專利名稱：釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌全細胞混懸液的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種具有抗腫瘤作用的藥物的制備方法，特別涉及釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌全細胞混懸液的制備方法。
背景技術：
近年來，我國每年新增腫瘤患者160萬-170萬人，總數在450萬人左右。其發病率和死亡率均呈現上升趨勢。國家衛生部發布的《2009年中國衛生統計提要》顯示，2008 年部分市縣前十位疾病死亡專率中，惡性腫瘤居于首位，已成為危害人類健康的頭號殺手。目前現有技術中已存在許多抗腫瘤化療藥物，而且有更多的化合物已被發現具有抗腫瘤作用。但是，大多數抗腫瘤藥物由于缺乏理想的選擇性，在抑制或殺傷腫瘤細胞的同時，對人體正常組織細胞也具有抑制或損傷作用，因而具有較多的副作用，如蒽環類抗癌抗生素阿霉素的心臟毒性、順鉬加環磷酰胺化療方案所致骨髓毒性的作用、順鉬治療卵巢癌或睪丸癌所誘導的神經毒性及其腎毒性等。除化療藥物外，腫瘤的放射療法及手術治療目前也很難達到理想的效果。因此，腫瘤治療新方法及新藥物的研發成為國內外醫藥領域的研發熱點。隨著細菌生物學和分子生物學的發展，人們認識到許多細菌(如幽門螺桿菌)可以引起腫瘤，同時，一些細菌及其產物也具有腫瘤抑制作用。早在200年前，人們就已經發現某些腫瘤患者在急性細菌感染后，腫瘤生長被抑制(韓景田，張國輝綜述，董小青審校.細菌及其產物對腫瘤的影響研究進展.武警醫學院學報.2009年2月，第18卷，第2 期，159-161頁)。二十世紀八十年代，皮膚病專家發現細菌感染引發的痤瘡患者患皮膚癌、 淋巴癌和白血病的幾率相對較低，并且這些細菌注入動物體內會導致腫瘤萎縮。對細菌的不同組分進行分離并進行實驗發現，細菌所含的脂多糖是其腫瘤抑制作用的活性組分。由于自然科學的發展、基礎理論研究與新技術的應用，腫瘤學研究有了長足的進步，細菌及其產物對腫瘤的治療作用成為該研究領域的熱門課題之一。在腫瘤細胞發生發展的過程中，由于基因突變等原因腫瘤細胞會表達一些新的抗原。這些新抗原作為“非己”物質，可以被機體的免疫系統識別和殺傷。然而腫瘤在人體免疫功能作用下仍能發展、轉移，表明腫瘤也有自己的保護機制。當機體發生腫瘤時，腫瘤細胞可以憑借多種方式逃避免疫系統的監控而分裂生長，即腫瘤的免疫逃逸(丁紅仙.腫瘤免疫逃逸機制的研究進展.海峽藥學.2008年，第20卷，第7期，12-14頁)。腫瘤細胞通過自分泌-旁分泌途徑能分泌免疫抑制性細胞因子，如轉化生長因子β (TGF-β)、白細胞介素-IO(IL-IO)、血管內皮生長因子(VEGF)和IL-4等，使腫瘤局部形成深度免疫抑制區， 不僅使身在其中的免疫細胞功能受到嚴重抑制，甚至功能正常、活化的免疫細胞，一旦進入此環境也將成為免疫功能抑制的“沉默”細胞，是腫瘤免疫逃逸的重要機制之一(Colombo MP, Piconese S. Regulatory—T—cell inhibition versus depletion :the right choice in cancer immunotherapy. Nat RevCancer. 2007 Nov ；7 (11) :880-7.)。 TGF-β 是介導月中瘤免疫逃逸最有效的免疫抑制分子，能廣泛抑制腫瘤患者的免疫系統，可以抑制T細胞增殖，抑制IL-I β、IL-2受體的表達，拮抗抑制Y干擾素、腫瘤壞死因子α (TNF-α )等的免疫效應。IL-10可阻抑抗原遞呈細胞(APC)在腫瘤組織的浸潤、分化、成熟及對抗原的趨化反應，誘導其表面⑶86、⑶40、⑶討分子、HLA-I及HLA-II類分子低表達或不表達，直接或通過功能缺陷型APC使細胞毒T淋巴細胞(CTL)處于免疫無能狀態。VEGF可影響樹突狀細胞的分化與成熟，阻礙其抗原遞呈功能，進一步影響CTL的擴增、活化及瘤細胞對CTL殺傷的敏感性，還可通過上調B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-幻的表達，抑制瘤細胞凋亡， 在一定程度上限制了機體的有效抗腫瘤免疫。經研究，已經發現多種細菌及其產物具有誘導機體抗腫瘤免疫，抑制腫瘤生長的藥理活性，比如李斯特菌是一種廣泛存在于自然界的革蘭陽性菌，可感APC，激發強烈的細胞免疫，CD4和CD8+T細胞介導的細胞免疫是其特。即使高度減毒的李斯特菌在免疫治療中仍具有的抗月中瘤效能(Paterson Y, Maciag PC. Listeria-based vaccines for cancer treatment. Curr OpinMol Ther. 2005 Oct ；7 (5) :454-60)。卡介苗(BCG)作為免疫佐劑在防治膀胱腫瘤方面也取得了良好效果，BCG灌注被認為是膀胱腫瘤最有效的輔助治療手段之一。BCG刺激宿主免疫系統產生抗癌免疫效應與其多種活性組分有關，如核酸、胞壁中的脂質、及脂多糖均能刺激機休免疫系統產生抗癌免疫反應。應用乳酸桿菌LC9018治療C3H/He系小鼠膀胱癌的實驗發現，癌組織可檢測到抗腫瘤細胞因子(TNF-α、IL-12)mRNA局部明顯的高表達。已知綠膿桿菌的(LPQ能顯著延長急性髓性血病患者的緩解期和生存；葡萄球菌腸毒素A對腫瘤細胞具有殺傷作用。金黃色葡萄球菌菌株ATCC25923的DNA也具有抗腫瘤效應(歷風元，蔣智敏，周文清，朱漣敏.金黃色葡萄球菌DNA抗腫瘤免疫的實驗研究.江西醫學院學報.2008年，第48卷，第6期，28-32頁)中國專利95193357. 4 (專利權人斯坦福魯克有限公司；申請日1995. 03. 29，公開號1150388，
公開日1997. 05.21)公開了一種牦牛分支桿菌菌株(NTCT11659菌株)，具有抗腫瘤作用。中國專利02111996. 1 (專利權人靳海；申請日2002. 06. 05，公開號1465353，
公開日2004. 01. 07)公開了一種粘質沙雷氏菌S311菌株(菌種編號=CGMCC NO. 0744)，具有抗腫瘤作用，并已獲得中國生物制品一類新藥證書。美國專利US3477914(專利權人日本中外制藥株式會社即CHUGAI PHARMACEUTICAL COLTD ；
公開日1969年11月11日)公開了一種用青霉素處理的釀膿鏈球菌Su菌株，具有抗腫瘤作用。目前上市的0K432、沙培林、力爾凡等鏈球菌制劑既是青霉素處理的釀膿鏈球菌Su菌株。該專利實施例1給出的數據顯示青霉素濃度為5. 4X IO4單位/ml時，與艾氏腹水瘤細胞混合培養，接種于小鼠50天內，小鼠存活率為100%，且均未發現腫瘤。但青霉素的加入限制了該藥在青霉素過敏患者中的應用，且所提供的實驗結果與國內文獻(吳戰宇，邱芳萍，盧日峰.改良培養基制備A群鏈球菌制劑及其抗腫瘤活性研究.中國藥業.2007年，第16卷第6期，第5-6頁)及臨床使用效果差異較大。國內文獻報道其中劑量給藥后艾氏腹水瘤及肝癌腹水瘤小鼠的生命延長率最高，為63. 38% ；最常生存天數不超過30天。美國專利US3627644(
公開日1971年12月14日)公開了一種釀膿鏈球菌菌株(ATCC21060)具有抗腫瘤作用。美國專利US434卯41 (專利權人日本中外制藥株式會社；
公開日1982年09月14 日)公開了一種釀膿鏈球菌菌株(ATCC21597)具有抗腫瘤作用。美國專利US4678773(專利權人日本中外制藥株式會社；
公開日1987年07月07 日)公開了一種釀膿鏈球菌菌株(ATCC21059)具有抗腫瘤作用。美國專利US61141 (
公開日2001年04月10日)公開了一種鏈球菌菌株 (DSM8747)的脂磷壁酸LTA-T，具有抗腫瘤作用。中國目前上市的藥品中，已出現釀膿鏈球菌自釀膿鏈球菌中提取的以~ -甘露聚糖肽為主的多種成分制成的抗腫瘤制劑，對惡性胸腔積液療效顯著，瘤內及全身用藥對實體瘤有一定療效，也可用與腫瘤放射治療及化療聯合，作為惡性腫瘤的輔助治療。細菌細胞用于制備抗腫瘤藥物的研究非常廣泛，但是由于細菌本身的致病性，一般需要滅活，減小毒性后才能使用。但是毒性的減小往往伴隨著抗腫瘤效果的降低，因此， 如何控制毒性與療效的平衡至為重要。在已公開的抗腫瘤細菌制劑(細胞組分除外)中大多僅處于實驗階段，由于療效不穩定，差異較大，未能進入臨床應用。以細菌組分如~ -甘露聚糖肽、脂磷壁酸、DNA等制成的抗腫瘤藥物有確切療效質量易于控制，但由于細菌抗腫瘤機制尚不完全清楚，因此單種或多種細菌組分混合物(細菌DNA、細菌代謝產物等)治療腫瘤的療效并不優于紫杉醇等現有抗腫瘤藥物。現有研究資料及技術文獻顯示多種釀膿鏈球菌菌株的全細胞制劑具有抗腫瘤的藥理活性，關于粘質沙雷氏菌其他菌株的全細胞制劑未見抗腫瘤活性報道。

發明內容
針對上述現有技術，本發明提供了一種治療腫瘤的復合細菌全細胞混懸液及其制備方法。本發明是通過以下技術方案實現的一種釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌全細胞混懸液的制備方法，步驟如下釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌分別培養，得全細胞培養液，然后將兩種細菌按照細菌個數比例為1 1 或2 1的比例混合，熱滅活后用含苯酚或間苯二酚l_3g/l的苯酚生理鹽水稀釋，即配制成全細胞混懸液。所述釀膿鏈球菌和粘質沙雷氏菌的培養條件為用每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g、新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g、氯化鈉5. 0g、pH值為7. 2-7. 4的液體培養基在振蕩頻率為 50rpm、振幅為19mm條件下培養22 M小時；或在每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g、新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g、氯化鈉5. 0g、pH值為7. 2-7. 4的固體培養基上培養22 24小時； 釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌培養溫度分別為37°C和25°C。所述釀膿鏈球菌和粘質沙雷氏菌主種子批菌種啟開后傳代次數均不超3代，工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數均不超過3代。所述熱滅活條件為68°C下熱滅活90分鐘；或75°C下熱滅活60分鐘。所述釀膿鏈球菌的菌株為ATCC19615、ATCC21059、ATCC21597、ATCC21060、 ATCC21068, ATCC700924, ATCC12351 或 CMMCC32210 株中的任一種。所述粘質沙雷氏菌的菌株為ATCC43820、ATTCC43821、ATCC14041、ATCC27117、ATCC13880、ATCC8195 或 ATCC8100 株中的任一種。上述制備方法制備得到的釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌全細胞混懸液，混懸液中， 釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細菌總數為每毫升10萬 300萬個，優選每毫升10萬 30萬個。上述制備方法制備得到的釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌全細胞混懸液可以用于治療腫瘤，其給藥途徑為瘤內注射、腔內注射或肌肉注射。需要注意的是，在本發明的復合細菌混懸液中釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌比例不變的情況下，本技術領域所屬技術人員也可制成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌的細菌總數高于每毫升10萬 300萬個的復合細菌混懸液，但給患者使用時的最終濃度應為釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌的細菌總數為10萬 300萬個。本發明的發明人通過大量菌株篩選、組方篩選、工藝研究及臨床前藥效學實驗， 發現革蘭氏陰性粘質沙雷氏菌的菌株為ATCC43820、ATTCC43821、ATCC14041、ATCC27117、 ATCC13880、ATCC8195、ATCC8100株雖無顯著的抗腫瘤作用，但對革蘭氏陽性釀膿鏈球菌 ATCC19615、ATCC21059、ATCC 21597、ATCC21060、ATCC21068、ATCC700924、ATCC12351、 CMMCC32210菌株的抗腫瘤效果有顯著的增效作用。未經青霉素處理的釀膿鏈球菌和粘質沙雷氏菌，主種子批菌種啟開后傳代次數1-3代；工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數1-3代。熱滅活并后按照1 1或2 1混合，混懸液中釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌的總濃度為每毫升10萬-300個時具有顯著的抗腫瘤效果且毒性較小。完全出乎意料的是，本發明的發明人在藥效學研究中驚奇的發現，本發明的復合細菌全細胞混懸液在體內外試驗中療效顯著優于釀膿鏈球菌、0K432和紫杉醇，且瘤內注射后對實體瘤具有促使腫瘤瘤塊脫落的效果。另外，本發明的復合細菌全細胞混懸液未使用青霉素處理，避免了對青霉素過敏患者的使用限制。由上可見，本發明的將具有抗腫瘤活性的釀膿鏈球菌菌株與其他無顯著抗腫瘤作用的粘質沙雷氏菌全細胞組合的技術方案，取得了意想不到的效果， 其抗腫瘤作用及效果等是所屬技術領域技術人員所無法預見或推測的，具備突出的實質性特點和顯著的進步。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明實施例1ATCC43820與ATCC21059復合細菌全細胞混懸液的制備菌株釀膿鏈球菌ATCC21059菌株，粘質沙雷氏菌ATCC43820菌株釀膿鏈球菌ATCC21059菌株與粘質沙雷氏菌ATCC43820菌株分別培養，按比例混
口 O1.菌株傳代培養基組成每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化鈉 5. Og0培養條件pH為7. 5 ；50rpm振蕩培養，振幅19mm，粘質沙雷氏菌菌株在25°C下培養；菌株釀膿鏈球菌菌株在37 °C下培養。傳代次數主種子批菌種啟開后傳代次數為1代；工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數1代。
2.復合細菌全細胞混懸液的制備培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化鈉 5. Og0培養條件pH為7. 2 ；50rpm振蕩培養，振幅19mm，粘質沙雷氏菌菌株在25°C下培養M小時；菌株釀膿鏈球菌菌株在37°C下培養M小時。上述細菌采用直接計數法計數后，按照釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細胞比例為
1 1的比例混合，于68°C下熱滅活90分鐘，用含苯酚2.0g/L的苯酚生理鹽水稀釋，配制成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細菌總濃度為每毫升20萬個的混合液。所得混合液為淡紅色懸液，無搖不散的菌塊或異物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至溫度降到10°C，然后 2-6C下凍存。實施例2ATTCC43821與ATCC21060復合細菌全細胞混懸液的制備菌株釀膿鏈球菌ATCC21060菌株，粘質沙雷氏菌ATTCC43821菌株1.菌株傳代培養基組成每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化鈉 5. Og0培養條件pH為7. 0 ；50rpm振蕩培養，振幅19mm，粘質沙雷氏菌在27°C下培養；菌株釀膿鏈球菌菌株在37 °C下培養。傳代次數主種子批菌種啟開后傳代次數為2代；工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數1代。2.復合細菌全細胞混懸液的制備培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化鈉 5. Og0培養條件pH為7. 4 ；50rpm振蕩培養，振幅19mm，粘質沙雷氏菌菌株在30°C下培養22小時；菌株釀膿鏈球菌菌株在37°C下培養22小時。上述細菌采用直接計數法計數后，按照釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細胞比例為
2 1的比例混合，于68°C下熱滅活90分鐘，用含苯酚3. 0g/L的苯酚生理鹽水稀釋，配制成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌總濃度為每毫升200萬個的混合液。所得混合液為淡紅色懸液，無搖不散的菌塊或異物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至溫度降到10°C，然后2-6°C 下凍存。實施例3ATCC13880與ATCC7009M復合細菌全細胞混懸液的制備菌株釀膿鏈球菌ATCC7009M菌株，粘質沙雷氏菌ATCC13880菌株1.菌株傳代培養基組成每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化鈉 5. Og0培養條件pH為7. 3 ；50rpm振蕩培養，振幅19mm，粘質沙雷氏菌在25°C下培養；菌株釀膿鏈球菌菌株在37 °C下培養。傳代次數主種子批菌種啟開后傳代次數為2代；工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數2代。2.復合細菌全細胞混懸液的制備
培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化鈉 5. Og0培養條件pH為7.4;50rpm振蕩(振幅19mm)培養，粘質沙雷氏菌菌株在25°C下培養23小時；菌株釀膿鏈球菌菌株在37°C下培養23小時。上述細菌采用直接計數法計數后，按照釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細胞比例為 2 1的比例混合，于68°C下熱滅活90分鐘，用含苯酚3. Og/L的苯酚生理鹽水稀釋，配制成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌總濃度為每毫升30萬個的混合液。所得混合液為淡紅色懸液，無搖不散的菌塊或異物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至溫度降到10°C，然后2-6°C 下凍存。實施例4ATCC27117與ATCC21068復合細菌全細胞混懸液的制備菌株釀膿鏈球菌ATCC21068菌株，粘質沙雷氏菌ATCC27117菌株1.菌株傳代培養基組成每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化鈉 5. Og0培養條件pH為7. 2 ；50rpm振蕩(振幅19mm)培養，粘質沙雷氏菌在25°C下培養； 菌株釀膿鏈球菌菌株在37 °C下培養。傳代次數主種子批菌種啟開后傳代次數為2代；工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數2代。2.復合細菌全細胞混懸液的制備 培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化鈉 5. Og0培養條件pH為7.4;50rpm振蕩(振幅19mm)培養，粘質沙雷氏菌菌株在25°C下培養22小時；菌株釀膿鏈球菌菌株在37°C下培養M小時。上述細菌采用直接計數法計數后，按照釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細胞比例為 1 1的比例混合，68°C下熱滅活90分鐘，用含苯酚2. 0g/L的苯酚生理鹽水稀釋，配制成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌總濃度為每毫升180萬個的混合液。所得混合液為淡紅色懸液， 無搖不散的菌塊或異物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至溫度降到10°C，然后2-6°C下凍存。實施例5ATCC14041與ATCC19615復合細菌全細胞混懸液的制備菌株釀膿鏈球菌ATCC19615菌株，粘質沙雷氏菌ATCC14041菌株1.菌株傳代培養基組成每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化鈉 5. Og0培養條件pH為7.4;50rpm振蕩(振幅19mm)培養，粘質沙雷氏菌在25°C下培養； 菌株釀膿鏈球菌菌株在37 °C下培養。傳代次數主種子批菌種啟開后傳代次數為3代；工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數2代。2.復合細菌全細胞混懸液的制備培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化鈉5. Og0培養條件pH為7.3;50rpm振蕩(振幅19mm)培養，粘質沙雷氏菌菌株在25°C下培養M小時；菌株釀膿鏈球菌菌株在37°C下培養23小時。上述細菌采用直接計數法計數后，按照釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細胞比例為 1 1的比例混合，68°C下熱滅活90分鐘，用含苯酚2. Og/L的苯酚生理鹽水稀釋，配制成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌總濃度為每毫升20萬個的混合液。所得混合液為淡紅色懸液，無搖不散的菌塊或異物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至溫度降到10°C，然后2-6°C下凍存。實施例6ATCC43820與ATCC21060復合細菌全細胞混懸液的制備菌株釀膿鏈球菌ATCC21060菌株，粘質沙雷氏菌ATCC43820菌株1.菌株傳代培養基組成每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化鈉 5. Og0培養條件pH為7. 3 ；50rpm振蕩(振幅19mm)培養，粘質沙雷氏菌在25°C下培養； 菌株釀膿鏈球菌菌株在37 °C下培養。傳代次數主種子批菌種啟開后傳代次數為3代；工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數2代。2.復合細菌全細胞混懸液的制備 培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化鈉 5. Og0培養條件pH為7.2;50rpm振蕩(振幅19mm)培養，粘質沙雷氏菌菌株在25°C下培養M小時；菌株釀膿鏈球菌菌株在37°C下培養22小時。上述細菌采用直接計數法計數后，按照釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細胞比例為 1 1的比例混合，75°C下熱滅活60分鐘，用含苯酚2. 0g/L的苯酚生理鹽水稀釋，配制成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌總濃度為每毫升10萬個的混合液。所得混合液為淡紅色懸液，無搖不散的菌塊或異物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至溫度降到10°c，然后2-6°C下凍存。實施例7ATTCC43821與ATCC21059復合細菌全細胞混懸液的制備菌株釀膿鏈球菌ATCC21059菌株，粘質沙雷氏菌ATTCC43821菌株1.菌株傳代培養基組成每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化鈉 5. Og0培養條件pH為7. 2 ；50rpm振蕩(振幅19mm)培養，粘質沙雷氏菌在25°C下培養； 菌株釀膿鏈球菌菌株在37 °C下培養。傳代次數主種子批菌種啟開后傳代次數為2代；工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數1代。2.復合細菌全細胞混懸液的制備培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化鈉 5. Og0
培養條件pH為7.3;50rpm振蕩(振幅19mm)培養，粘質沙雷氏菌菌株在25°C下培養M小時；菌株釀膿鏈球菌菌株在37°C下培養23小時。上述細菌采用直接計數法計數后，按照釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細胞比例為 1 1的比例混合，75°C下熱滅活60分鐘，用含苯酚2. Og/L的苯酚生理鹽水稀釋，配制成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌總濃度為每毫升20萬個的混合液。所得混合液為淡紅色懸液，無搖不散的菌塊或異物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至溫度降到10°C，然后2-6°C下凍存。實施例8ATCC13880與ATCC21060復合細菌全細胞混懸液的制備菌株釀膿鏈球菌ATCC21060菌株，粘質沙雷氏菌ATCC13880菌株1.菌株傳代培養基組成每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化鈉 5. Og0培養條件pH為7.4;50rpm振蕩(振幅19mm)培養，粘質沙雷氏菌在25°C下培養； 菌株釀膿鏈球菌菌株在37 °C下培養。傳代次數主種子批菌種啟開后傳代次數為2代；工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數1代2.復合細菌全細胞混懸液的制備培養基釀膿鏈球菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og,新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. 0g，氯化鈉5. 0g。粘質沙雷氏菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og, 新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化鈉5. Og，瓊脂20g。培養條件釀膿鏈球菌菌株培養條件pH為7. 2 ；50rpm振蕩(振幅19mm)培養，在 37°C下培養22小時。粘質沙雷氏菌菌株培養條件pH為7. 4 ；25°C下培養M小時。上述細菌采用直接計數法計數后，用含苯酚2. 0g/L的苯酚生理鹽水適當稀釋，按照釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細胞比例為1 1的比例混合，75°c下熱滅活60分鐘后，用含間苯二酚2. 0g/L的苯酚生理鹽水稀釋配制成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌總濃度為每毫升280萬個的混合液。所得混合液為淡紅色懸液，無搖不散的菌塊或異物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至溫度降到10°C，然后4°C下凍存。實施例9ATCC27117與ATCC21059復合細菌全細胞混懸液的制備菌株釀膿鏈球菌ATCC21059菌株，粘質沙雷氏菌ATCC27117菌株1.菌株傳代培養基釀膿鏈球菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og,新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化鈉5. Og。粘質沙雷氏菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og, 新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化鈉5. Og，瓊脂20g。培養條件釀膿鏈球菌菌株培養條件pH為7. 2 ；50rpm振蕩(振幅19mm)培養，在 37 °C下培養。粘質沙雷氏菌菌株培養條件pH為7. 4 ； 25 °C下培養。傳代次數主種子批菌種啟開后傳代次數為1代；工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數1代。2.復合細菌全細胞混懸液的制備培養基釀膿鏈球菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og,新胨蛋白胨(Neopeptone) 10. Og，氯化鈉5. Og。粘質沙雷氏菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og, 新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化鈉5. Og，瓊脂20g。培養條件釀膿鏈球菌菌株培養條件pH為7. 3 ；50rpm振蕩(振幅19mm)培養，在 37°C下培養M小時。粘質沙雷氏菌菌株培養條件pH為7. 2 ；25°C下培養23小時。上述細菌采用直接計數法計數后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理鹽水適當稀釋，按照釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細胞比例為1 1的比例混合，75°c下熱滅活60分鐘后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理鹽水稀釋配制成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌總濃度為每毫升80 萬個的混合液。所得混合液為淡紅色懸液，無搖不散的菌塊或異物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至溫度降到10°C，然后4°C下凍存。實施例10ATTCC43821與ATCC21597復合細菌全細胞混懸液的制備菌株釀膿鏈球菌ATCC21597菌株，粘質沙雷氏菌ATTCC43821菌株1.菌株傳代培養基釀膿鏈球菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og,新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化鈉5. Og。粘質沙雷氏菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og, 新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化鈉5. Og，瓊脂20g。培養條件釀膿鏈球菌菌株培養條件pH為7. 4 ；50rpm振蕩(振幅19mm)培養，在 37 °C下培養。粘質沙雷氏菌菌株培養條件pH為7. 3 ； 25 °C下培養。傳代次數主種子批菌種啟開后傳代次數為1代；工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數1代。2.復合細菌全細胞混懸液的制備培養基釀膿鏈球菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化鈉5. Og。粘質沙雷氏菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og, 新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化鈉5. Og，瓊脂20g。培養條件釀膿鏈球菌菌株培養條件pH為7. 2 ；50rpm振蕩(振幅19mm)培養，在 37°C下培養23小時。粘質沙雷氏菌菌株培養條件pH為7. 4 ；25°C下培養22小時。上述細菌采用直接計數法計數后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理鹽水適當稀釋，按照釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細胞比例為1 1的比例混合，75°c下熱滅活60分鐘后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理鹽水稀釋配制成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌總濃度為每毫升 160萬個的混合液。所得混合液為淡紅色懸液，無搖不散的菌塊或異物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至溫度降到10°C，然后4°C下凍存。實施例11ATCC27117與ATCC21060復合細菌全細胞混懸液的制備菌株釀膿鏈球菌ATCC21060菌株，粘質沙雷氏菌ATCC27117菌株1.菌株傳代培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化鈉 5. Og,瓊脂 20g.培養條件pH為7. 3 ；釀膿鏈球菌在37°C下培養；粘質沙雷氏菌菌株在25°C下培養。傳代次數主種子批菌種啟開后傳代次數為1代；工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數1代。
2.復合細菌全細胞混懸液的制備培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化鈉 5. Og，瓊脂 20g。培養條件pH為7. 2 ；釀膿鏈球菌在37°C下培養M小時；粘質沙雷氏菌菌株在 25°C下培養22小時。上述細菌采用直接計數法計數后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理鹽水適當稀釋，按照釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細胞比例為1 1的比例混合，75°c下熱滅活60分鐘后，用含苯酚1. 0g/L的苯酚生理鹽水稀釋配制成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌總濃度為每毫升 160萬個的混合液。所得混合液為淡紅色懸液，無搖不散的菌塊或異物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至溫度降到10°C，然后4°C下凍存。實施例12ATCC43820與ATCC21597復合細菌全細胞混懸液的制備菌株釀膿鏈球菌ATCC21597菌株，粘質沙雷氏菌ATCC43820菌株1.菌株傳代培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化鈉 5. 0g，瓊脂 20g。培養條件pH為7. 3 ；釀膿鏈球菌在37°C下培養；粘質沙雷氏菌菌株在25°C下培養。傳代次數主種子批菌種啟開后傳代次數為1代；工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數3代。2.復合細菌全細胞混懸液的制備培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化鈉 5. Og，瓊脂 20g。培養條件pH為7. 2 ；釀膿鏈球菌在37°C下培養1周；粘質沙雷氏菌菌株在25°C 下培養5天。上述細菌采用直接計數法計數后，用含苯酚2. 0g/L的苯酚生理鹽水適當稀釋，按照釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細胞比例為1 1的比例混合，68°c下熱滅活90分鐘后，用含苯酚2. 0g/L的苯酚生理鹽水稀釋配制成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌總濃度為每毫升 200萬個的混合液。所得混合液為淡紅色懸液，無搖不散的菌塊或異物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至溫度降到10°C，然后4°C下凍存。實施例13ATCC14041與ATCC7009M復合細菌全細胞混懸液的制備菌株釀膿鏈球菌ATCC7009M菌株，粘質沙雷氏菌ATCC14041菌株1.菌株傳代培養基粘質沙雷氏菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化鈉5. Og。釀膿鏈球菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化鈉5. Og，瓊脂20g。培養條件釀膿鏈球菌菌株培養條件pH為7. 3 ；在37°C下培養。粘質沙雷氏菌菌株培養條件PH為7. 4 ；25°C下50rpm振蕩(振幅19mm)培養。傳代次數主種子批菌種啟開后傳代次數為2代；工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數2代。
2.復合細菌全細胞混懸液的制備培養基粘質沙雷氏菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化鈉5. Og。釀膿鏈球菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化鈉5. Og，瓊脂20g。培養條件釀膿鏈球菌菌株培養條件pH為7. 4 ；在37°C下培養M小時。粘質沙雷氏菌菌株培養條件pH為7. 4 ；25°C下50rpm振蕩(振幅19mm)培養M小時。上述細菌采用直接計數法計數后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理鹽水適當稀釋，按照釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細胞比例為1 1的比例混合，68°c下熱滅活90分鐘后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理鹽水稀釋配制成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌總濃度為每毫升10 萬個的混合液。所得混合液為淡紅色懸液，無搖不散的菌塊或異物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至溫度降到10°C，然后4°C下凍存。實施例14ATTCC43821與ATCC19615復合細菌全細胞混懸液的制備菌株釀膿鏈球菌ATCC19615菌株，粘質沙雷氏菌ATTCC43821菌株1.菌株傳代培養基粘質沙雷氏菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化鈉5. Og。釀膿鏈球菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化鈉5. Og，瓊脂20g。培養條件釀膿鏈球菌菌株培養條件pH為7. 3 ；在37°C下培養。粘質沙雷氏菌菌株培養條件pH為7. 4 ;25°C下50rpm振蕩(振幅19mm)培養。傳代次數主種子批菌種啟開后傳代次數為2代；工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數2代。2.復合細菌全細胞混懸液的制備培養基粘質沙雷氏菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化鈉5. Og。釀膿鏈球菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化鈉5. Og，瓊脂20g。培養條件釀膿鏈球菌菌株培養條件pH為7. 4 ；在37°C下培養23小時。粘質沙雷氏菌菌株培養條件pH為7. 2 ；25°C下50rpm振蕩(振幅19mm)培養M小時。上述細菌采用直接計數法計數后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理鹽水適當稀釋，按照釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細胞比例為1 1的比例混合，68°c下熱滅活90分鐘后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理鹽水稀釋配制成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌總濃度為每毫升10 萬個的混合液。所得混合液為淡紅色懸液，無搖不散的菌塊或異物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至溫度降到10°C，然后4°C下凍存。實施例15ATTCC8195與ATCC12351復合細菌全細胞混懸液的制備菌株釀膿鏈球菌ATCC12351菌株，粘質沙雷氏菌ATTCC8195菌株1.菌株傳代培養基粘質沙雷氏菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化鈉5. Og。釀膿鏈球菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化鈉5. Og，瓊脂20g。培養條件釀膿鏈球菌菌株培養條件pH為7. 2 ；在37°C下培養。粘質沙雷氏菌菌株培養條件pH為7. 4 ;25°C下50rpm振蕩(振幅19mm)培養。傳代次數主種子批菌種啟開后傳代次數為2代；工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數2代。2.復合細菌全細胞混懸液的制備培養基粘質沙雷氏菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化鈉5. Og。釀膿鏈球菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化鈉5. Og，瓊脂20g。培養條件釀膿鏈球菌菌株培養條件pH為7. 4 ；在37°C下培養23小時。粘質沙雷氏菌菌株培養條件pH為7. 2 ;25°C下50rpm振蕩(振幅19mm)培養22小時。上述細菌采用直接計數法計數后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理鹽水適當稀釋，按照釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細胞比例為2 1的比例混合，68°C下熱滅活90分鐘后，用含間苯二酚1. Og/L的苯酚生理鹽水稀釋配制成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌總濃度為每毫升20萬個的混合液。所得混合液為淡紅色懸液，無搖不散的菌塊或異物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至溫度降到10°C，然后4°C下凍存。實施例16ATTCC8100與CMCC32210復合細菌全細胞混懸液的制備菌株釀膿鏈球菌CMCC32210菌株，粘質沙雷氏菌ATTCC8100菌株1.菌株傳代培養基粘質沙雷氏菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化鈉5. Og。釀膿鏈球菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化鈉5. Og，瓊脂20g。培養條件釀膿鏈球菌菌株培養條件pH為7. 2 ；在37°C下培養。粘質沙雷氏菌菌株培養條件pH為7. 4 ;25°C下50rpm振蕩(振幅19mm)培養。傳代次數主種子批菌種啟開后傳代次數為2代；工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數2代。2.復合細菌全細胞混懸液的制備培養基粘質沙雷氏菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化鈉5. Og。釀膿鏈球菌菌株培養基每升雙蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化鈉5. Og，瓊脂20g。培養條件釀膿鏈球菌菌株培養條件pH為7. 4 ；在37°C下培養23小時。粘質沙雷氏菌菌株培養條件pH為7. 2 ;25°C下50rpm振蕩(振幅19mm)培養22小時。上述細菌采用直接計數法計數后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理鹽水適當稀釋，按照釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細胞比例為2 1的比例混合，68°C下熱滅活90分鐘后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理鹽水稀釋配制成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌總濃度為每毫升20 萬個的混合液。所得混合液為淡紅色懸液，無搖不散的菌塊或異物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至溫度降到10°C，然后4°C下凍存。實施例17復合細菌全細胞混懸液的毒性實驗將釀膿鏈球菌菌株與粘質沙雷氏菌菌株按照實施例1-16所述的組合及制備方案制備培養后，按照細菌總濃度配制成6 X 109/ml、3 X 109/ml、1. 5 X 109/ml、7. 5 X 108/ml、 6. OXlOVmlU. OXlOVml六個濃度，每個濃度的懸液以0. 5ml腹腔注射體重20 25g小鼠5只，觀察3天，注射含菌7. 5 XlOVml的小鼠全部生存，注射含菌1. 5X 109/ml的小鼠死亡率為40%-60%，注射含菌3X109/ml-6X107ml的小鼠死亡率為60%-100%。由此可見，實施例1-15所述混懸液的濃度均在安全劑量范圍內。實施例18釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌的配比對抗腫瘤作用的影響釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌按照實施例4、5、8所述組合及配制方法方法制備成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌比例為1 0(不含粘質沙雷氏菌)、1 1、2 1、3 1、5 1、 1 3、1 6的混懸液，細菌總濃度為1.0X107ml。荷腹水瘤KM小鼠傳至第二代，抽取瘤細胞，肉瘤S180腹水瘤稀釋為IX IO7個/ml。每只小鼠消毒右前肢腋下皮膚，接種0. 2ml 瘤細胞，建立皮下實體瘤模型。腫瘤生長至^Omm3左右時腹腔注射給藥每天給藥1次，每次給藥0. Iml (陰性對照組給予生理鹽水)，共給藥5次。至生理鹽水組全部死亡，計算腫瘤生長抑制率及死亡率，腫瘤生長抑制率(％)=(生理鹽組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/ (生理鹽組平均瘤重)X 100 %，如表1所示。表1復合細菌全細胞混懸液中釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌的配比對抗腫瘤作用的影響
菌株組合菌株配比死亡率腫瘤生長抑制率ATCC21068ATCC271171017%65%ATCC21068ATCC27117110%92%*ATCC21068ATCC27117210%94%*ATCC21068ATCC271173133%68%ATCC21068ATCC271175133%62%ATCC21068ATCC271171317%54%ATCC21068ATCC271171617%44%ATCC19615ATCC140411:00%56%ATCC19615ATCC14041110%98%*ATCC19615ATCC14041210%95%*ATCC19615ATCC140413117%64%ATCC19615ATCC140415133%51%ATCC19615ATCC140411333%55%ATCC19615ATCC140411633%40%ATCC21060ATCCl33801033%71%ATCC21060ATCC13380110%93%*ATCC21060ATCCl3380210%86%*ATCC21060ATCC133803117%61%ATCC21060ATCC133805117%64%ATCC21060ATCCl3380130%56%ATCC21060ATCC13380160%49%*與相同菌株1 0(不含粘質沙雷氏菌)相比ρ <0.01。上述每組動物均為6只，數據表明釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌配比為1 1和 1 2時的抗腫瘤效果均優于釀膿鏈球菌單獨使用的效果，以3 1、5 1、1 3、1 6等
15比例混合，雖然死亡率有所降低，但腫瘤生長抑制率較低未見顯著升高。實施例19釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌的配比對抗腫瘤作用的影響釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌按照實施例7、12、15所述組合(比例可變)及配制方法方法制備成釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌比例為1 0(不含粘質沙雷氏菌)、1 1、2 1、 3 1、6 1、1 2、1 4的混懸液，細菌總濃度為1.0X106/ml。荷腹水瘤KM小鼠傳至第二代，抽取瘤細胞，肝癌H22腹水瘤稀釋為2. 5X IO7個/ml。每只小鼠消毒右前肢腋下皮膚，接種0. 2ml瘤細胞，建立皮下實體瘤模型。腫瘤生長至^Omm3左右時腹腔注射給藥每天給藥1次，每次給藥0. Iml (陰性對照組給予生理鹽水)，共給藥5次。至生理鹽水組全部死亡，計算腫瘤生長抑制率及死亡率，腫瘤生長抑制率(％)=(生理鹽組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/(生理鹽組平均瘤重)X 100%。同時以0K-432(日本中外制藥公司，小鼠靜脈注射劑0. 2mg/kg,隔天給藥1次，共給藥5次)及紫杉醇(15. Omg/kg,每天給藥1次，共給藥5次)為對照，比較組合菌株抗腫瘤作用，結果如表2所示。表2復合細菌全細胞混懸液中釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌的配比對抗腫瘤作用的影響
權利要求
1.一種釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌全細胞混懸液的制備方法，其特征在于，步驟如下 釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌分別培養，得全細胞培養液，然后將兩種細菌按照細菌個數比例為1 1或2 1的比例混合，熱滅活后用含苯酚或間苯二酚l_3g/l的苯酚生理鹽水稀釋，即配制成全細胞混懸液。
2.根據權利要求1所述的釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌全細胞混懸液的制備方法，其特征在于所述釀膿鏈球菌和粘質沙雷氏菌的培養條件為用每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g、新胨蛋白胨10. 0g、氯化鈉5. 0g、pH值為7. 2-7. 4的液體培養基在振蕩頻率為50rpm、振幅為 19mm條件下培養22 M小時；或在每升雙蒸水含牛肉膏3. 0g、新胨蛋白胨10. 0g、氯化鈉5. 0g、pH值為7. 2-7. 4的固體培養基上培養22 M小時；釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌培養溫度分別為37 °C和25 °C。
3.根據權利要求1所述的釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌全細胞混懸液的制備方法，其特征在于所述釀膿鏈球菌和粘質沙雷氏菌主種子批菌種啟開后傳代次數均不超3代，工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數均不超過3代。
4.根據權利要求1所述的釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌全細胞混懸液的制備方法，其特征在于所述熱滅活條件為68°C下熱滅活90分鐘；或75°C下熱滅活60分鐘。
5.權利要求1 4所述的制備方法制備得到的釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌全細胞混懸液。
全文摘要
本發明公開了一種釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌全細胞混懸液的制備方法，步驟如下釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌分別培養，得全細胞培養液，然后將兩種細菌按照細菌個數比例為1∶1或2∶1的比例混合，熱滅活后用含苯酚或間苯二酚1-3g/l的苯酚生理鹽水稀釋，即配制成全細胞混懸液。本發明制備得到的釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌全細胞混懸液，混懸液中，釀膿鏈球菌與粘質沙雷氏菌細菌總數為每毫升10萬～300萬個，可以用于治療腫瘤，其給藥途徑為瘤內注射、腔內注射或肌肉注射。
文檔編號A61K35/74GK102232972SQ201010164039
公開日2011年11月9日 申請日期2010年5月6日 優先權日2010年5月6日
發明者厲保秋 申請人:山東大學