專利名稱：抑制mpg表達的產品在使細胞停留在g1期中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及抑制MPG表達的產品在使細胞停留在Gl期中的應用。
背景技術：
生命是從一代向下一代傳遞的連續過程，因此是一個不斷更新、不斷從頭開始的 過程。細胞的生命開始于產生它的母細胞的分裂，結束于它的子細胞的形成，或是細胞的自身死亡。通常將通過細胞分裂產生的新細胞的生長開始到下一次細胞分裂形成子細胞結束為止所經歷的過程稱為細胞周期。在這一過程中，細胞的遺傳物質復制并均等地分配給兩個子細胞。細胞周期(cell cycle)是指細胞從第一次分裂結束產生新細胞到第二次分裂結束所經歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段。(一)間期間期又分為三期、即DNA合成前期(Gl期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期)。1.G1 期(first gap)從有絲分裂到DNA復制前的一段時期，又稱合成前期，此期主要合成RNA和核糖體。該期特點是物質代謝活躍，迅速合成RNA和蛋白質，細胞體積顯著增大。這一期的主要意義在于為下階段S期的DNA復制作好物質和能量的準備2. S 期(synthesis)DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同時還要合成組蛋白。DNA復制所需要的酶都在這一時期合成。3. G2 期(second gap)DNA合成后期，是有絲分裂的準備期。在這一時期，DNA合成終止，大量合成RNA及蛋白質，包括微管蛋白和促成熟因子等。(二)分裂期(M期)細胞分裂期前期，中期，后期，末期。細胞的有絲分裂(mitosis)需經前、中、后，末期，是一個連續變化過程，由一個母細胞分裂成為兩個子細胞。I.前期(prophase)染色質絲高度螺旋化,逐漸形成染色體(chromosome)。染色體短而粗，強嗜堿性。兩個中心體向相反方向移動，在細胞中形成兩極；而后以中心粒隨體為起始點開始合成微管，形成紡錘體。隨著核仁相隨染色質的螺旋化，核仁逐漸消失。核被膜開始瓦解為離散的囊泡狀內質網。2.中期(metaphase)細胞變為球形，核仁與核被膜已完全消失。染色體均移到細胞的赤道平面，從紡錘體兩極發出的微管附著于每一個染色體的著絲點上。從中期細胞可分離得到完整的染色體群。分離的染色體呈短粗棒狀或發夾狀，均由兩個染色單體借狹窄的著絲點連接構成。
3.后期(anaphase)由于紡錘體微管的活動，著絲點縱裂，每一染色體的兩個染色單體分開，并向相反方向移動，接近各自的中心體，染色單體遂分為兩組。與此同時，細胞波拉長，并由于赤道部細胞膜下方環行微絲束的活動，該部縮窄，細胞遂呈啞鈴形。4.末期(telophase)染色單體逐漸解螺旋，重新出現染色質絲與核仁；內質網囊泡組合為核被膜；組胞赤道部縮窄加深，最后完全分裂為兩個2倍體的子細胞。另外，還存在一個GO期暫時離開細胞周期，停止細胞分裂，去執行一定生物學功能的細胞所處的時期。乳腺癌是女性排名第一的常見惡性腫瘤。2011年美國CA:A Cancer JournalforClinicians雜志(2010年影響因子94. 262)公布的最新統計數據顯示，美國2011年預計將有230480例女性罹患乳腺癌，占女性新發惡性腫瘤的30%，排名女性惡性腫瘤發病率第一位。在我國北京、上海、天津等大城市的統計顯示乳腺癌同樣是我國女性最常見的惡性腫瘤，且發病率呈逐年上升趨勢。

發明內容
本發明的目的是提供抑制MPG表達的產品在使細胞停留在Gl期中的應用。本發明提供了抑制MPG蛋白編碼基因表達的物質在制備產品中的應用；所述產品具有如下功能中的至少一種(I)抑制癌細胞增殖；(2)治療癌癥；(3)使細胞停留在細胞周期的Gl期。所述應用中，所述(I)中，所述癌細胞可為乳腺癌細胞，具體可為MCF7細胞。所述應用中，所述(2 )中，所述癌癥可為乳腺癌，具體可為由MCF7細胞引起的乳腺癌。所述應用中，所述(3)中，所述細胞具體可為MCF7細胞。本發明還保護一種產品，它的活性成分為抑制MPG蛋白編碼基因表達的物質；所述產品具有如下功能中的至少一種(I)抑制癌細胞增殖；(2)治療癌癥；(3)使細胞停留在細胞周期的Gl期。所述產品中，所述(I)中，所述癌細胞可為乳腺癌細胞，具體可為MCF7細胞。所述產品中，所述(2)中，所述癌癥可為乳腺癌，具體可為由MCF7細胞引起的乳腺癌。所述產品中，所述(3)中，所述細胞具體可為MCF7細胞。本發明還保護抑制MPG蛋白編碼基因表達的物質在使細胞停留在細胞周期的Gl期中的應用。所述細胞具體可為MCF7細胞。本發明還保護抑制MPG蛋白編碼基因表達的物質在抑制癌細胞增殖中的應用。所述癌細胞可為乳腺癌細胞，具體可為MCF7細胞。以上任一所述MPG蛋白可為如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白質。以上任一所述MPG蛋白編碼基因可為如下(I)或(2)或(3)所述的DNA分子(I)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(3)與(I)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
上述嚴格條件可為在0. I X SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。以上任一所述抑制MPG蛋白編碼基因表達的物質具體可為如下(C)或(d)(c)序列表的序列3自5’末端第I至21位核苷酸所示的雙鏈RNA分子(siRNA)；(d)序列表的序列3所示的單鏈核酸分子和序列表的序列4所示的單鏈核酸分子組成的雙鏈核酸分子。本發明還保護一種核酸分子，為如下(C)或(d)(c)序列表的序列3自5’末端第I至21位核苷酸所示的雙鏈RNA分子(siRNA)；(d)序列表的序列3所示的單鏈核酸分子和序列表的序列4所示的單鏈核酸分子 組成的雙鏈核酸分子。本發明的發明人發現，MPG蛋白參與細胞周期的調控，通過抑制MPG蛋白編碼基因的表達可以使細胞停留在細胞周期的Gl期，從而抑制細胞的增殖。本發明對于細胞周期的研究，抑制細胞增殖的研究具有重大的理論價值，對于抑制癌細胞和治療癌癥具有重大的應用價值。


圖I為實施例2中的流式細胞儀圖譜。圖2為實施例2中流式細胞儀輸出的各時相細胞的百分率。圖3為實施例3中各組處理的相對吸光值。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。MCF7細胞(人乳腺癌細胞):美國模式培養物集存庫(簡稱ATCC ；http://www. atcc.0找/)，編號為肌8-22。MPG蛋白如序列表的序列I所不，其編碼基因(MPG基因)如序列表的序列2所不。實施例I、siRNA的設計根據對MPG基因進行分析和篩選，設計用于抑制MPG基因表達的siRNA( siRNA甲)如下5’-AAGAAGCAGCGACCAGCUAGAIT-3’(序列表的序列 3)；3， -TTUUCUUCGUCGCUGGUCGAUCU-5，。設計作為陰性對照的siRNA (siRNA乙)如下5， -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，；3， -TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5，。實施例2、抑制MPG表達的產品在使細胞發生Gl期阻滯中的應用MCF7細胞(人乳腺癌細胞)培養于含10%體積的胎牛血清、100u/ml青霉素和IOOu/ml雙鏈霉素)的DMEM培養基中，37°C、5%的CO2的條件下培養。本實施例中所用的PBS緩沖液均為pH7. 2,0. OlM的PBS緩沖液。I、將MCF7細胞鋪于12孔板(6. OX IO4個細胞/孔)，然后培養至細胞密度達到60%-80%，細胞狀態良好情況下轉染，然后分組進行如下處理(借助購自Invitrogen的轉染試劑lipofectamine2000并按說明書進行siRNA的轉染)第一組每孔轉染40pmol siRNA甲；第二組每孔轉染40pmol siRNA 乙。2、轉染48小時后，胰酶消化細胞至單個細胞懸浮，用70%乙醇水溶液固定24小時(細胞死亡)。3、用PBS緩沖液洗滌細胞，然后加入用PBS緩沖液配置的含50mg/ml熒光染料PI(碘化丙啶)和lmg/mlRNA酶的溶液，孵育30分鐘。4、采用流失細胞儀分析DNA含量。PI，即碘化丙錠，可以與細胞內DNA和RNA結合，采用RNA酶將RNA消化后，通過流式細胞術檢測到的與DNA結合的PI的熒光強度直接反映了細胞內DNA含量的多少。由于細胞周期各時相的DNA含量不同，正常細胞的G0/G1期具有二倍體細胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。因此，通過流式細胞術PI染色法對細胞內DNA含量進行檢測時，可以將細胞周期各時相區分為G0/G1期，S期和G2/M期，并可通過流式細胞儀直接輸出各時相細胞的百分率。結果見圖I (直方圖)和圖2。第一組中，處于G0/G1期的細胞比率顯著高于第二組。結果表明，在MCF7細胞中，通過抑制MPG基因表達能夠使細胞發生Gl期阻滯。實施例3、抑制MPG表達的產品在抑制癌細胞增殖中的應用MCF7細胞(人乳腺癌細胞)培養于含10%體積的胎牛血清、100u/ml青霉素和IOOu/ml雙鏈霉素)的DMEM培養基中，370C >5%的CO2的條件下培養。I、將MCF7細胞鋪于96孔板(3X IO3個細胞/孔)，然后培養至細胞密度達到40%-50%，細胞狀態良好情況下轉染，然后分組進行如下處理(每組細胞設置三個復孔；借助購自Invitrogen的轉染試劑lipofectamine2000并按說明書進行siRNA的轉染)第一組每孔轉染5pmol siRNA甲；第二組每孔轉染5pmol siRNA乙。2、轉染24小時后，每孔更換IOOiU培養基，每孔再加入20 ill CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent(購于 Promega 公司，CellTiter AQueous OneSolutionCell Proliferation Assay),孵育 2 小時。3、利用酶標儀，讀取490nm的吸光度值(吸光值越大說明細胞量越多)。進行三次重復實驗，結果取平均值。第一組細胞的吸光度值為I. 167。以第一組細胞的吸光度值為1，兩組細胞的相對吸光值見圖3。結果表明，在MCF7細胞中，通過抑制MPG基因表達能夠使抑制細胞增殖。
權利要求
1.抑制MPG蛋白編碼基因表達的物質在制備產品中的應用； 所述MPG蛋白為如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白質； 所述產品具有如下功能中的至少一種 (1)抑制癌細胞增殖； (2)治療癌癥; (3)使細胞停留在細胞周期的Gl期。
2.如權利要求I所述的應用，其特征在于所述(I)中，所述癌細胞為乳腺癌細胞；所述(2)中，所述癌癥為乳腺癌。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述(I)中，所述乳腺癌細胞為MCF7細胞；所述(2)中，所述乳腺癌是由MCF7細胞引起的；所述(3)中，所述細胞為MCF7細胞。
4.一種產品，它的活性成分為抑制MPG蛋白編碼基因表達的物質； 所述MPG蛋白為如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白質； 所述產品具有如下功能中的至少一種 (1)抑制癌細胞增殖； (2)治療癌癥; (3)使細胞停留在細胞周期的Gl期。
5.如權利要求4所述的產品，其特征在于所述(I)中，所述癌細胞為乳腺癌細胞；所述(2)中，所述癌癥為乳腺癌。
6.如權利要求5所述的產品，其特征在于所述(I)中，所述乳腺癌細胞為MCF7細胞；所述(2)中，所述乳腺癌是由MCF7細胞引起的；所述(3)中，所述細胞為MCF7細胞。
7.抑制MPG蛋白編碼基因表達的產品在使細胞停留在細胞周期的Gl期中的應用； 所述MPG蛋白為如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白質。
8.抑制MPG蛋白編碼基因表達的產品在抑制癌細胞增殖中的應用； 所述MPG蛋白為如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白質。
9.如權利要求I至3中任一所述的應用，或如權利要求4至6中任一所述的產品，或如權利要求7所述的應用，或如權利要求8所述的應用，其特征在于所述抑制MPG蛋白編碼基因表達的物質具體可為如下(c)或(d)(c)序列表的序列3自5’末端第I至21位核苷酸所示的雙鏈RNA分子； Cd)序列表的序列3所示的單鏈核酸分子和序列表的序列4所示的單鏈核酸分子組成的雙鏈核酸分子。
10.核酸，為如下(c)或(d) (c)序列表的序列3自5’末端第I至21位核苷酸所示的雙鏈RNA分子； Cd)序列表的序列3所示的單鏈核酸分子和序列表的序列4所示的單鏈核酸分子組成的雙鏈核酸分子。
全文摘要
本發明公開了抑制MPG表達的產品在使細胞停留在G1期中的應用。本發明提供了抑制MPG蛋白編碼基因表達的物質在制備產品中的應用；所述產品具有如下功能中的至少一種(1)抑制癌細胞增殖；(2)治療癌癥；(3)使細胞停留在細胞周期的G1期。本發明的發明人發現，MPG蛋白參與細胞周期的調控，通過抑制MPG蛋白編碼基因的表達可以使細胞停留在細胞周期的G1期，從而抑制細胞的增殖。本發明對于細胞周期的研究，抑制細胞增殖的研究具有重大的理論價值，對于抑制癌細胞和治療癌癥具有重大的應用價值。
文檔編號C12N15/113GK102772805SQ20121022916
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月3日 優先權日2012年7月3日
發明者宋珊珊, 張令強, 賀福初, 邢桂春 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所