一種腸道病毒71型的純化方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，特別是通過色譜方法從細胞培養收獲物中純化腸道病毒71型（EV71）的方法。該方法包括澄清病毒的細胞培養物，隨后進行超濾濃縮病毒，再使用凝膠過濾層析和陰離子交換層析純化病毒，連續層析步驟具有純化病毒且避免層析緩沖液更換、避免pH值和電導率調整的優點，所制備的病毒純化液具有低宿主蛋白和宿主脫氧核糖核酸殘留的優點。該方法制備的EV71純化液可用于手足口病滅活疫苗的制備，同時可以用于診斷試劑中參比抗原和抗體的制備。
【專利說明】一種腸道病毒71型的純化方法
發明領域
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，特別是通過色譜方法從細胞培養收獲物中純化腸道病毒71型(EV71)的方法。
【背景技術】
[0002]手足口病(Hand, foot and mouth disease, HFMD)是由腸道病毒引起的一種急性傳染病，主要通過密切接觸或消化道傳播，多發生于10歲以下的嬰幼兒，以手、足、口腔等部位皮膚粘膜的皮疹、皰疹、潰瘍為典型表現，個別患者可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發癥。該病自1957年首次報道以來，許多國家曾多次流行，我國自1981年在上海發現本病，以后北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、廣東等十幾個省(市)均有報導。二十一世紀初以來，我國報告的手足口病患者逐年遞增，該病已經對學齡前兒童的健康和生命造成嚴重的危害，我國衛生部于2008年5月2日起，將手足口病列為丙類傳染病管理。大量的流行病學研究表明，腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)是引發手足口病的主要病原體之一，而且重癥病例往往由EV71病毒感染引起。腸道病毒71型屬于小RNA病毒科(Picornaradae)腸道病毒屬(Enterovirus)的成員，EV71病毒的顆粒為二十面體立體對稱的球形結構，無包膜和突出，直徑大約在27nm,核酸為單股正鏈RNA (messenger-zctiveRNA)ο EV71分為A、B、C等三個基因型，其中A型僅包括原型株BrCr_CA_70 ；B型和C型又可進一步分為B1、B2、B3、B4以及C1、C2、C3和C4亞型。幾年來在我國分離的EV71病毒絕大部分屬于C4亞型。迄今為止，盡管該病毒在我國引起較多的發病，但有效的特異性疫苗尚未上市。
[0003]在疫苗研究及其它應用研究中，腸道病毒多采用非洲綠猴腎細胞(Vero)或者人二倍體細胞培養。從細胞培養中收集到的病毒培養液不僅含有所需要的病毒抗原，而且還含有培養過程中的雜質,例如宿主 細胞蛋白、宿主細胞核酸,牛血清和抗生素等。病毒抗原的純化是研究和生產中的一個關鍵問題。一個好的病毒抗原工藝應該去除各種培養過程中帶來的雜蛋白、脫氧核糖核酸
(Deoxyribonucleic acid, DNA)、內毒素及其它雜質，同時應具有很好的抗原回收率，并且易于自動化。
[0004]傳統的腸道病毒類疫苗純化多采用氯仿抽提、聚乙二醇沉淀、凝膠過濾層析等方法。隨著國家對疫苗安全性進一步重視，特別對于從連續傳代和異倍體細胞系獲得的疫苗產品而言，允許的細胞DNA最大限制量為100 pg/劑。傳統的純化方法已越來越難滿足疫苗產品對細胞DNA限制量的要求，其它方法例如添加核酸酶和魚精蛋白處理可以去除DNA，但是不僅成本昂貴，而且也存在著最終產品中需要檢測添加物殘留的問題。因此，需要摸索一種更有效的病毒純化方法以滿足要求。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種從細胞培養物中直接純化EV71病毒，最終獲得低殘留高純度的EV71病毒純化液。所得的病毒純化液可以用于手足口病滅活疫苗的制備，同時可以用于診斷試劑中參比抗原和抗體的制備，并適用于小型研究和大規模生產。
[0006]本發明包括澄清病毒的細胞培養物，隨后進行超濾濃縮病毒，再使用凝膠過濾層析和陰離子交換層析純化病毒，連續層析步驟具有純化病毒且避免層析緩沖液更換、避免PH值和電導率調整的優點，所制備的病毒純化液具有低宿主蛋白和宿主DNA殘留的優點。該方法制備的EV71純化液可用于手足口病滅活疫苗的制備，同時可以用于診斷試劑中參比抗原和抗體的制備。
[0007]本發明腸道病毒71型(EV71)純化方法，是從細胞培養物中直接純化EV71病毒，澄清病毒的細胞培養物，隨后進行超濾濃縮病毒，再使用凝膠過濾層析和陰離子交換層析純化病毒。
[0008]具體步驟以下:
⑴提供含高滴度EV71病毒的細胞培養物；
⑵離心或過濾澄清病毒的細胞培養物；
⑶超濾濃縮病毒懸液；
⑷凝膠過濾層析純化病毒懸液；
(5)陰離子交換層析純化病毒懸液。
[0009]該方法制備的EV71純化液可用于手足口病滅活疫苗的制備，同時可以用于診斷試劑中參比抗原和抗體的制備。
[0010]本發明病毒的 細胞培養物可由細胞工廠或生物反應器產生。
[0011]本發明病毒的細胞培養物其細胞株為適用于EV71病毒培養的細胞，包括非洲綠猴腎細胞(Vero)和人胚肺二倍體細胞。
[0012]本發明使用離心或過濾技術澄清細胞培養物，采用5000~10000g，2~8°C離心10~30分鐘；或采用2.5 μ M和0.45 μ M孔徑的過濾器進行兩次過濾。
[0013]本發明在步驟⑴中感染細胞的EV71病毒毒株分離至臨床病人標本，并且在細胞株上進行了適應性傳代，細胞株為適用于EV71病毒培養的任何細胞，就EV71病毒而言，優選為非洲綠猴腎細胞(Vero)和人胚肺二倍體細胞(ΚΜΒ17)。培養方式包括細胞工廠和生物反應器。細胞培養物可以是細胞培養上清，也可以是細胞裂解產物。病毒收獲產物經1:1000~1:10000 (V/V)的甲醛37°C滅活3~12天。病毒滅活也可以在病毒純化以后進行。
[0014]在步驟⑵中可以使用離心或過濾技術澄清細胞培養物；a)離心澄清，優選的方法是以5000~IOOOOg離心力在2~8°C離心10~30分鐘，收取上清，即為病毒澄清液；b)過濾澄清，優選的方法是先通過2.5 μ M孔徑的表面過濾器進行預過濾；然后通過具有0.45 μ M孔徑的過濾器進行再次過濾。濾過液即為病毒澄清液。
[0015]在步驟⑶中，采用超濾濃縮病毒懸液的超濾膜的截留分子量優選100KD~500KD，濃縮倍數為30~50倍，用緩沖液洗濾2~3次，獲得病毒濃縮液。
[0016]在步驟⑷中，病毒濃縮液采用柱層析純化，凝膠過濾層析采用的介質優選為Sepharose 4 Fast Flow 或 Sephacryl S-400 HR,平衡緩沖液優選 ρΗ6.5 — 7.5 的憐酸鹽緩沖液(PBS )，紫外吸收波長280nm、254nm測吸收值，收集病毒抗原峰。
[0017]在步驟(5)中，凝膠過濾層析純化的病毒液繼續用陰離子交換層析純化，采用的介質優選為SOURCE 30 Q或Q Sepharose XL。平衡緩沖液優選ρΗ7.5~8.0的20mM三羥甲基氨基甲烷(Tris);洗脫緩沖液優選pH7.5~8.0的20mM Tris，含0.1~1.0M的氯化鈉。紫外吸收波長280nm、254nm測吸收值，收集病毒抗原峰。
[0018]本發明制備的EV71病毒液必須是經過滅活的，可以對病毒的細胞培養收獲液滅活后進行純化，也可以在純化后再進行滅活。
[0019]純化的EV71病毒液可根據用途進行后續處理，例如除菌過濾、滅活后添加穩定劑或佐劑等制備疫苗，免疫動物制備抗體等。
[0020]本發明的優點在于:
⑴工藝易于放大，可大規模處理細胞工廠或生物反應器生產的大量病毒液，能滿足手足口病滅活疫苗的生產需求，病毒抗原回收率高且工藝穩定，重復性好；
⑵本發明制備的EV71病毒純化液用于疫苗生產，具有無外源因子污染，細胞宿主蛋白、宿主DNA殘留低，病毒滅活完全，安全性好；
下面的示例通過一些本發明的具體實施方案來進一步闡述本發明的內容，但并不是要將本發明的范圍局限在這些實例中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1 EV71病毒濃縮液凝膠過濾層析圖譜 圖2 EV71病毒濃縮液陰離子交換層析圖譜
圖3 EV71病毒精純液HPLC — TSK4000色譜圖 圖4 EV71病毒精純液SDS-PAGE分析圖譜 圖5 EV71病毒精純液透射電鏡圖譜。
【具體實施方式】
[0022]以下實施例僅用于說明本發明，但不用于限制本發明的范圍 實施例1
1)離心澄清:根據細胞培養物的體積選擇合適的離心機及轉子，以9000g離心力在4°C離心30分鐘，合并離心上清，即為病毒澄清液；
2)超濾濃縮
將裝上適宜數目(根據需要處理的樣品數量而定)100KD~500KD膜包的超濾系統用0.5M氫氧化鈉(NaOH)以適宜的壓力(進口壓20~30psi，回流壓力8psi，透過口壓力Opsi)和流速(I~3LPM)沖洗60分鐘，然后用5倍體積的注射用水清洗系統以去除殘留的NaOH，再用PBS沖洗至pH值中性；將上述澄清后的病毒液用此超濾系統濃縮至原體積的1/30~1/50，洗濾2~3次，最后得到EV71病毒濃縮液。
[0023]3 )凝膠過濾層析
將S印hacryl S-400 HR裝入層析柱內，以1%丙酮測柱效合格后，用0.5MNa0H以20cm/h的流速清洗層析柱四個柱體積，保證作用時間2小時，以進行消毒和去除內毒素，最后用PBS緩沖液平衡層析柱至pH值和電導值穩定時為止。將實施例2中所獲得的EV71病毒濃縮液緩慢加入層析柱內，上樣量為層析柱總體積的5~10%左右。上樣完畢后，以60cm/h流速用PBS連續洗脫，分部收集洗脫液。[0024]4)陰離子交換層析
將Source 30 Q凝膠裝入層析柱內，以1%丙酮測柱效合格后，用IM NaOH正反方向清洗四個柱體積以上，以進行消毒和去除內毒素，最后用0.02MTris(pH7.5)緩沖液平衡層析柱至pH值和電導值穩定時為止O。
[0025]將所獲得的病毒抗原峰用0.02M Tris (pH7.5)緩沖液適當稀釋以調節其離子強度，然后緩慢加入層析柱內，上樣量為層析柱總載量的50~70%左右。上樣完畢后，用
0.02M Tris (ρΗ7.5)洗脫 2 個柱體積，再用 0.02Μ Tris (ρΗ7.5)和 0.02Μ Tris IM 氯化鈉(ρΗ7.5)連續洗脫，分部收集洗脫液。
[0026]根據對純化前后進行蛋白質含量和抗原含量的測定，計算出雜蛋白去除率和抗原回收率。
[0027]純化結果:
抗原回收率72.3%
雜蛋白去除率98.2%
最終獲得的即為EV71病毒精純液，可進行后續的無菌過濾、滅活和添加穩定劑等步驟以適用于不同用途。
[0028]實施例2
I)過濾澄清:優選的方法是先通過2.5 μ M孔徑的表面過濾器進行預過濾；然后通過具有0.45 μ M孔徑的過濾器進行再次過濾。濾過液即為EV71病毒澄清液。
[0029]2)超濾濃縮
將裝上適宜數目(根據需要處理的樣品數量而定)100KD~500KD膜包的超濾系統用
0.5Μ氫氧化鈉(NaOH)以適宜的壓力(進口壓20~30psi，回流壓力8psi，透過口壓力Opsi)和流速(I~3LPM)沖洗60分鐘，然后用5倍體積的注射用水清洗系統以去除殘留的NaOH，再用PBS沖洗至pH值中性；將上述澄清后的病毒液用此超濾系統濃縮至原體積的1/30~1/50，洗濾2~3次，最后得到EV71病毒濃縮液。
[0030]3)凝膠過濾層析
將Sepharose 4 Fast Flow裝入層析柱內，以1%丙酮測柱效合格后,用0.5M NaOH以20cm/h的流速清洗層析柱四個柱體積，保證作用時間2小時，以進行消毒和去除內毒素，最后用PBS緩沖液平衡層析柱至pH值和電導值穩定時為止。
[0031]將上述所獲得的EV71病毒濃縮液緩慢加入層析柱內，上樣量為層析柱總體積的 5~10%左右。上樣完畢后，以IOOcm/小時流速用PBS連續洗脫，分部收集洗脫液。
[0032]4)陰離子交換層析
將Q Sepharose XL凝膠裝入層析柱內，以1%丙酮測柱效合格后，用IM NaOH正反方向清洗四個柱體積以上，以進行消毒和去除內毒素，最后用0.02MTris(pH7.5)緩沖液平衡層析柱至pH值和電導值穩定時為止。
[0033]將所獲得的病毒抗原峰用0.02M Tris (pH7.5)緩沖液適當稀釋以調節其離子強度，然后緩慢加入層析柱內，上樣量為層析柱總載量的50~70%左右。上樣完畢后，用0.02MTris (ρΗ7.5)洗脫 2 個柱體積，再用 0.02Μ Tris (ρΗ7.5)和 0.02Μ Tris IM NaCl (ρΗ7.5)連續洗脫，分部收集洗脫液。
[0034]根據對純化前后進行蛋白質含量和抗原含量的測定，計算出雜蛋白去除率和抗原回收率。
[0035]純化結果:
抗原回收率62.5%
雜蛋白去除率96.3%
最終獲得的即為EV71病毒精純液，可進行后續的無菌過濾、滅活和添加穩定劑等步驟以適用于不同用途。
[0036]實施例3
EV71病毒純化液的各項檢定:
本發明的EV71病毒純化液制備的滅活疫苗進行了以下指標的檢定:游離甲醛殘留、牛血清白蛋白殘留、宿主細胞蛋白殘留、宿主細胞DNA殘留、純度、抗原鑒別試驗、細菌內毒素殘留、抗生素殘留、無菌試驗、異常毒性檢查滅活驗證和PH值檢查。檢定方法參照《中國藥典》(2010年版)附錄的相關方法。檢定結果見表一。
[0037]表一
以上結果表明，本發明在抗原回收率、雜蛋白去除率及各種殘留物質的去除上都具有一定的優勢，通過本發明所制備的EV71病毒液具有純度高、殘留低的優點。用其所制備的滅活疫苗的各項檢定指標均達到或優于國家標準。
[0038]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出改進和潤飾，這些改進和潤飾也做為本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種腸道病毒71型純化方法，其特征在于從細胞培養物中直接純化腸道病毒71型，澄清病毒的細胞培養物，隨后進行超濾濃縮病毒，再使用凝膠過濾層析和陰離子交換層析純化病毒； 具體步驟如下: (1)提供含高滴度EV71病毒的細胞培養物； (2)離心或過濾澄清病毒的細胞培養物； (3)超濾濃縮病毒懸液； (4)凝膠過濾層析純化病毒懸液； (5)陰離子交換層析純化病毒懸液。
2.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于病毒的細胞培養物由細胞工廠或生物反應器產生。
3.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于所述的病毒的細胞培養物其細胞株適用于EV71病毒培養的細胞。
4.根據權利要求3所述的純化方法，其特征在于細胞株為非洲綠猴腎細胞和人胚肺二倍體細胞。
5.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于所述步驟(2)采用5000-10000g，2-8°C離心10-30分鐘；或采用2.5 μ M和0.45 μ M孔徑的過濾器進行兩次過濾。
6.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于所述步驟⑶超濾濃縮病毒懸液的超濾膜的截留分子量優選100KD-500KD，濃縮倍數30-50倍。
7.根據權利要求2的純化方法，其特征在于所述步驟⑷凝膠過濾層析介質采用Sepharose 4 Fast Flow 或 Sephacryl S-400 HR。
8.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于所述步驟(5)陰離子交換層析介質采用SOURCE 30 Q 或Q Sepharose XL。
9.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于腸道病毒71型是經過滅活的，可以對病毒的細胞培養收獲液滅活后進行純化，也可以在純化后再進行滅活。
10.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于所純化的病毒用于手足口病滅活疫苗的制備，同時用于診斷試劑中參比抗原和抗體的制備。
【文檔編號】C12R1/93GK103468653SQ201310437719
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月24日 優先權日:2013年9月24日
【發明者】姜云水, 高孟, 周康鳳, 陳科達, 毛子安, 高麗美, 唐彩華, 朱蓮, 王一虎, 莊昉成, 毛江森 申請人:浙江普康生物技術股份有限公司