值。
文檔編號C12N1/20GK102676439SQ20121021104
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月26日 優先權日2012年6月26日
發明者徐恒, 李創, 楊曦 申請人:四川大學