專利名稱：一種野菊花有效部位及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種野菊花抗乙肝病毒和肝保護作用有效部位，同時涉及該有效部位的應用，屬于生物醫藥技術領域。
背景技術：
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)持續復制而引起的一種傳染性肝臟疾病，是目前傳染性最強、發病率最高、危害最大的一種病毒性疾病。我國為“乙肝”大國，乙肝攜帶者超過I. 2億人，由乙肝導致的肝硬化、肝癌的病死率在我國位居第五位，被稱為“沉默的殺手”，但至今國內外對乙型肝炎仍缺乏有效的控制手段和徹底的解決方案，也無特效藥，因此對有效治療乙肝藥的研制和開發，有著重大的社會意義和現實意義。中藥因其對多種病毒性疾病整體效果明顯、抗病毒作用機制多樣、且不容易產生耐藥性而成為國際關注的焦點和熱點。野菊花為菊科(Compositae,Asteraceae)菊屬(Dendranthema)多年生草本植物野菊(Chrysanthemum indicum L.)、北野菊(Chrysanthemum boreale Mak.)或巖香菊(Chrysanthemum lavandulaefolium(Fisch. )Mak.)的頭狀花序。歷代醫家認為野菊花“入肝經”，具有“清熱解毒、疏肝明目”的作用，臨床運用廣泛，特別多用于治療各種炎癥、病毒性疾病、心血管疾病等，包括慢性咽炎、前列腺炎、盆腔炎、傳染性軟疣、病毒性肝炎、高血壓等。國內外學者發現其粗提物具有抗菌消炎解熱、抗病毒、降血壓、免疫調節、抗氧化等多種藥理作用。而我們通過研究發現野菊花的醇提物具有較顯著的抑制乙肝病毒的作用，并通過優化提取工藝研究，得到一個具有抗乙肝病毒和肝保護作用的活性部位，目前國內外尚未見有報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種野菊花有效部位，具有抗乙肝病毒和肝保護的作用。本發明的另一目的在于提供一種野菊花有效部位在制備抗乙肝病毒藥物中的應用和在制備護肝組合物中的應用。為了實現以上目的，本發明野菊花有效部位所采用的技術方案是采用如下步驟的方法提取而成的野菊花有效部位I)取野菊花，加入5 10倍重量的60 90%乙醇提取，提取液過濾后將濾液濃縮
至浸膏；2)將浸膏加水制成混懸液，加入萃取液進行萃取，回收萃取液得到野菊花有效部位，其中萃取液采用石油醚、乙酸乙酯、乙醇中的兩種或三種，萃取過程中石油醚、乙酸乙酯、乙醇用量的體積比為40 10 :5 I :1 O。步驟I)所述乙醇提取前對野菊花進行物理破碎。步驟I)所述提取次數為三次，所述提取液為三次提取的合并液。步驟2)所述萃取的次數為三次以上。
通過實驗證明，本發明的野菊花有效部位具有抗乙肝病毒和肝保護的作用。活性部位主要包括倍半萜類和黃酮類化合物。其中，總倍半萜含量> 45%，總黃酮含量> 35%，蒙花苷彡0. 65%，木犀草素彡0. 55%，豚草素A (cumambrinA)彡2. 90%，芹菜素彡0. 50%，刺槐素> 0. 10%,當歸酸膝草素 B (angeIoylcumambrinB) ^ 0. 50%。本發明利用IfepG2. 2. 15細胞作為平臺，研究了本發明野菊花有效部位(CIC)的體外抗HBV作用。采用MTT法檢測細胞毒性并計算得TC50 ;采用ELISA法檢測對細胞上清液中HBsAg、HBeAg表達的影響。結果表明本發明的野菊花有效部位對乙肝病毒具有較為明顯的抑制作用。本發明通過實驗證實了本發明的野菊花有效部位，可以抑制肝損傷的肝臟血清中AST、ALT指標，降低肝損傷的肝臟血清中TNF含量、肝臟指數和MDA含量，具有很好的肝保護作用。
本發明還提供了野菊花有效部位的兩種應用，其一為野菊花有效部位在制備抗乙肝病毒藥物中的應用，其二為野菊花有效部位在制備肝保護組合物中的應用。本發明的野菊花有效部位可以作為活性成分，制備成具有抗乙肝病毒的藥物，或者具有護肝作用的組合物，如食品、飲料、保健品、藥物等，涉及藥物的可以采用片劑、膠囊、散劑、注射劑等醫學上可接受的任何劑型。
具體實施例方式實施例I本發明的野菊花有效部位采用如下步驟提取而成I)取野菊花，加入5倍重量的90%乙醇提取三次，合并提取液，過濾后將濾液濃縮
至浸膏；2)取浸膏加水制成混懸液，加入萃取液進行萃取三次，萃取液采用石油醚-乙酸乙酯，其體積比40 :1，三次萃取后合并進行減壓回收溶劑，即得到有效部位。實施例2本發明的野菊花有效部位采用如下步驟提取而成I)取野菊花，加入8倍重量的75%乙醇提取三次，合并提取液，過濾后將濾液濃縮
至浸膏；2)取浸膏加水制成混懸液，加入萃取液進行萃取三次，萃取液采用石油醚-乙酸乙酯-乙醇，其體積比30 3 :0. 5，三次萃取后合并進行減壓回收溶劑，即得到有效部位。實施例3本發明的野菊花有效部位采用如下步驟提取而成I)取野菊花，加入10倍重量的60%乙醇提取三次，合并提取液，過濾后將濾液濃縮
至浸膏；2)取浸膏加水制成混懸液，加入萃取液進行萃取五次，萃取液采用石油醚-乙酸乙酯-乙醇，其體積比10 5 :1，五次萃取后合并進行減壓回收溶劑，即得到有效部位。實驗例(I)抗乙肝病毒作用實驗方法利用H印G2. 2. 15細胞作為平臺，研究了有效部位(CIC)的體外抗HBV作用。采用MTT法檢測細胞毒性并計算得TC50 ;采用ELISA法檢測對細胞上清液中HBsAg、HBeAg表達的影響。結果活性部位對乙肝病毒具有較為明顯的抑制作用(有效低毒)，并具有量效關系。表I為9天HBsAg表達結果，表2為9天HBeAg表達結果實驗結果有效性的判斷及說明
TC50:表示半數致死濃度，單位yg/mlIC50:表示抑制抗原半數有效濃度,單位y g/mlTI:表示治療指數，計算公式為TC50/IC50TKl. 0 :有毒無效I. 0彡TI彡2. 0 :低毒有效2. 0<TI<10. 0 :有效低毒TI彡10.0:高效低毒表19天HBsAg表達結果實施例丨實施例2實施例3 ^wiI—^ClC^ 濃度 CU 濃度 CIC
M g/m I 抑制書 (J g/ml 抑制率 p r/iu I 抑制率
50.0 0.960 30 0. K22 20.0 0. 82------
TC5058.31
^IC5019. 55
TI I_2^98_表29天HBeAg表達結果
實施例j實施例2 I實施例3
^H—I—cnc mi—I—cic — —mi^ cic
M g/ml 抑制率 P g/ni _制率 p g/ml 抑制率50~0 0.991 30 0.881 200 0. 710TC50 I58.31
IC5019.40
TI3. OJ(2)肝保護作用利用刀豆球蛋白A (Con - A)引起小鼠免疫性肝損傷試驗，研究了有效部位(CIC部位)對肝損傷的保肝降酶作用。研究表明有效部位部位對肝臟血清中的ALT、AST、IFN、TNF、肝臟指數、肝組織MDA的影響不同，病理切片表明有效部位能較好地幫助肝損傷恢復。結果見表3、4、5、6。
有效部位配制稱取實施例I 3提取的有效部位適量，用丙二醇和1%羧甲基纖維素鈉溶解。有效部位組劑量范圍5 45%，具體的實施例I為5%，實施例2為25%，實施例3為 45%。模型建立方法實驗動物模型采用Balb/c小鼠iv. ConA造免疫性肝損傷模型,檢測小鼠血清中AST、ALT水平，細胞因子IFN- y ,TNF- a以及肝組織中的MDA含量，檢測指標均明顯升高，觀察肝臟病理切片，肝細胞有空泡變性和壞死，呈彌散性分布，有炎性細胞浸潤，且細胞排列紊亂，造模成功。 試驗方法小鼠灌胃給藥，連續7天，首日上下午和次日下午各給藥I次，其余均每天一次。末次給藥后，禁食不禁水4h，每只小鼠以20mg/kg劑量尾靜脈注射ConA (空白組注射PBS)，禁食不禁水12h，以造免疫性肝損傷模型。
小鼠摘眼球采血，分離血清待測，保存于_20°C冰箱。小鼠脫頸處死，立即解剖，取肝臟稱重，選取病變部位，于4%甲醛中固定，制備肝組織切片，剩余部分保存于_20°C冰箱，用于肝組織MDA含量檢測。各生化指標檢測均按試劑盒使用說明進行，肝組織制作病理切片觀察。表3不同藥物劑量對免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響
權利要求
1.一種野菊花有效部位，其特征在于采用如下步驟的方法提取而成 1)取野菊花，加入5 10倍重量的60 90%乙醇提取，提取液過濾后將濾液濃縮至浸膏； 2)將浸膏加水制成混懸液，加入萃取液進行萃取，回收萃取液得到野菊花有效部位，其中萃取液采用石油醚、乙酸乙酯、乙醇中的兩種或三種，萃取過程中石油醚、乙酸乙酯、乙醇用量的體積比為40 10 :5 I :1 O。
2.根據權利要求I所述的野菊花有效部位，其特征在于步驟I)所述提取次數為三次，所述提取液為三次提取的合并液。
3.根據權利要求I所述的野菊花有效部位，其特征在于步驟2)所述萃取的次數為三次以上。
4.一種如權利要求I所述野菊花有效部位在制備抗乙肝病毒藥物中的應用。
5.一種如權利要求I所述野菊花有效部位在制備護肝作用的組合物中的應用。
6.根據權利要求5所述應用，其特征在于所述護肝為抑制肝損傷的肝臟血清中ALT或AST的增高。
7.根據權利要求5所述應用，其特征在于所述護肝為降低肝損傷的肝臟血清中TNF含量。
8.根據權利要求5所述應用，其特征在于所述護肝為降低肝損傷的肝臟血清中肝臟指數或MDA含量。
9.根據權利要求5-8任一項所述應用，其特征在于所述組合物為食品、保健品、藥物或飲料。
全文摘要
本發明公開了一種野菊花有效部位，采用如下步驟的方法提取而成1)取野菊花，加入5～10倍重量的60～90%乙醇提取，提取液過濾后將濾液濃縮至浸膏；2)將浸膏加水制成混懸液，加入萃取液進行萃取，回收萃取液得到野菊花有效部位。本發明通過實驗證實了本發明的野菊花有效部位，可以對乙肝病毒具有較為明顯的抑制作用，也可以抑制肝損傷的肝臟血清中AST、ALT指標，降低肝損傷的肝臟血清中TNF含量、肝臟指數和MDA含量，具有很好的護肝作用。本發明的野菊花有效部位可以作為活性成分，制備成具有抗乙肝病毒的藥物，或者具有護肝作用的組合物，如食品、飲料、保健品、藥物等，涉及藥物的可以采用片劑、膠囊、散劑、注射劑等醫學上可接受的任何劑型。
文檔編號A23L2/38GK102743424SQ20121023862
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月10日 優先權日2012年7月10日
發明者李娟 , 畢躍峰, 江金花, 王亞峰, 王慶端, 王振基, 符玲 申請人:鄭州大學