專利名稱：微小rna用于調控pten基因表達的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術和醫學技術領域，具體地說，本發明涉及基因表達調控技術領域，特別涉及微小RNA用于調控PTEN基因表達。
背景技術：
基因于1997年被發現，是一種具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因(Li J, YenC， Liaw Dj et al. PTENj a putative protein tyrosine phosphatase gene mutatedin human brain, breast, and prostate cancer. Science 1997，275 (5308):1943-7)，通過負性調控PI3K/Akt通路，調節細胞生長和增殖(Wu H，Goel V，Haluska FG. PTENsignaling pathways in melanoma. Oncogene 2003，22 (20) :3113-22)。研究發現，在多種腫瘤中PTEN基因有不同程度的突變或丟失，如結直腸癌、前列腺癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌及黑色素瘤等。PTEN分子表達缺失與結直腸癌的肝轉移以及患者的生存率顯著相關 (Sawai H， Yasuda A, Ochi N， et al. Loss of PTEN expression is associated withcolorectal cancer liver metastasis and poor patient survival. BMC Gastroenterol2008,8:56)。因此，調控PI3K/PTEN/AKT信號通路將成為一種潛在的抗腫瘤治療途徑(Zhang Jj Roberts TM， Shivdasani RA. Targeting PI3K signaling as a therapeuticapproach for colorectal cancer. Gastroenterology 2011，141(I) :50_61)o是近年來發現于真核細胞中的一類長約22個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，可通過與靶mRNA的3’ -UTR互補結合在轉錄后水平使其降解，或者與之不完全互補結合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而在基因表達中發揮重要的調節作用。越來越多的研究證實，miRNA在腫瘤組織中表達異常，與腫瘤發生發展及患者治療反應密切相關；如hsa-miR-21在結直腸癌組織中表達上調，與結直腸癌 M分期及患者預后密切相關(SchetterAJj Leung SYj Sohn JJj et al. MicroRNA expression profiles associated withprognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma. JAMA 2008， 299(4):425-36)。近期研究還發現，hsa-miR-21能抑制PTEN基因在人肝癌組織中的表達(MengF， Henson Rj Wehbe-Janek H， et al. MicroRNA-21 regulates expression of thePTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer. Gastroenterology2007，133(2) :647-58)。這種在腫瘤組織中表達異常的miRNA有的已被證實具有顯著的抗腫瘤活性(Thorsen SB，et al. The Therapeutic Potential of MicroRNAs inCancer. Cancer J 2012，18 (3) : 275-84)，如 miR-145 和 miR_33a 能抑制 HCT-116 結直腸癌細胞移植瘤的生長(Ibrahim AF，et al. MicroRNA replacement therapy formiR-145 and miR_33a is efficacious in a model of colon carcinoma. Cancer Res2011,71:5214-5224)。另外，miR-122由于能調控丙型肝炎病毒RNA的豐度，其互補序列用于治療丙型肝炎病毒感染患者已經進入II期臨床試驗Janssen HLj ReesinkHWjZeuzem S， et al. A randomized, double-blind, placebo (plb) controlled safetyand anti-viral proof of concept study of miravirsen (MIR), an oligonucleotidetargeting miR-122, in treatment naBve patients with genotype I (gtl) chronicHCV infection. Hepatology. 2011:1430A.,顯不出miRNA作為一種極其重要的基因表達調控因子和作用靶標，具有潛在的治療作用和實際應用價值。雖然本領域中已知某些微小RNA與腫瘤具有一定的相關性，但本領域中已知的miRNA種類繁多，功能各異，要從中篩選出與腫瘤相關且可作為發病、治療方案的選擇及預后的特定miRNA存在較大難度。目前，本領域中尚無miR-130b和PTEN基因相關性的報道。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種微小RNA對PTEN基因表達的調控，特別是miR-130b用于調控PTEN基因表達。本發明的目的是通過以下方式實現的一種微小RNA用于調控PTEN基因表達，其特征在于，所述的微小RNA為包含以下序列的核酸或者功能片段或變體 5’ -cagugcaaugaugaaagggcau-3 優選地，所述微小RNA能與PTEN基因3’ -UTR結合，抑制PTEN基因表達。優選地，所述微小RNA為miR_130b。優選地，所述微小RNA通過化學合成得到。優選地，所述微小RNA來自生物體樣本，包括組織、細胞和外周血。本發明微小RNA的獲取來源可以是來自化學合成和/或存在該基因序列的細胞、組織，組織可以選自外周血、體液、腔道的脫落物、病變組織，以及用這些組織制成的石蠟塊、石蠟切片。在本文中，術語“樣本”指的是潛在可能含有微小RNAmiR_130b的離體循環血樣品，優選是來自人的樣品。盡管用抽提出血總RNA的純化樣品也能夠在本發明中使用，但是，本發明的樣品優選是未經提純的、含有血總RNA的裂解液體樣品。本領域技術人員知曉將固體的有核血細胞裂解或抽提、純化并保持其中miRNA成分不被降解的細胞分子生物學技術。本發明的樣品可以是經過處理的樣品，如稀釋處理、血細胞裂解處理以及PCR擴增等，也可以是未經處理的樣品。經過處理的樣品可以進一步純化，以富集miRNA。在本文中，術語“miR_130b”指的是指的是包含序列“cagugcaaugaugaaagggcau”或其同源序列的微小RNA。本領域中已知各種來源的miR-130b，例如人、黑猩猩、馬、雞等，這些同源序列均包含在本發明的術語“miR-130b”中。本發明的術語中還包含上述天然存在的miR-130b序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸，或經過生物化學修飾，且仍然具有生物學活性的衍生RNA。本發明人采用實時熒光定量PCR技術測定了 6例結直腸癌組織和癌旁組織中miRNA的表達；統計分析發現，hsa-miR-130b在結直腸癌組織中的表達顯著高于正常組織，結果如圖I所示。本發明人采用生物信息學軟件miRanda和TargetScan聯合預測發現，hsa-miR-130b可能與PTEN基因3’-UTR結合，結果如圖2所示。隨后，本發明人采用體外生物學功能實驗證實，hsa-miR-130b可與PTEN基因3’ -UTR結合，從而抑制PTEN分子表達，可通過調控PTEN信號通路和/或miR-130b表達及功能以發揮抗腫瘤作用。


下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述圖I為結直腸癌組織中和正常組織miR-130b表達量測定結果；
圖2 A為miRanda軟件預測結果；圖2 B為TargetScan軟件預測結果；
圖3 PTEN基因3’ -UTR的PCR擴增結果；
圖4 PTEN/3’ -UTR/pGEM-T重組載體酶切驗證結果；
圖5 PTEN/3’ -UTR/pGEM-T重組載體測序驗證結果；
圖6 PTEN/3’ -UTR/ pGL-3重組載體酶切驗證結果；
圖7 PTEN/3’ -UTR/ pGL-3重組載體測序驗證結果；圖8 hsa-miR-130b對PTEN/3’ -UTR/pGL-3重組載體表達活性的抑制作用。
具體實施例方式以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用于說明本發明而不限制本發明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據具體廠家的條件做進一步調整，未注明的實施條件通常為常規實驗中的條件。一、試劑與材料 I、試劑
胎牛血清(Hyclone，美國)；完全培養基每升RPMI1640 (Hyclone，美國)中，添加胎牛血清100ml、L-谷氨酰胺O. 15g、2-巰基乙醇10.0 ml (5X l(T3mol/L);脂質體2000(Invitrogen,美國);青霉素、鏈霉素(上海生工生物技術有限公司);TRIzol (Invitrogen,美國);瓊脂糖(LP0028A，Oxoid Ltd,英國);凝膠電泳加樣液和溴化乙錠(EtBr)(上海生工生物技術有限公司);膠回收DNA試劑盒和質粒抽提試劑盒(Axygen,美國);鹿糖、Triton-100、MgCl2*6H20、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、鹽酸、EDTA、NaCl、苯酚、氯仿、異戊醇、十二烷基磺酸鈉(SDS)和無水乙醇等實驗所用試劑均為分析純或優級純；雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega,美國)。hsa_miR-130b及其實時突光定量試劑盒(上海吉瑪制藥技術有限公司)；Taq DNA聚合酶、M-MuLV反轉錄酶、油al限制性內切酶(MBI，美國);T4 DNA連接酶(Takara，日本)；PCR 引物(Invitrogen, PAGE 級)。pGEM-T、pGL_3、pRL-TK 載體(Promega,美國)。、組織樣本
收集6例結直腸癌患者的新鮮手術組織樣本，包括癌組織和遠端正常腸組織(離癌邊沿5cm)。所有患者經HE染色、病理診斷確認為結直腸癌；術前未接受化療或放療。、細胞株
中國倉鼠卵巢細胞株CHO (ATCC，美國);大腸桿菌TPlO (Novagen，美國)。細胞株經檢測，無支原體污染。、儀器
CO2培養箱、低溫高速離心機、常速離心機(Thermo,德國)；倒置顯微鏡(Olympus,日本)；微弱發光測量儀(BPCL-K，中科院生物物理研究所)；PCR儀(S1000，Bio-Rad，美國)；電泳儀(Bio-Rad,美國)；微量定量分光光度計(Alpha Innotech,美國)；凝膠成像系統(GeneGenius, SYNGENE,英國)。二、實驗方法 I、細胞培養
采用含10% FCS的RPMI 1640培養基進行培養，培養液中含有100kU/L青霉素、IOOmg/L鏈霉素，培養條件為37° C、5% CO2、飽和濕度。CHO細胞株貼壁生長，傳代時用O. 25%胰酶消化。間隔2-3天更換新鮮培養基。、實時熒光定量分析hsa-miR_20b表達量
采用Trizol試劑按照使用說明書從6對結直腸癌和正常組織樣本中提取總RNA。實時熒光定量PCR試劑盒測定RNA樣本中hsa-miR-130b的表達量；以U6 RNA為內對照。取5μΜ RT引物工作液 μ ，加入79μ RNsae-free水，配置成62. 5nM RT引物工作液。50μ RT反應體系，加入2μ RNA樣品，引物工作液各4μ ，加RNsae-free水至19μ 。以上體系混勻后，瞬時離心，70° C放置lOmin，冰育2min，再加入以下試劑進行RT反應1XRT buffer,Iμ dNTP(10mM),40U RNase inhibitor, 200U RT 酶，加 RNsae-free 水至 50μ 。RT 反應程序42° C 60min，70° C IOmin0 RT反應結束后立即將cDNA產物取出，快速置冰上冷卻，后續所有步驟都在冰上進行。接著進行qRT-PCR反應定量測定hsa-miR_130b表達量，20μ 反應體系10μ SYBR Green Μ χ,2μ RT反應產物，Bulge-Loop miR_130b正向引物和反 向引物(5μΜ)各2μ ，加RNsae-free水至20μ 。反應程序95° C預變性20sec ;接著進行40 個循環(95。C 變性 10sec;60。C 退火 20sec;70。C 延伸 5sec)。、miRNA作用靶位點的預測
米用生物信息學軟件 miRanda (www.microRNA.org)和 TargetScan (http://www.targetscan. org/)預測可能與 PTEN 基因 3’ -UTR 結合的 miRNA。、構建含PTEN基因3’-UTR片段的熒光素酶表達載體
采用Trizol試劑按照使用說明書從MDA-MB-435細胞中提取總RNA，以Oligo (dT)為逆轉錄引物，用M-MuLV反轉錄酶將RNA反轉錄為cDNA。μ L PCR反應體系中含有2 μ L cDNA模板，I. 25U Taq DNA聚合酶，I X緩沖液，O. 2mmol/L dNTPs，O. 4Mmol/L 正向引物 5’ -GC TCT AGA TGA CAC CAC TGA CTC TGA TC-3’ 和反向引物5’ -GC TCT AGA CGC AAA CAA CAA GCA GTG AC-3’(下劃線堿基為內切酶油al識別序列)。熱循環條件為94° C預變性5min ;然后以94° C變性20sec，60° C退火30seC，72° C延伸lmin，擴增35個循環；最后72° C延伸7min使反應完全。反應完成后，取反應產物3PL在I. 5%瓊脂糖凝膠上進行電泳(I XTAE電泳緩沖液，電壓200V，恒壓電泳5min)，凝膠成像系統拍攝電泳圖譜。擴增成功的產物采用Sanger’ s測序法測定DNA序列(Invitrogen);另取30μ 反應產物在2. 0%瓊脂糖凝膠上進行電泳(I XTAE電泳緩沖液，電壓100V，恒壓電泳lOmin)，然后采用膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段，并用微量紫外分光光度計測定其濃度。參考產品說明書，將純化的PTEN基因3’ -UTR片段克隆到pGEM_T載體；熱轉化大腸桿菌TPlO感受態細胞，進行藍白斑篩選。挑取白斑搖菌，抽提質粒；PCR擴增及酶切鑒定后再進行測序驗證。將測序正確的重組子用油al酶切后，回收3’ -UTR片段。用PGL-3和pRL-TK載體質粒轉化常規制備的大腸桿菌TPlO感受態細胞，進行大量擴增；試劑盒抽提法大量制備PGL-3和pRL-TK質粒，電泳檢測質粒的純度和含量。用限制性內切酶對提取的PGL-3質粒進行酶切，試劑盒直接回收大片段的酶切產物。參考產品說明書，將酶切回收純化后的PTEN基因3 ’ -UTR片段按適當比例與pGL-3載體的Xba I酶切片段進行連接反應，16° C酶連過夜。取10 μ L連接產物直接轉化100 μ L大腸桿菌TPlO感受態細胞。經過含有氨芐青霉素的LB平板固體培養基中選擇培養。從轉化子的平板上隨機挑取10個菌落，經過含氨芐青霉素的LB液體培養基擴增培養；經PCR擴增、酶切和測序鑒定后，用試劑盒抽提質粒備用。、細胞轉染
首先，將培養于含有10% FCS、100kU/L青霉素、100mg/L鏈霉素的RPMI1640完全培養基中細胞株，按I X IO4個細胞/孔的量在24孔板中接種指數生長期的細胞，培養過夜，直到細胞80%匯片。然后，將一定量的hsa-miR_130b、PTEN/3 ' _UTR/pGL3重組質粒和內參質粒pRL-TK稀釋至50 μ L不含血清和抗生素的0pti-MEM I培養基中，用移液槍混合均勻；然后將I μ L脂質體2000懸液加入50 μ L不含血清和抗生素的Opti-MEMsI培養基中，在室溫孵育5min ;最后將兩者混合在一起，充分混勻，靜置20min，使hsa-miR-130b、重組質粒和內參質粒與脂質體充分結合。將只加脂質體的孔作為陰性對照。最后，吸去接種到24孔板中的培養液，用不含血清和抗生素的0pti-MEM I培養基 洗一次，在每個孔中加入100 μ L上述混合物，培養3h ;吸棄培養板中的轉染培養液，向各孔加入100 μ L有血清無抗生素的Opti-MEMsI培養基，繼續培養24h后進行檢測。、雙熒光素酶報告系統基因活性測定
將轉染有PGL-3和pRL-TK的CHO細胞經過24h培養后收集，吸棄培養基，用PBS洗I次。加入裂解液20 μ L/孔，室溫搖動15 min0按照雙熒光素酶檢測試劑盒的操作說明書，取100 μ L突光素酶分析緩沖液II于I. 5ml離心管中，設定化學發光儀延遲2sec,發光儀測讀IOsec ;將全部細胞裂解液加入到離心管中，用移液槍輕輕抽吸2-3次混勻(不要旋渦振動)；將離心管放入化學發光儀中測讀螢火蟲熒光素酶發光值Fl ;將離心管移出發光儀，力口AlOOuL Stop&Glo試劑，快速旋渦混勻后，將離心管重放回發光儀中測讀海腎熒光素酶發光值F2。應用SPSS. 10統計軟件的卡方檢驗分析受試組與空白對照組的F1/F2比值差異，以判斷hsa-miR_130b的調控作用。三、結果
I.hsa-miR-130b在結直腸癌組織中的表達顯著高于正常組織采用實時熒光定量PCR技術測定了 6例結直腸癌組織和正常組織中miRNA的表達；統計分析發現，hsa-miR-130b在結直腸癌組織中的表達顯著高于正常組織，結果如圖I所示。與PTEN 基因 3’ -UTR 結合
我們采用生物信息學軟件miRanda和TargetScan聯合預測發現，hsa_miR-130b可能與PTEN基因3’ -UTR結合，結果如圖2所示。構建PTEN/3’ -UTR/pGL-3熒光素酶表達載體
PCR擴增得到長度為752bp的PTEN基因3’_UTR序列(圖3)，切膠純化回收后，將片段插入pGEM-T載體，轉化感受態大腸桿菌。隨機挑克隆擴增后提取質粒DNA。經過油a I酶切鑒定，證實酶切后得到的基因片段與預期大小740bp相符(圖4)。測序結果表明，插入pGEM-T載體的PTEN基因3’ -UTR片段序列正確，如圖5所示。抽提pGEM_T載體，酶切獲得PTEN基因3’ -UTR片段；將其插入pGL-3載體，然后轉化感受態大腸桿菌。酶切后得到的基因片段與預期大小740bp相符(圖6);測序結果證實插入序列正確(圖7)。、hsa-miR_130b抑制重組熒光素酶表達活性
將200ng重組PTEN/3’ -UTR/pGL-3熒光素酶表達載體、20ng內參質粒pRL-TK與IOpmolhsa-miR-130b共同轉染CHO細胞后，采用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測轉染培養后CHO細胞中熒光素酶的活性。結果顯示，在CHO細胞中加入hsa-miR-130b后，熒光素酶的活性比值(pGL-3/pRL-TK)顯著低于不加hsa_miR-130b的細胞(圖8)。由此表明，hsa_miR-130b通過與PTEN基因3’ -UTR上靶序列結合，抑制了熒光素酶的表達。上述實例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人是 能夠了解本發明的內容并據以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍。凡根據本發明精神實質所做的等效變換或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.微小RNA用于調控PTEN基因表達，其特征在于，所述的微小RNA為包含以下序列的核酸或者功能片段或變體5’ -cagugcaaugaugaaagggcau-3’。
2.根據權利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA能與PTEN基因3’-UTR結合，抑制PTEN基因表達。
3.根據權利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA為miR-130b。
4.根據權利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA通過化學合成而得。
5.根據權利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA來自生物體樣本，包括組織、細胞和外周血。
全文摘要
本發明公開了一種微小RNA用于調控PTEN基因表達，所述的微小RNA為包含以下序列的核酸或者功能片段或變體:5’-cagugcaaugaugaaagggcau-3’。所述微小RNA為miR-130b。本發明人采用體外生物學功能實驗證實，hsa-miR-130b可與PTEN基因3’-UTR結合，從而抑制PTEN分子表達；可通過調控PTEN信號通路和/或miR-130b表達及功能以發揮抗腫瘤作用。
文檔編號C12N15/113GK102776194SQ20121025261
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月20日 優先權日2012年7月20日
發明者朱健潔, 汪維鵬, 陳蘭心 申請人:蘇州大學