金核霉素的生物合成基因簇及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及金核霉素的生物合成基因簇及其應用，所述基因簇包括金核霉素生物合成的4個基因，包括anmB、anmC、anmD和anmE。本發明所提供的基因簇及其編碼的蛋白可用于合成金核霉素。本發明還提供包含所述基因或基因簇的表達載體或宿主細胞，及其在醫藥、工業或農業等方面的應用。
【專利說明】金核霉素的生物合成基因簇及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物基因資源和基因工程領域。具體地說，本發明涉及金核霉素的生物合成基因簇及其應用。
【背景技術】
[0002]金核霉素(aureonuclemycin)是1987年從金色鏈霉菌蘇州變種(Streptomycesaureus var.suzhoueusis n.var Yen et al,中國微生物菌種保藏管理委員會編號CGMCCN0.0122 ;中國專利申請CN87100250)的發酵產物中分離得到的。作為一種優質的農用抗生素，金核霉素得到了廣泛的應用。
[0003]金核霉素及其結構類似物的化學合成已經由Nicholas J.Newcombe與SatoshiIchikawa等人作過深入研究,經過一個核心的由SmI2催化的Aldol反應形成C-糖苷鍵,實現金核霉素骨架結構的形成，然后經過多步反應實現環化和立體結構控制，生成終產物。化學合成經歷的步驟繁瑣,試劑復雜昂貴,并且合成過程中立體控制困難。Satoshi Ichikawa等人合成herbicidinB過程中，開始得到的產物并不是目標產物herbicidinB,而是它的異構體，他們經過分析后，改變了策略才成功的得到了 herbicidinB，但是產量很低，不能做為工農業生產用途。
[0004]上海市農藥研究所，經過二十年的努力，通過“試差法”，改變、調整發酵參數，摸索出了適合金核霉素生產的發酵條件，使金核霉素的產量得到了很大提高。但是仍然滿足不了農業應用方面對金核霉素大量且質優價廉的要求；通過對其發酵液的HPLC檢測，發現在發酵條件下，發酵液中除了金核霉素作為主要產物外，還有一種占很大比例的副產物5-脫氧次黃嘌呤核苷，將它的結構與金核霉素對比，發現其骨架結構與金核霉素具有很大的相似性，而且由于該副產物總是伴隨著金核霉素的產生而產生。然而，迄今為止本領域尚未揭示金核霉素合成基因簇。
[0005]因此，本領域急需了解金核霉素生物合成相關的基因或基因簇，以便研究金核霉素的生物合成途徑，進而通過基因工程和代謝工程手段提高金核霉素產量。

【發明內容】

[0006]本發明的目的就是提供涉及金核霉素的生物合成基因簇，及其克隆、功能研究和應用。
[0007]在第一方面，本發明提供一種金核霉素生物合成基因的集合，所述基因集合由編碼AnmB蛋白的基因、編碼AnmC蛋白的基因、編碼AnmD蛋白的基因、和編碼AnmE蛋白的基因構成。
[0008]在一優選例中，所述的AnmB蛋白包括選自下組的多肽:
[0009](a)氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽；或
[0010](b)包含(a)所限定的序列經過一個或多個(較佳地1-10個，更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；
[0011]所述的AnmC蛋白包括選自下組的多肽:
[0012](a)氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示的多肽；或
[0013](b)包含(a)所限定的序列經過一個或多個(較佳地1-10個，更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；
[0014]所述的AnmD蛋白包括選自下組的多肽:
[0015](a)氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的多肽；或
[0016](b)包含(a)所限定的序列經過一個或多個(較佳地1-10個，更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；和
[0017]所述的AnmE蛋白包括選自下組的多肽:
[0018](a)氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的多肽；或
[0019](b)包含(a)所限定的序列經過一個或多個(較佳地1-10個，更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽。
[0020]在第二方 面，本發明提供一種金核霉素生物合成基因簇，所述基因簇包括金核霉素生物合成涉及的4個基因，所述基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第5294-10434位堿基所示，具體為:
[0021]I)基因anmB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第5294-6964位堿基所示，編碼的蛋白為腺苷高半胱氨酸水解酶，長度為556個氨基酸；
[0022]2)基因anmC，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第6957-8057位堿基所示，編碼的蛋白為脫氫酶，長度為366個氨基酸；
[0023]3)基因anmD，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第8054-9172位堿基所示，編碼的蛋白為氧化還原酶，長度為372個氨基酸；和
[0024]4)基因anmE，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第9169-10434位堿基所示，編碼的蛋白為radical SAM相關蛋白，長度為421個氨基酸。
[0025]在第三方面，本發明提供本發明第二方面所述的金核霉素生物合成基因簇所編碼的編碼蛋白。
[0026]在一優選例中,所述的編碼蛋白為AnmB蛋白、AnmC蛋白、AnmD蛋白和AnmE蛋白，其氨基酸序列分別如SEQ ID N0:3-6所示。
[0027]在第四方面，本發明提供本發明第一方面所述的金核霉素生物合成基因的集合，或第二方面所述的金核霉素生物合成基因簇，或第三方面所述的編碼蛋白的用途，其用于合成抗生素金核霉素、金核霉素的藥學上可接受的鹽及類似物。
[0028]在另一優選例中，所述的合成包括生物合成、催化合成、固定化酶合成。
[0029]在第五方面，本發明提供一種載體，所述載體含有第一方面所述的金核霉素生物合成基因的集合，或含有第二方面所述的金核霉素生物合成基因簇。
[0030]在一優選例中，所述表達載體上含有多拷貝的金核霉素生物合成基因的集合，或多拷貝的金核霉素生物合成基因簇。[0031]在另一優選例中，所述的載體包括表達載體、穿梭載體。
[0032]在另一優選例中,所述的載體包括質粒、或粘粒。
[0033]在第六方面，本發明提供一種重組的宿主細胞，含有第五方面所述的載體或染色體上整合有單拷貝或多拷貝的外源的第一方面所述的金核霉素生物合成基因的集合，或單拷貝或多拷貝的第二方面所述的金核霉素生物合成基因簇。
[0034]在另一優選例中，所述宿主細胞包括鏈霉菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌。
[0035]在另一優選例中，所述宿主細胞包括金色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、白色鏈霉菌和天藍色鏈霉菌。更佳地，所述宿主細胞來自金色鏈霉菌蘇州變種或變鉛青鏈霉菌TK64。
[0036]在第七方面，本發明提供一種產生金核霉素的方法，包括步驟:培養第六方面所述的宿主細胞，從而表達金核霉素；以及從培養體系中分離金核霉素。
[0037]在第八方面，本發明提供一種金色鏈霉菌，所述金色鏈霉菌是金色鏈霉菌蘇州變種(CGMCC N0.0122)的突變株，所述突變株中金核霉素生物合成基因簇中的一個或多個基因失活，從而不產生金核霉素。
[0038]在另一優選例中，所述失活的基因選自anmB、anmC, anmD或anmE。
[0039]在另一優選例中，所述的失活包括中斷失活、缺失失活、插入失活。
[0040]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。
[0042]圖1顯示了金核霉素的化學結構。
[0043]圖2顯示了基因組文庫黏粒的PCR篩選電泳圖。各泳道如下:
[0044]M:分子量標準；
[0045]1:包含金核霉素生物合成基因簇的黏粒2H-2 ；
[0046]2:包含金核霉素生物合成基因簇的黏粒17C-10。
[0047]圖3顯示了金核霉素生物合成基因簇的基因分布圖。
[0048]圖4顯示了金核霉素產生菌及基因敲除突變株的發酵產物分析。自上而下分別是金核霉素產生菌野生型菌株(WT)、anmA同框敲除突變株(Λ anmA)、anmB同框敲除突變株(Δ anmB)、anmC同框敲除突變株(Λ anmC)、anmD同框敲除突變株(Λ anmD)、anmE同框敲除突變株(Λ anmE)、anmG同框敲除突變株(Λ anmG)的發酵產物HPLC分析,及野生型中金核霉素的質譜圖(LC-MS)。
[0049]圖5顯示了金核霉素生物合成基因簇在變鉛青鏈霉菌(S.lividans)TK64中異源表達的發酵產物分析。圖A為異源表達突變株S.lividans B-E的發酵產物HPLC圖，圖B為異源表達宿主菌野生型菌株S.lividans TK64的發酵產物HPLC圖，圖C為S.lividansB-E的發酵產物中金核霉素的質譜圖(LC-MS)。
[0050]圖6顯示了同框敲除雙交換質粒構建方法示意圖。
[0051]圖7顯示了同框敲除突變株基因型PCR驗證電泳圖。從上到下分別是anmA同框敲除突變株(Λ anmA)、anmB同框敲除突變株(Λ anmB)、anmC同框敲除突變株(Λ anmC)、anmD同框敲除突變株(Λ anmD)、anmE同框敲除突變株(Λ anmE)和anmG同框敲除突變株(Λ anmG)的基因型PCR驗證電泳圖。
【具體實施方式】
[0052]本發明人經過廣泛而深入的研究，首次從金核霉素產生菌金色鏈霉菌蘇州變種(CGMCC N0.0122)中鑒定并分離出金核霉素的生物合成基因簇，所述整個基因簇共包含4個基因，即anmB、anmC,anmD和anmE。此外,本發明人還構建了含金核霉素的生物合成基因簇(或基因)的載體和工程菌，并成功進行了金核霉素異源表達。在此基礎上完成了本發明。
[0053]金核霉素
[0054]金核霉素是一種核苷類抗生素，于1987年從金色鏈霉菌蘇州變種的發酵產物中分離得到，其由一分子腺苷與一分子葡萄糖縮合、環化而成(圖1)，化學結構類似于日本三共株式會社發表的除草素Herbicdins。
[0055]金核霉素具有良好的抗菌活性，對黃單胞桿菌(Xanthomonas)引起的植物細菌病害，如柑橘潰瘍病、水稻細菌性條斑病，特別是水稻白葉枯病(Xanthomonas Oryzae)有很好的治療效果，同時金核霉素還具有使病斑葉復綠的功能。因此，金核霉素作為優質的農用抗生素得到廣泛應用。
[0056]金色鏈霉菌蘇州變種(Streptomyces aureus var.suzhoueusis n.var Yen etal)
[0057]金色鏈霉菌(Streptomyces aureus)是鏈霉菌是一種,其孢子絲呈緊密螺旋形，有的菌株柔曲、松敞螺旋形；其孢子呈球形、卵圓形，表面光滑。而金色鏈霉菌蘇州變種(Streptomyces aureus var.suzhoueusis n.var Yen et al)是屬于金色鏈霉菌類群，其氣生菌絲呈螺旋狀，一般在2-6圈左右；孢子呈球形或卵形，大小不均，孢子表明光滑；不能在纖維素上生長。
[0058]一種產生金核霉素的金色鏈霉菌蘇州變種可獲自中國微生物菌種保藏管理委員會，編號 CGMCC N0.0122。
[0059]金核霉素生物合成基因的集合
[0060]本發明所述的金核霉素生物合成基因的集合(set)，表示由編碼AnmB蛋白的基因、編碼AnmC蛋白的基因、編碼AnmD蛋白的基因、編碼AnmE蛋白的基因構成的基因集合。
[0061]如本文所用，“本發明多肽”或“本發明蛋白”可互換使用，指金核霉素生物合成相關蛋白，包括AnmB蛋白、AnmC蛋白、AnmD蛋白和AnmE蛋白。
[0062]本領域普通技術人員不難知曉，在多肽的某些區域(如非必要區域)改變(添加、缺失或取代)少數氨基酸殘基基本上不會改變生物活性，例如適當替換氨基酸得到的序列并不會影響其活性(可參見Watson等，Molecular Biology of The Gene,第四版，1987,The Benjamin/Cummings Pub.C0.P224)。因此,就本領域普通技術人員而言,能夠實施這種替換或改變并且仍獲得具有所需生物活性的多肽。
[0063]因此，所述的AnmB蛋白包括選自下組的多肽:(a)氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示的多肽；或(b)包含(a)所限定的序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；所述的AnmC蛋白包括選自下組的多肽:(a)氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示的多肽；或(b)包含(a)所限定的序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；所述的AnmD蛋白包括選自下組的多肽:(a)氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示的多肽；或(b)包含(a)所限定的序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；所述的AnmE蛋白包括選自下組的多肽:(a)氨基酸序列如SEQ IDN0:6所示的多肽；或
(b)包含(a)所限定的序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽。其中，一個或多個包括1-50個，較佳地1-20，更佳地1-10個，最佳地1-5個。
[0064]在本發明中，本發明的“多肽”包括與氨基酸序列如SEQ ID N0:3_6所示的多肽相t匕，有至多20個，較佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異的多肽可根據，例如下表所示進行氨基酸替換而產生。
[0065]
【權利要求】
1.一種金核霉素生物合成基因的集合，其特征在于，所述基因集合由編碼AnmB蛋白的基因、編碼AnmC蛋白的基因、編碼AnmD蛋白的基因、和編碼AnmE蛋白的基因構成。
2.如權利要求1所述的基因的集合，其特征在于， 所述的AnmB蛋白包括選自下組的多肽: (a)氨基酸序列如SEQID N0:3所示的多肽；或 (b)包含(a)所限定的序列經過一個或多個(較佳地1-10個，更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽； 所述的AnmC蛋白包括選自下組的多肽: (a)氨基酸序列如SEQID NO:4所示的多肽；或 (b)包含(a)所限定的序列經過一個或多個(較佳地1-10個，更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽； 所述的AnmD蛋白包括選自下組的多肽: (a)氨基酸序列如SEQID NO:5所示的多肽；或 (b)包含(a)所限定的序列經過一個或多個(較佳地1-10個，更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；和 所述的AnmE蛋白包括選自下組的多肽: (a)氨基酸序列如SEQID NO:6所示的多肽；或 (b)包含(a)所限定的序列經過一個或多個(較佳地1-10個，更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽。
3.一種金核霉素生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇包括金核霉素生物合成涉及的4個基因，所述基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第5294-10434位堿基所示，具體為: 1)基因anmB，其核苷酸序列如SEQID NO:1的第5294-6964位堿基所示，編碼的蛋白為腺苷高半胱氨酸水解酶，長度為556個氨基酸； 2)基因anmC，其核苷酸序列如SEQID NO:1的第6957-8057位堿基所示，編碼的蛋白為脫氫酶，長度為366個氨基酸； 3)基因anmD，其核苷酸序列如SEQID NO:1的第8054-9172位堿基所示，編碼的蛋白為氧化還原酶，長度為372個氨基酸；和 4)基因anmE，其核苷酸序列如SEQID NO:1的第9169-10434位堿基所示，編碼的蛋白為radical SAM相關蛋白，長度為421個氨基酸。
4.如權利要求3所述的金核霉素生物合成基因簇所編碼的編碼蛋白。
5.如權利要求4所述的編碼蛋白，其特征在于,所述的編碼蛋白為AnmB蛋白、AnmC蛋白、AnmD蛋白和AnmE蛋白，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO:3-6所示。
6.如權利要求1或2所述的金核霉素生物合成基因的集合，或權利要求3所述的金核霉素生物合成基因簇，或權利要求4或5所述的編碼蛋白的用途，其特征在于，用于合成抗生素金核霉素、 金核霉素的藥學上可接受的鹽及類似物。
7.一種載體，其特征在于，所述載體含有權利要求1或2所述的金核霉素生物合成基因的集合，或含有權利要求3所述的金核霉素生物合成基因簇。
8.—種重組的宿主細胞，其特征在于，含有權利要求7所述的載體或染色體上整合有單拷貝或多拷貝的外源的權利要求1或2所述的金核霉素生物合成基因的集合，或單拷貝或多拷貝的權利要求3所述的金核霉素生物合成基因簇。
9.一種產生金核霉素的方法，其特征在于，包括步驟:培養權利要求8所述的宿主細胞，從而表達金核霉素；以及從培養體系中分離金核霉素。
10.一種金色鏈霉菌，其特征在于，所述金色鏈霉菌是金色鏈霉菌蘇州變種(CGMCCN0.0122)的突變株，所述突變株中金核霉素生物合成基因簇中的一個或多個基因失活，從而不產生金核霉素。
【文檔編號】C12N15/55GK103540603SQ201210236348
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月9日 優先權日:2012年7月9日
【發明者】唐功利, 李瑋濤, 潘海學, 蹇曉紅 申請人:中國科學院上海有機化學研究所