專利名稱：一種雞源性抗雞新城疫病毒p蛋白的單鏈抗體zl1、其制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗雞新城疫病毒的基因工程單鏈抗體ZLl、表達該單鏈抗體的表達載體和宿主細胞、該單鏈抗體的制備方法以及其用途，所述單鏈抗體能與雞新城疫病毒P蛋白特異性結合活性。
背景技術：
雞新城疫是新城疫病毒引起的禽類急性、高度接觸性和致死性的傳染病，對我國 乃至世界養禽業的危害及其嚴重，被國際獸醫局確定為A類傳染病，也是我國禽肉出口檢疫的重要疾病之一。對于病毒性傳染病，目前尚沒有特異性治療藥物。單鏈抗體等基因工程抗體，以其獨特的抗病毒作用及可以大規模工程化制備的優勢，顯示了巨大的研發抗病毒藥物的潛力，受到該領域高度重視。

發明內容
本發明的目的是提供一種雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的基因工程單鏈抗體ZL1，該單鏈抗體能夠與雞新城疫病毒P蛋白特異性結合，可用于雞新城疫的預防和/或治療。一種雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體ZLl，其至少具有如SEQ ID No. I所示氨基酸序列的輕鏈可變區、如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的重鏈可變區和位于輕鏈可變區與重鏈可變區之間的中間連接肽，所述中間連接肽為(Gly4Ser)3。上述單鏈抗體具有如SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列。本發明的另一目的是提供一種編碼所述雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體ZLl的基因，其具有SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。為了方便地對單鏈抗體進行檢測純化和進一步的操作，可以在上述序列的基礎上進一步設計酶切位點和識別序列，優選進一步含有內切酶位點Notl、NcoI和識別序列。其中包括 NcoI =CCATGG NotI :GCGGCCGC。本發明的再一目的是提供一種含有編碼上述單鏈抗體的基因的表達載體。上述表達載體為原核表達載體，優選為P0PE101-XP載體。本發明的再一目的是提供一種制備上述雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體(ZLl)的方法，包括以下步驟(I)采用RT-PCR直接從ND GA/VA疫苗免疫的雞脾臟RNA中擴增出抗體編碼基因的重鏈可變區基因和輕鏈可變區基因；(2)利用SOE-PCR法將linker與VH基因和VL基因相連構建雞源性單鏈抗體編碼
基因;(3)將步驟(2)的雞源性單鏈抗體編碼基因克隆到原核表達載體pOPElOl-XP中，構建重組質粒；
(4)將步驟(3)的原核表達載體pOPElOl-XP轉化入E. coli JM109感受態細胞(北京全式金生物技術有限公司)，培養、表達單鏈抗體；(5)將步驟(4)表達的單鏈抗體用以原核表達的新城疫病毒P蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA進行篩選，陽性克隆即為抗新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體；(6)分離純化步驟(5)所得陽性克隆培養產物，即獲得所述雞源性抗雞新城疫病毒的單鏈抗體。(按照上海意泓生物科技有限公司純化柱說明書操作進行)需要說明的是，以上各步驟采用的實驗材料均為正規公司獲得的標準材料，所用方法均為標準試劑盒產品說明書所述方法(見相應的實施例)，各步驟獲得的中間產品及最后的終產品均經過多次試驗證明可以重復獲得，其生物學性質保持穩定一致。說明本發明各試驗步驟所涉及的中間產品和終產品均可以按照本發明所陳述的發法準確獲得.本發明的再一目的是提供上述雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體在用于 制備雞新城疫的預防、治療藥物中的應用。本發明的技術原理是采用RT-PCR直接從ND (新城疫)GA/VA疫苗株免疫的雞脾臟RNA中擴增出抗體編碼基因的重鏈可變區(VH)基因和輕鏈可變區(VL)基因。利用SOE-PCR(重組鏈延伸反應)法將linker與VH基因和VL基因相連構建雞源性單鏈抗體(ScFv)基因，并將其克隆到原核表達載體P0PE101-XP中，構建重組質粒并轉入大腸桿菌表達，間接ELISA篩選原核表達的抗NDV單鏈抗體的陽性克隆，測序后進行Clustalw多序列比較，證明該單鏈抗體屬于雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體。本發明的有益效果是抗雞新城疫病毒的基因工程抗體能與雞新城疫病毒P蛋白特異性結合，能夠用于雞新城疫的預防和治療。


圖I是實施例I的p0PE101-XP重組載體的結構圖。圖2是單鏈抗體ZLl的編碼基因及其對應的氨基酸序列。
具體實施例方式實施例I雞源性抗雞新城疫病毒的單鏈抗體的制備I :將雞新城疫疫苗(Bio ND VG/GA購自梅里亞集團)按使用說明免疫雞(羅曼母雞，4月齡、體重I. 5kg，購自上海思甜家禽養殖專業合作社)，用常規(參照F.M.奧斯伯等《精編分子生物學實驗指南》)ELISA法檢測血清抗體效價大于1:20000時，收獲雞脾臟，經勻漿研磨后，用Trizol法(TRIZ0L Reagent購自TaKaRa公司)提取總RNA。以提取的總RA為模版，采用Oligo primer,根據反轉錄試劑盒(cDNA第I鏈合成試劑盒購自TaKaRa公司)的產品說明操作步驟，合成第I鏈cDNA。2 :根據GenBank已公布的雞抗體編碼基因可變區序列(AJ298107. I)的FR區設計擴增抗體輕、重鏈的引物(表1)，其中VHlF和VHlR用于擴增VH區；VL1F和VLlR用于擴增VL區；VH2R、VH2F用于VH基因加入酶切位點和Linker序列；VL2R、VL2F用于VL基因加入酶切位點和Linker序列。其中，VH2F、VL2R分別含有Not I和Nco I酶切位點；VH2R、VL2F含互補的Linker序列(酶切位點和Linker序列在表I中用下劃線標示出)。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
表I擴增抗體可變區的引物及其擴增片段大小
權利要求
1.一種雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體ZLl，是與原核表達的新城疫病毒P蛋白結合的單鏈抗體，其至少具有如SEQ ID No. I所示氨基酸序列的輕鏈可變區、如SEQ IDNo. 2所示氨基酸序列的重鏈可變區，和位于輕鏈可變區與重鏈可變區之間的中間連接肽。
2.如權利要求I所述的單鏈抗體ZLl，其特征在于其具有如SEQID No. 3所示的氨基酸序列。
3.—種編碼如權利要求I所述的單鏈抗體的基因，其特征在于其具有SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。
4.如權利要求3所述的基因，其特征在于所述核苷酸序列中進一步包含內切酶位點NotI、NcoI，其中 NcoI 為 CCATGG，NotI 為 GCGGCCGC。
5.含有權利要求3-4任一項所述的基因的表達載體。
6.如權利要求5所述的表達載體，其特征在于所述載體為原核表達載體。
7.如權利要求6所述的表達載體，其特征在于所述載體為pOPElOl-XP載體。
8.一種制備如權利要求I所述的雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體的方法，包括以下步驟 (1)采用RT-PCR直接從NDGA/VA疫苗免疫的雞脾臟RNA中擴增出抗體編碼基因的重鏈可變區基因和輕鏈可變區基因； (2)利用SOE-PCR法將linker與VH基因和VL基因相連構建雞源性單鏈抗體編碼基因； (3)將步驟(2)的雞源性單鏈抗體編碼基因克隆到原核表達載體pOPElOl-XP中，構建重組質粒； (4)將步驟(3)的原核表達載體pOPElOl-XP轉化入E.coli JM109感受態細胞，培養、表達單鏈抗體； (5)將步驟(4)表達的單鏈抗體用以原核表達的新城疫病毒P蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA進行篩選，陽性克隆即為抗新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體ZLl ； (6)分離純化步驟(5)所得陽性克隆培養產物即獲得所述雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體ZLl。
9.如權利要求I或2所述的雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體ZLl在用于制備雞新城疫的預防和/或治療藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種利用分子生物學手段制備雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的基因工程單鏈抗體ZL1，其至少具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的輕鏈可變區、如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的重鏈可變區和位于輕鏈可變區與重鏈可變區之間的中間連接肽。ELISA實驗證明，獲得的抗雞新城疫病毒的基因工程單鏈抗體能與原核表達的雞新城疫病毒P蛋白特異性結合，顯示了該單鏈抗體具有一定的結合新城疫病毒P蛋白的活性，可以用于雞新城疫的預防和/或治療。
文檔編號C12N15/70GK102746398SQ201210228688
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月3日 優先權日2012年7月3日
發明者張艷玲, 朱建國, 李本強 申請人:上海交通大學