專利名稱：一種大目、長鰭、藍鰭金槍魚生魚片的鑒定方法
技術領域：
本發明屬于食品檢測技術領域，具體地涉及一種大目、長鰭、藍鰭金槍魚生魚片的鑒定方法。
背景技術：
從生物學分類上講，金槍魚指S盧形目(Perciformes)鯖科(Scombridae)金槍魚屬(Thunnus)的共計8種魚類。經濟價值較大的種類包括藍鰭金槍魚(Thunnus maccoyii)、 大目金槍魚(Thunnus obesus)、黃鰭金槍魚(Thunnus albacares)、長鰭金槍魚(Thunnusalalunga)等，其中大目金槍魚、長鰭金槍魚、藍鰭金槍魚是國內生魚片主要的原料魚。金槍魚是國際營養學會推薦的三大營養魚之一，具有肉質柔嫩，高蛋白低脂肪，富含多種維生素和微量元素，尤其是DHA和EPA等不飽和脂肪酸含量非常豐富，DHA被人們稱為“腦黃金”，是人類大腦和中樞神經系統發育必需的營養物質，經常食用金槍魚，有利于腦細胞的再生、促進大腦發育、改善記憶力、提高學習能力、預防老年癡呆癥。EPA又稱0MEGA-3，是金槍魚所特有的營養物質，可抑制膽固醇增加和防止動脈硬化，對預防和治療心腦血管疾病有著特殊的作用。金槍魚肉中蛋白質含量高，生物價高達90，是一種氨基酸配合優越的蛋白質，而且含有豐富的蛋氨酸及胱氨酸，有保護肝臟的功能。DHA、EPA均能減少血液中的中性脂肪，有利于肝細胞再生，而牛磺酸具有促進肝臟排泄的作用，經常食用金槍魚食品，能夠保護肝臟，提高肝臟的排泄功能，降低肝臟發病率。金槍魚中的EPA、蛋白質、牛磺酸均有降低膽固醇的功效，經常食用，能有效地減少血液中的惡性膽固醇，增加良性膽固醇，從而能預防因膽固醇含量過高所引起的心血管疾病。鑒于金槍魚的上述種種優點，目前金槍魚的消費量逐年增大，其中生魚片是金槍魚的最重要的消費方式。藍鰭金槍魚由于捕撈量稀少，因而其經濟價值較高，藍鰭金槍魚是長鰭金槍魚和大目金槍魚價格的兩倍之多，然而生魚片缺乏外部形態學特征，不易鑒定其真偽，不法商家以次充好，甚至通過染色的方式，以低價值金槍魚生魚片冒充高價值金槍魚生魚片，獲取暴利，擾亂了市場秩序，破壞了商業誠信，損害了消費者利益，因此急需針對上述三種金槍魚生魚片建立快速、準確的鑒定方法。分子生物學技術為金槍魚的真偽鑒定提供了可靠的理論和技術，其中線粒體DNA(mitochondrial, mtDNA)常常作為真偽鑒定研究的主要對象。mtDNA具有分子結構簡單、母系遺傳進化速率適中、無重組等優點，比核DNA更容易檢測，采用mtDNA作為分子標記的研究已經廣泛展開，進化關系相關或相近的物種都能得到區分和鑒定。而線粒體DNA中的細胞色素b (cytochrome b,cyt b)基因進化速度適中，是分析種內、種間遺傳多樣性和進化關系的適當的DNA標記，通過PCR擴增cytb基因片段，再通過測序進行序列進化分析，已經廣泛用于生物的分類與鑒定研究。限制性片段長度多態性(restrictionfragment length polymorphism,RFLP)分析技術是分子生物學的重要分析方法之一，用于檢測DNA序列多態性。而PCR-RFLP是將PCR技術、RFLP分析與電泳方法聯合應用，先將待測的靶DNA片段進行PCR擴增，然后應用DNA限制性內切酶對擴增產物進行酶切，最后經電泳分析靶DNA片段的酶切圖譜進行分型、分類的一種方法，具有簡便快捷、分辨率高、無需測序的優點，在水產品真偽鑒定中具有重要的應用價值。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種用于大目、長鰭、藍鰭金槍魚生魚片來源魚品種的鑒定方法，針對目前市場上以長鰭金槍魚和大目金槍魚生魚片假冒藍鰭金槍魚生魚片的行為，解決金槍魚生魚片來源魚的品種真偽難以鑒別的問題。本發明在cyt b基因PCR擴增的基礎上，通過大量DNA序列數據模擬與實際樣本分析，確定了上述三種金槍魚cytb基因中的物種特異性酶切位點，從而為大目、長鰭、藍鰭三種金槍魚生魚片的鑒別提供了快速準確的方法。本發明是通過如下技術方案實現的 一種用于大目、長鰭、藍鰭金槍魚生魚片來源魚品種的鑒定方法，包括以下步驟
I)提取金槍魚生魚片DNA ；2)以提取的DNA為模板，以F1/F2為引物，PCR擴增cytb基因片段，其中F I 5-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3 ；F2 5-CCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3 ；3)純化PCR產物，通過限制性內切酶Fok I與Stu I將純化后的PCR產物分別進行酶切處理；4)瓊脂糖凝膠電泳分析PCR的酶切產物；進一步，所述的PCR反應條件為
權利要求
1.一種大目、長鰭和藍鰭金槍魚生魚片的鑒定方法，其特征在于包括以下步驟 1)提取金槍魚生魚片DNA； 2)以提取的DNA為模板，以F1/F2為引物，PCR擴增cytb基因片段，其中Fl:5-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3 ；F2 5-CCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3 ； 3)純化PCR產物，通過限制性內切酶FokI與StuI將純化后的PCR產物分別進行酶切處理； 4)瓊脂糖凝膠電泳分析PCR的酶切產物。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述的PCR反應條件為
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于所述的瓊脂糖凝膠電泳檢測所用的凝膠濃度為1.5%。
4.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于所述的FokI酶切反應體系為 PCR 純化產物5. 0-10. OuL FokI LOuL IOX限制性內切酶緩沖液2. 0 ii L 、0. I % BSA 2. Oii L ddH20 補足至 20. O ii L 所述的FokI酶切反應體系為 PCR 純化產物5. 0-10. OuL StuI LOuL IOX限制性內切酶緩沖液2. O i! L ddH20 補足至 20. O ii L 混勻后于37°C孵育I. O 2. O小時。
全文摘要
一種大目、藍鰭、和長鰭金槍魚生魚片的鑒定方法，屬于食品檢測技術領域，包括以下步驟金槍魚生魚片DNA的提取，以提取DNA為模板，以F1/F2為引物，PCR擴增cytb基因片段，電泳檢測擴增片段，純化后將PCR產物用限制性內切酶FokI和Stu I進行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳分析酶切圖譜對上述3種金槍魚魚片進行原料魚真偽鑒別。本發明從分子水平上對金槍魚生魚片的來源魚品種進行鑒定，能夠準確區分金槍魚生魚片的來源，對規范金槍魚生魚片市場具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102732630SQ20121022841
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月4日 優先權日2012年7月4日
發明者姚琳, 宋春麗, 朱文嘉, 李曉慶, 李青嬌, 江艷華, 王聯珠, 翟毓秀 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所