一種用于新一代測(cè)序分析的多重目的dna片段富集方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種DNA測(cè)序模板的制備方法。該方法包括如下步驟：（1）將待測(cè)序的DNA分子依次進(jìn)行片段化、末端修復(fù)和補(bǔ)齊，3’端加A，以及連接接頭；（2）通過(guò)三輪半巢式PCR擴(kuò)增富集目的DNA片段；前兩次PCR所用引物均為一條特異性引物和一條通用引物；第三次PCR所用引物由兩條通用引物組成；前兩次PCR可為多重PCR反應(yīng)。與Illumina?GA樣品前處理過(guò)程相比，本發(fā)明所提供的方法減少了樣品處理的步驟，節(jié)約了時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本，同時(shí)降低了起始DNA樣品的需求量；最重要的是，循環(huán)數(shù)的降低和Phusion高保真DNA聚合酶的使用降低了由于PCR而引入的突變，使得對(duì)所得數(shù)據(jù)的處理變得相對(duì)簡(jiǎn)單清晰，同時(shí)本方法在應(yīng)用到各種重測(cè)序的實(shí)驗(yàn)中時(shí)對(duì)測(cè)序深度的要求也降低。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種用于新一代測(cè)序分析的多重目的DNA片段富集方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種DNA測(cè)序模板的制備方法，特別涉及一種用于新一代測(cè)序分析的目的DNA片段的富集方法。
【背景技術(shù)】
[0002]新一代測(cè)序技術(shù)(Next Generation Sequencing, NGS)是近年來(lái)新興的一系列測(cè)序技術(shù)的總稱(chēng)，他們都是基于邊合成邊測(cè)序(Sequencing by Synthesis)的原理,具有高通量、時(shí)間短、數(shù)據(jù)量龐大的特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因組(重)測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)開(kāi)發(fā)等等方面,成為人們研究分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等等的有力工具。
[0003]在多種新一代測(cè)序技術(shù)中，Illumina公司開(kāi)發(fā)的基因組分析儀(GenomeAnalyzer, GA)由于具有成本相對(duì)較低、通量大、前處理較為簡(jiǎn)單等等優(yōu)勢(shì),成為目前應(yīng)用的最為廣泛的技術(shù)之一。
[0004]Illumina GA的DNA樣品前處理過(guò)程主要包括:(I) DNA樣品的片段化；(2)修復(fù)并補(bǔ)齊末端，以及3’端加A (腺嘌呤脫氧核苷酸)；(3)連接接頭；(4)切膠純化；(5)使用Illumina公司提供的引物進(jìn)行18個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增；(6)切膠純化；(7)樣品質(zhì)量監(jiān)控(純度、濃度等)。隨后即可上機(jī)進(jìn)樣開(kāi)始測(cè)序。
[0005]Illumina GA的DNA樣品前處理方法不具有選擇性，因此，若只關(guān)注基因組(或轉(zhuǎn)錄組)中某一特定區(qū)域的序列，則需要在進(jìn)行Illumina GA樣品前處理之前完成選擇性富集的過(guò)程。目前通用的選擇性富集 方法有:
[0006]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR):通過(guò)使用特異性引物對(duì)目的片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。
[0007]水相雜交:如MIP (molecular inversion probe),通過(guò)帶有特異序列的探針與基因組樣品雜交后，連接成環(huán)并擴(kuò)增，獲得目的片段；或使用生物素標(biāo)記的RNA探針與基因組碎片雜交，而后通過(guò)磁珠吸附生物素進(jìn)而將特異序列與基因組碎片分離，而后進(jìn)行富集。
[0008]固相雜交:使用類(lèi)似于DNA微陣列(Microarray)處理的方法,在固相支持物上固定特異的探針序列來(lái)捕獲目的片段
[0009]上述二種方法都是在進(jìn)行Illumina GA樣品如處理之如完成的,其中水相雜交和固相雜交涉及的技術(shù)相對(duì)復(fù)雜，成本不菲(尤其是DNA微陣列的固相支持物的獲得需要大量合成的特異序列)，需要的起始基因組DNA用量很大，且在處理后仍需要對(duì)獲得的目的片段進(jìn)行富集(通常也是靠PCR)。而PCR雖然是一種具有良好選擇性并且技術(shù)要求較低的方法，但是其擴(kuò)增中會(huì)發(fā)生堿基的突變，雖然使用高保真的聚合酶能夠改善突變發(fā)生的頻率，但是隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，堿基突變的概率會(huì)愈加提高。由于Illmunia GA樣品前處理中有18個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，在Illumina GA樣品前處理之前的PCR反應(yīng)過(guò)程中引入的堿基突變會(huì)在隨后的Illumina GA的樣品前處理中被放大，并且測(cè)序得到的突變堿基的測(cè)序質(zhì)量與未突變堿基的測(cè)序質(zhì)量沒(méi)有顯著差異，無(wú)法分辨，這在檢測(cè)點(diǎn)突變(point mutation)或單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)的時(shí)候會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生很大干擾，造成過(guò)多的假陽(yáng)性結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一種DNA測(cè)序模板的制備方法，所述DNA測(cè)序模板適宜采用Illumina公司的GA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。 [0011]本發(fā)明所提供的DNA測(cè)序模板的制備方法，具體包括如下步驟:
[0012](I)將具有待測(cè)序位點(diǎn)的DNA樣品依次進(jìn)行片段化、末端修復(fù)和補(bǔ)齊，3’端加A，以及連接接頭，得到用于第一次PCR反應(yīng)的模板；
[0013]所述待測(cè)序位點(diǎn)的上游核苷酸序列為已知，且存在PCR特異引物對(duì)應(yīng)的特異區(qū)域；所述待測(cè)序位點(diǎn)可以為一個(gè)也可為多個(gè)。
[0014]所述接頭為由長(zhǎng)鏈和短鏈組成的一端是平末端另一端是5’粘性末端的雙鏈DNA，所述長(zhǎng)鏈的5’端突出；在實(shí)際應(yīng)用中，可通過(guò)化學(xué)合成得到組成所述接頭的所述長(zhǎng)鏈和所述短鏈，再自行變性退火后得到所述接頭。
[0015](2)用特異性引物Iros和通用引物I對(duì)步驟(1)得到的用于第一次PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，得到包含所述待測(cè)序位點(diǎn)的DNA片段；
[0016]所述特異性引物Iros與所述特異區(qū)域互補(bǔ)；所述通用引物I的序列含有選自步驟
(I)所述接頭中所述長(zhǎng)鏈的5’端突出部分的序列。當(dāng)對(duì)多個(gè)位點(diǎn)或區(qū)域進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)時(shí)，應(yīng)保持各引物的退火溫度一致，這將有利于多重PCR反應(yīng)的進(jìn)行。
[0017](3)用特異性引物2ros和通用引物2對(duì)步驟(2)得到的所述DNA片段進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到包含所述待測(cè)序位點(diǎn)的DNA片段；
[0018]所述特異性引物2ros自5’端至3’端分為片段I和片段2，所述片段2與所述特異區(qū)域互補(bǔ)，且所述特異性引物2ros自3’端起第一個(gè)核苷酸與所述待測(cè)序位點(diǎn)之間的距離比所述特異性引物Iros自3’端起第一個(gè)核苷酸與所述待測(cè)序位點(diǎn)之間的距離更近；所述片段I與所述待測(cè)序位點(diǎn)的上游不互補(bǔ)；所述通用引物2的序列為選自步驟(1)所述接頭中所述長(zhǎng)鏈的5’端突出部分的序列。當(dāng)對(duì)多個(gè)位點(diǎn)或區(qū)域進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)時(shí)，應(yīng)保持各引物的退火溫度一致，這將有利于多重PCR反應(yīng)的進(jìn)行。
[0019](4)用通用引物3和通用引物4對(duì)步驟(3)得到的所述DNA片段進(jìn)行第三次PCR擴(kuò)增，得到DNA測(cè)序模板；
[0020]所述通用引物3的自5’端至3’端分為片段3和片段4，所述片段4為選自步驟
(3)所述片段1，所述片段3為如下a):
[0021]a) AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCC (固相支持物結(jié)合區(qū)域)
[0022]所述通用引物4自5’端至3’端分為片段5和片段6，所述片段6選自步驟(1)所述接頭中所述長(zhǎng)鏈的5’端突出部分的序列，所述片段5為如下b):
[0023]b) CAAGCAGAAGACGGCATA (固相支持物結(jié)合區(qū)域)。
[0024]經(jīng)過(guò)上述步驟的處理后，所得DNA測(cè)序模板還需經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)樣品純化處理、純度、濃度鑒定等步驟后可用于Illumina GA測(cè)序。
[0025]為了增加測(cè)序的準(zhǔn)確性，減少擴(kuò)增中隨機(jī)錯(cuò)配的出現(xiàn)，上述步驟中的三次PCR反應(yīng)均使用Phusion高保真聚合酶。
[0026]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述接頭中所述長(zhǎng)鏈的序列具體如序列表中序列1-10所示，所述接頭中所述短鏈的序列為如下中的任一種:
[0027]A)序列表中序列I的自3’端起倒數(shù)第9位-倒數(shù)第2位的反向互補(bǔ)序列；
[0028]B)序列表中序列2-序列10中任一個(gè)的自3’端起倒數(shù)第10位-倒數(shù)第2位的反向互補(bǔ)序列。[0029]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，用于所述第一次PCR反應(yīng)的所述通用引物I序列具體為序列表中序列11。
[0030]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，用于所述第二次PCR反應(yīng)的所述通用引物2序列具體為序列表中序列12。
[0031 ] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，用于所述第三次PCR反應(yīng)的所述通用引物3和所述通用引物4的序列具體分別為序列表中序列13和序列14。
[0032]通常情況下，上述步驟中所述第一次PCR反應(yīng)進(jìn)行10-15個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增；所述第二次PCR反應(yīng)進(jìn)行10-15個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增；所述第三次PCR反應(yīng)進(jìn)行15-18個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述第一次PCR反應(yīng)具體進(jìn)行了 15個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增；所述第二次PCR反應(yīng)進(jìn)行了 15個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增；所述第三次PCR反應(yīng)進(jìn)行了 18個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。
[0033]本發(fā)明針對(duì)Illumina GA樣品前處理的過(guò)程進(jìn)行改進(jìn)，得到了新的用于IlluminaGA測(cè)序的DNA測(cè)序模板的制備方法，該方法減少了樣品處理的步驟，節(jié)約了時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本，同時(shí)降低了對(duì)起始DNA樣品的需求量。最為重要的是，循環(huán)數(shù)的降低(相對(duì)于PCR擴(kuò)增與樣品制備過(guò)程分離的方法，本申請(qǐng)可降低10個(gè)以上的循環(huán)數(shù))和Phusion高保真DNA聚合酶的使用可以大大降低在樣品富集過(guò)程中由于PCR而引入的突變，使得對(duì)所得數(shù)據(jù)的處理變得相對(duì)簡(jiǎn)單清晰，使得本方法在應(yīng)用到各種重測(cè)序的實(shí)驗(yàn)中時(shí)對(duì)測(cè)序深度的要求大大降低。在此基礎(chǔ)上，我們引入了多重PCR (Multiplex Polymerase Chain Reaction)的方法，大大增加了樣品處理的效率。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1為三次PCR反應(yīng)過(guò)程示意圖。其中，A為第一次PCR反應(yīng)過(guò)程示意圖；B為第二次PCR反應(yīng)過(guò)程示意圖；C為第三次PCR反應(yīng)過(guò)程示意圖。
[0035]圖2為在瓊脂糖膠上檢測(cè)到的第三輪PCR產(chǎn)物。其中，泳道M代表1OObp ladder,泳道I和泳道2代表第三輪PCR的產(chǎn)物。
[0036]圖3為在瓊脂糖膠上檢測(cè)膠純化后的第三輪PCR產(chǎn)物。其中，泳道M代表lOObpladder，泳道I代表膠純化后的第三輪PCR的產(chǎn)物。
[0037]圖4為兩種聚合酶獲得的可用產(chǎn)物數(shù)量的比較圖。其中，PMP為使用Phusion高保真聚合酶；PMM為使用Multiplex多重聚合酶。
[0038]圖5為兩種聚合酶不同引物個(gè)數(shù)所得平均深度分析圖。其中，PMP為使用Phusion高保真聚合酶；PMM為使用Multiplex多重聚合酶；PM后的數(shù)值表示引物個(gè)數(shù)。
[0039]圖6為兩種聚合酶不同引物個(gè)數(shù)所得數(shù)據(jù)的利用率比較圖。其中，PM后的數(shù)值表示引物個(gè)數(shù)。縱坐標(biāo)表示數(shù)據(jù)的利用率。其中，I表示Multiplex多重聚合酶(PMM)，2表示Phusion高保真聚合酶(PMP)。
[0040]圖7為index03的堿基C變化為堿基T的頻率圖。其中，橫坐標(biāo)為各個(gè)堿基在0SC8基因上的位置坐標(biāo)，縱坐標(biāo)為發(fā)生C到T的變化的堿基個(gè)數(shù)與該位置堿基測(cè)序深度的比值(即堿基變化頻率)。圖中圓圈圈出的點(diǎn)為經(jīng)過(guò)其它實(shí)驗(yàn)及sanger法測(cè)序所驗(yàn)證的已知陽(yáng)性點(diǎn)。
[0041]圖8為所有數(shù)據(jù)中某位置上C到T堿基變化的個(gè)數(shù)和該位置的測(cè)序深度的關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0043]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0044]實(shí)施例1、用于Illumina公司GA測(cè)序的測(cè)序模板的制備及其測(cè)序
[0045]一、用于Illumina公司GA測(cè)序的測(cè)序模板的制備方法
[0046]在本實(shí)施例中，用于Illumina公司GA測(cè)序的測(cè)序模板的制備方法具體包括如下步驟:
[0047](I)將具有待測(cè)序位點(diǎn)的DNA樣品依次進(jìn)行片段化、末端修復(fù)和補(bǔ)齊，3’端加A，以及連接接頭，得到用于第一次PCR反應(yīng)的模板；
[0048]所述待測(cè)序位點(diǎn)的上游核苷酸序列已知，且存在PCR特異引物對(duì)應(yīng)的特異區(qū)域；
[0049]所述接頭為由長(zhǎng)鏈和短鏈組成的一端是平末端另一端是5’粘性末端的雙鏈DNA，所述長(zhǎng)鏈的5’端突出；
[0050](2)用特異性引物·Iros和通用引物I對(duì)步驟(1)得到的用于第一次PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，得到包含所述待測(cè)序位點(diǎn)的DNA片段；
[0051]所述特異性引物Iros與所述特異區(qū)域互補(bǔ)；所述通用引物I的序列含有選自步驟
(I)所述接頭中所述長(zhǎng)鏈的5’端突出部分的序列；
[0052](3)用特異性引物2ros和通用引物2對(duì)步驟(2)得到的所述DNA片段進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到包含所述待測(cè)序位點(diǎn)的DNA片段；
[0053]所述特異性引物2ros自5’端至3’端分為片段I和片段2，所述片段2與所述特異區(qū)域互補(bǔ)，且所述特異性引物2ros自3’端起第一個(gè)核苷酸與所述待測(cè)序位點(diǎn)之間的距離比所述特異性引物2ros自3’端起第一個(gè)核苷酸與所述待測(cè)序位點(diǎn)之間的距離更近；所述片段I與所述待測(cè)序位點(diǎn)的上游不互補(bǔ)；所述通用引物2的序列選自步驟(1)所述接頭中所述長(zhǎng)鏈的5’端突出部分的序列；
[0054](4)用通用引物3和通用引物4對(duì)步驟(3)得到的所述DNA片段進(jìn)行第三次PCR擴(kuò)增，得到DNA測(cè)序模板；
[0055]所述通用引物3的自5’端至3’端分為片段3和片段4，所述片段4為步驟(3)所述片段1，所述片段3為如下a):
[0056]a) AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCC (固相支持物結(jié)合區(qū)域)；
[0057]所述通用引物4自5’端至3’端分為片段5和片段6，所述片段6為步驟(1)所述接頭中所述長(zhǎng)鏈的5’端突出部分的序列，所述片段5為如下b):
[0058]b) CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGAT (固相支持物結(jié)合區(qū)域)。
[0059]二、步驟一所述的方法的實(shí)際應(yīng)用
[0060]本試驗(yàn)將利用步驟一所述方法，以水稻品種中花11的基因組為待測(cè)序DNA樣品，針對(duì)其上的14個(gè)SNP位點(diǎn)(14個(gè)所述待測(cè)序位點(diǎn))設(shè)計(jì)水稻基因組特異引物(14個(gè)所述特異性引物Iros和14個(gè)所述特異性引物2ros),制備用于Illumina公司GA測(cè)序的測(cè)序模板。
[0061]1、引物設(shè)計(jì)
[0062]( I)第一輪PCR引物序列的設(shè)計(jì)
[0063]用primer5.0軟件設(shè)計(jì)用于檢測(cè)位于水稻目的基因OsOSCs基因和CYP51基因上的上述14個(gè)待測(cè)序位點(diǎn)的第一輪PCR特異引物序列(特異性引物lros)，設(shè)計(jì)引物序列原則為:GC%為40%-60%，長(zhǎng)度為25個(gè)堿基，TM值為65°C左右。引物序列具體如表1所示，引物序列由上海生工合成。
[0064]表1第一輪PCR基因組特異性引物序列
[0065]
【權(quán)利要求】
1.DNA測(cè)序模板的制備方法，包括如下步驟: (1)將具有待測(cè)序位點(diǎn)的DNA樣品依次進(jìn)行片段化、末端修復(fù)和補(bǔ)齊，3’端加A，以及連接接頭，得到用于第一次PCR反應(yīng)的模板； 所述待測(cè)序位點(diǎn)的上游核苷酸序列已知，且存在PCR特異引物對(duì)應(yīng)的特異區(qū)域； 所述接頭為由長(zhǎng)鏈和短鏈組成的一端是平末端另一端是5’粘性末端的雙鏈DNA，所述長(zhǎng)鏈的5’端突出； (2)用特異性引物Iros和通用引物I對(duì)步驟(1)得到的用于第一次PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，得到包含所述待測(cè)序位點(diǎn)的DNA片段； 所述特異性引物Iros與所述特異區(qū)域互補(bǔ)；所述通用引物I的序列含有選自步驟(1)所述接頭中所述長(zhǎng)鏈的5’端突出部分的序列； (3)用特異性引物2ros和通用引物2對(duì)步驟(2)得到的所述DNA片段進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到包含所述待測(cè)序位點(diǎn)的DNA片段； 所述特異性引物2ros自5’端至3’端分為片段I和片段2，所述片段2與所述特異區(qū)域互補(bǔ)，且所述特異性引物2ros自3’端起第一個(gè)核苷酸與所述待測(cè)序位點(diǎn)之間的距離比所述特異性引物Iros自3’端起第一個(gè)核苷酸與所述待測(cè)序位點(diǎn)之間的距離更近；所述片段I與所述待測(cè)序位點(diǎn)的上游不互補(bǔ)；所述通用引物2的序列選自步驟(1)所述接頭中所述長(zhǎng)鏈的5’端突出部分的序列； (4)用通用引物3和通用引物4對(duì)步驟(3)得到的所述DNA片段進(jìn)行第三次PCR擴(kuò)增，得到DNA測(cè)序模板；· 所述通用引物3的自5’端至3’端分為片段3和片段4，所述片段4選自步驟(3)所述片段1，所述片段3為如下a):
a)AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCC ； 所述通用引物4自5’端至3’端分為片段5和片段6，所述片段6選自步驟(1)所述接頭中所述長(zhǎng)鏈的5’端突出部分的序列，所述片段5為如下b):
b)CAAGCAGAAGACGGCATA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:權(quán)利要求1步驟(2)-(4)的三次所述PCR反應(yīng)所用的DNA聚合酶均為Phusion高保真DNA聚合酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述接頭中所述長(zhǎng)鏈的序列如序列表中序列1-10所示，所述接頭中所述短鏈的序列為如下中的任一種: A)序列表中序列I的自3’端起倒數(shù)第9位-倒數(shù)第2位的反向互補(bǔ)序列； B)序列表中序列2-序列10中任一個(gè)的自3’端起倒數(shù)第10位-倒數(shù)第2位的反向互補(bǔ)序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:用于所述第一次PCR反應(yīng)的所述通用引物I序列為序列表中序列U。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:用于所述第二次PCR反應(yīng)的所述通用引物2序列為序列表中序列12。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:用于所述第三次PCR反應(yīng)的所述通用引物3和所述通用引物4的序列分別為序列表中序列13和14。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103571822SQ201210253791
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月20日
【發(fā)明者】漆小泉, 池旭, 張英春 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所