專利名稱：抑制PPFIA1基因表達的siRNA及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種SiRNA，特別涉及一種抑制PPFIAl基因表達的siRNA及其應用。
背景技術：
慢性粒細胞性白血病(Chronic Myelogenous leukemia, CML)是一種以粒系增生為主的造血干細胞惡性增殖性疾病，其特征性的細胞遺傳學標志是Ph染色體t(9 ；22)(q34 ；qll)。P210BCR-ABL融合蛋白是Ph染色體的產物，具有強酪氨酸激酶活性，與CML的發(fā)生有著密切的關系，它的產生可導致其下游一系列信號蛋白的持續(xù)性磷酸化，由此引起造血干細胞發(fā)生惡性增殖、抗凋亡、黏附功能缺陷等病理生理變化。流行病學調查顯示，在我國白血病中，CML的發(fā)病率為1/105，僅次于急粒和急淋而居第三位，近年來表現(xiàn)出明顯的增加趨勢。目前，CML的治療有以下幾種方法1)化療藥物，如馬利蘭、羥基脲、干擾素等，由于缺乏腫瘤特異性，常造成較大的毒副作用；2)造血干細胞移植(HSCT)，這是現(xiàn)今 唯一能治愈CML的方法，但是受供者、年齡、病程、經濟條件、移植相關病等多種因素的限制，僅有少數(shù)患者可以接受；3)甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate),是第一個成功的特異性抑制酪氨酸激酶的分子靶向藥物，在治療CML上取得了可喜的成就，但其價格昂貴，而且因為耐藥性的問題往往導致治療失敗；4)反義技術(反義RNA或DNA)、RNA干擾(RNAinterference，RNAi)，還未獲得肯定療效(吳國林.醫(yī)學綜述，2006，12(21) :1329-1332.)。近20年來，CML的治療方法有了較大的進展，尋找腫瘤惡性轉化的關鍵“靶標”，以此為基礎開發(fā)靶向藥物與現(xiàn)代化療藥物聯(lián)合應用日益表現(xiàn)出巨大的治療潛力，有待于我們進行不斷地探索與研究。PPFIAl基因定位于人類基因組11ρ13. 3，其編碼的蛋白質含有1202個氨基酸，分子量為126kDa,屬于白細胞共同抗原相關蛋白(leukocyte common antigen-relatedprotein, LAR)-蛋白酪氨酸憐酸酶(protein-tyrosine phosphatase, PTPase)相互作用蛋白家族(Liprin family)。該蛋白N端含有螺旋卷曲結構，C端具有3個SAM(streyl alpha motif)結構域，SAM 結構域中含有 LH (liprin homology)結構。已有研究發(fā)現(xiàn)，SAM結構域可以與多種蛋白、RNA、脂膜相互作用(Feng Qiao, James U. Bowie.Science’s STKE: signal transduction knowledge environment,2005，286，re7.)。Serra-Pages C等的研究發(fā)現(xiàn)，PPFIAl可以結合到白細胞共同抗原相關的蛋白酪氨酸憐酸酶(leukocyte common antigen-related protein-tyrosine phosphatase,LAR PTPase)的 D2 結構域(Serra-PagSs C, Kedersha NL,et al.The EMBOJournal, 1995，14(12) :2827-2838.)。除了 LAR PTPase, PTPase 家族中的與其結構類似的 PTP δ、PTP σ 都可以與 PPFIAl 相互作用(Pulido R, Serra-Pages C，et al. Proc NatlNcad Sci USA, 1995，92 (25) : 11686-11690.)。另外，已有研究表明PPFIAl在多種腫瘤中高表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。Jarvinen的研究小組通過DNA-RNA高密度芯片聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，在喉癌細胞系中，PPFIAl可能是llql3擴增區(qū)的靶基因，同時發(fā)現(xiàn)llql3擴增區(qū)基因的高水平擴增對PPFIA1RNA的表達影響較大(Jarvien AK, Autio R, Haapa-Paananen Set al. Oncogene, 2006, 25 (52) :6997-7008. )。Tan 等對頭頸鱗癌標本做了類似的 DNA-RNA分析也發(fā)現(xiàn)到 PPFIAl 的表達顯著上調(Tan KD, Zhu Y, Tan HK et al. Genes ChromosomesCancer, 2008，47 (4) :353-362. )。V Astro等發(fā)現(xiàn)PPFIAl在乳腺癌中存在高水平表達，通過功能研究發(fā)現(xiàn)該基因是MDA-MB-231細胞侵襲和遷徙過程的關鍵分子(AstroV，AspertiC，Cangi G et al. Oncogene, 2011，30 (15) : 1841-1849.)。利用微速攝影技術研究發(fā)現(xiàn)該基因可以影響細胞的遷徙和偽足數(shù)目，但并不會影響偽足覆蓋的面積。降低和升高該基因的表達，可以抑制和增強細胞對胞外基質的水解能力。Spangler S A等的研究表明PPFIAl可以與突觸小泡錨定和釋放過程中的一種功能蛋白結合，對神經元突觸結構的組裝及穩(wěn)定性有著一定的影響(Spangler S. A, Hoogenraad C. C. BIOCHEMICAL SOCIETY TRANSACTIONS, 2007，35(5) :1278-1282.)。但是，在慢性粒細胞性白血病中，目前還未見有關PPFIAl基因的研究報道。RNAi是近幾年發(fā)展起來的一種新型基因阻斷技術，其主要功能成分為siRNA，siRNA具有高度的序列專一性，可特異性抑制靶目標mRNA的表達，使目的基因沉默。利用此技術，將細胞表型的改變與基因表達和功能的變化聯(lián)系起來，不僅有助于了解腫瘤發(fā)生、發(fā) 展過程，而且有助于辨認和確定腫瘤基因治療的靶點。目前，RNA干擾已廣泛應用于腫瘤研究工作中，并取得了一些突破性進展，成為CML基因治療研究的重要方向。

發(fā)明內容
本發(fā)明的首要目的在于提供一種抑制PPFIAl基因表達的siRNA。本發(fā)明的另一目的在于提供上述抑制PPFIAl基因表達的siRNA的應用。本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)一種抑制PPFIAl基因表達的siRNA，其序列為正義鏈5’-CCACAAAGCUCUGGAUGAA-3’，反義鏈5’-UUCAUCCAGAGCUUUGUGG-3’；優(yōu)選為，所述的抑制PPFIAl基因表達的siRNA序列(包括正義鏈和反義鏈)的3’端垂懸有dTdT，dTdT結構有利于保護RNA免受酶解；上述抑制PPFIAl基因表達的siRNA的應用抑制PPFIAl基因表達的siRNA可用于研究PPFIAl基因的功能，特別是用于進行PPFIAl基因與白血病細胞生長的相關性研究；抑制PPFIAl基因表達的siRNA可用于制備抗白血病藥物。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果(I)本發(fā)明提供的抑制PPFIAl基因表達的siRNA能有效沉默PPFIAl基因，為研究PPFIAl基因的功能提供了新的技術方案。(2)本發(fā)明通過抑制PPFIAl基因表達的siRNA研究PPFIAl基因在白血病細胞中的功能，發(fā)現(xiàn)下調PPFIAl的表達可抑制白血病細胞生長，促進其凋亡。(3)本發(fā)明提供的抑制PPFIAl基因表達的siRNA可用于制備抗白血病藥物，為慢性粒細胞性白血病的治療做出貢獻。


圖I是Real-time PCR檢測K562細胞內PPFIAlmRNA的相對表達水平圖，*P〈0. 05。
圖2是Western bloting檢測K562細胞內PPFIAl蛋白的表達水平圖。圖3是Western bloting檢測K562細胞內PPFIAl蛋白的相對表達水平圖，*Ρ〈0· 05。圖4是PPFIAlsiRNA抑制F562細胞生長的量效關系圖，*Ρ<0. 05。圖5是PPFIAlsiRNA抑制Κ562細胞生長的時效關系圖，*Ρ<0. 05。圖6是Annexin V/PI雙染檢測PPFIAlsiRNA對Κ562細胞凋亡的影響圖，AnnexinV/PI雙染檢測結果。圖7是Annexin V/PI雙染檢測PPFIAlsiRNA對Κ562細胞凋亡的影響圖，各組早期凋亡細胞比例比較，*Ρ〈0. 05。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。使用的材料白血病Κ562細胞購自中國科學院上海細胞所；新生牛血清購自杭州四季青生物工程科技有限公司；1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；MTT及二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司;Trizol試劑、RNA酶抑制劑、Oligo d(T) 15、蛋白質上樣緩沖液購自天根生化科技(北京)有限公司，M-MLV逆轉錄酶購自Promega公司，Taq DNA Polymerase、dNTP購自Takara公司，SYBR Green I核酸染料購自廈門百維信生物科技有限公司；RIPA細胞裂解液購自上海申能博彩生物科技有限公司，Bradford蛋白濃度測定試劑盒購碧云天生物技術研究所；β -actin 一抗購自武漢博士德生物工程公司，β - actin 二抗購自北京博奧森生物技術公司，PPFIAl—抗購自abeam公司，PPFIAl 二抗購自北京聚研生物技術有限公司。統(tǒng)計學處理SPSS13. O統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)土標準差(5±S)表示，采用完全隨機設計的單因素方差分析法(one-way AN0VA)分析各組數(shù)據(jù)間差異的顯著性。以P〈0. 05為有顯著性差異。實施例I(一)PPFIAlsiRNA 的設計與合成根據(jù)GenBank 基因庫中 PPFIAl 已知序列(Gene ID :8500, NM_003626. 2，NM_177423. I),按照siRNA設計原則，結合Ambion公司提供的在線設計工具siCatch siRNA Design針對編碼區(qū)siRNA靶點位置設計；PPFIAlsiRNA 的序列為正義鏈5’-CCACAAAGCUCUGGAUGAA-3’，反義鏈5’-UUCAUCCAGAGCUUUGUGG-3’；在PFIAlsiRNA的序列的3’端垂懸有dTdT，由廣州銳博生物技術公司合成。以隨機序列的RNA雙鏈(scramble，SCR)作隨機對照，隨機序列的RNA雙鏈購自上海吉瑪制藥技術有限公司，其目錄號為A06001。(二)白血病K562細胞的培養(yǎng)
將白血病K562細胞接種于含體積分數(shù)10%的新生牛血清、無抗生素的1640培養(yǎng)基中，置于37°C、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱，飽和濕度下培養(yǎng)；每2 3天換液傳代；實驗選用對數(shù)生長期、O. 2%臺盼藍拒染率>95%的細胞。(三)Real-timePCR檢測K562細胞內PPFIAlmRNA的相對表達水平(I)實驗分PPFIAlsiRNA組、隨機對照組(SCR)和空白對照組(Control)，各組細胞以I. 5 X 105/mL的密度接種于24孔板，每孔400 μ L ；(2)使用 Invitrogen 公司 Lipofectamine 2000 轉染 PPFIAlsiRNA和隨機對照(轉染方法參照Lipofectamine 2000說明書)，PPFIAlsiRNA組和隨機對照組的核酸轉染終濃度為lOOnmol/L，空白對照組加入與藥物等體積(100 μ L)的無血清Opti-MEM，轉染終體積500 μ L ；
(3)轉染后的Κ562細胞培養(yǎng)6h后加入500 μ L含體積分數(shù)20%的新生牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；(4)繼續(xù)培養(yǎng)細胞48h后，使用Trizol試劑提取各組細胞總RNA (提取細胞總RNA的方法參照天根生化科技有限公司的Trizol試劑說明書)，提取的總RNA用紫外分光光度儀(UVPupland，USA)測A260ZA280進行RNA純度及濃度計算；(5)利用 SYBR Green I Real-time PCR 以 GAPDH 為內參檢測 K562 細胞內 PPFIAlmRNA的表達水平將步驟2)提取的總RNA進行逆轉錄和Real_timePCR，逆轉錄條件37°C 持續(xù) lh，95°C 持續(xù) 5min ；Real-time PCR 條件① 94°C 持續(xù) 5min，② 94°C 持續(xù) 30s，③PPFIA160°C、GAPDH57. 5°C持續(xù)30s，④72°C持續(xù)30s，⑤讀板，⑥步驟② ⑤循環(huán)39次，⑦融解曲線分析，從60°C到95°C，每0. 3°C讀一次板，停留I秒；PPFIAlmRNA的相對表達水平用Λ Ct和2_AAct計算；其中PCR所用引物自行設計，由上海生物工程技術有限公司合成，PPFIAl 上游引物5’ -GCTTCAGTTAACCTTTTTCATGTATATCCA-3’，下游引物5’ -TCGACAGTTAACATAAACGTAAAATCCTT-3’ ；GAPDH 上游引物5’ -CAACGGATTTGGTCGTATT-3 '，下游引物5’-CACAGTCTTCTGGGTGGC-3'。Real-time PCR檢測結果如表I和圖I所示終濃度100nmol/L的PPFIAlsiRNA作用于K562細胞后48小時后，PPFIAlmRNA的表達水平顯著降低，與隨機對照組和空白對照組相比有顯著差異(*Ρ〈0· 05)，表明PPFIAlsiRNA能有效抑制PPFIAlmRNA的表達。表I. Real-time PCR檢測 K562 細胞中 PPFIAl mRNA 表達水平結果統(tǒng)計(i±s，n=3)
權利要求
1.一種抑制PPFIAl基因表達的siRNA，其序列為 正義鏈5’ -CCACAAAGCUCUGGAUGAA-3’， 反義鏈5’ -UUCAUCCAGAGCUUUGUGG-3’。
2.根據(jù)權利I所述的抑制PPFIAl基因表達的siRNA，其特征在于所述的抑制PPFIAl基因表達的siRNA序列的3’端垂懸有dTdT。
3.權利要求I或權利要求2所述的抑制PPFIAl基因表達的siRNA在研究PPFIAl基因的功能中的應用，其特征在于所述的抑制PPFIAl基因表達的siRNA用于研究PPFIAl基因對白血病細胞生長的影響。
4.權利要求I或權利要求2所述的抑制PPFIAl基因表達的siRNA在制備抗白血病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制PPFIA1基因表達的siRNA及其應用，所述的siRNA的正義鏈序列為5'-CCACAAAGCUCUGGAUGAA-3'，反義鏈序列為5'-UUCAUCCAGAGCUUUGUGG-3′，在該siRNA序列的3'段垂懸有dTdT。本發(fā)明抑制PPFIA1基因表達的siRNA能有效沉默PPFIA1基因，為研究PPFIA1基因的功能提供了新的技術方案，PPFIA1基因被沉默后可抑制白血病細胞生長，促進其凋亡；該siRNA可用于制備抗白血病藥物。
文檔編號C12N15/113GK102827840SQ20121023461
公開日2012年12月19日 申請日期2012年7月6日 優(yōu)先權日2012年7月6日
發(fā)明者費嘉, 朱雪嬌, 駱小闖, 李育敏 申請人:暨南大學