專利名稱：一株具有百草枯抗性的硝化還原假單胞桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株對(duì)百草枯(Paraquat, PQ)具有抗性的硝化還原假單胞桿菌(Pseudomonas nitroreducens)菌株,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一株能在含強(qiáng)氧化劑PQ(50mmol/L)或者硝普鈉(Sodium nitroprusside, SNP, 200 u mol/L)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的革蘭氏陰性短桿菌菌株。該菌株中分離得到一個(gè)基因PnPQR，該基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，獲得對(duì)大腸桿菌具有抗性的菌株，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，能提高煙草對(duì)百草枯的抗性。
背景技術(shù)：
除草劑百草枯(paraquat，PQ)是世界范圍內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的除草劑之一，目前在 100多個(gè)國(guó)家的100多種作物中除草(http://www. paraquat, com/Chinese),其應(yīng)用面積僅次于草甘膦。草甘膦在全球市場(chǎng)近乎壟斷的地位，從某種程度上講，也得益于轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物的培育成功。單一除草劑壓力勢(shì)必引發(fā)雜草的抗性問(wèn)題。培育新型抗除草劑作物既是新的知識(shí)產(chǎn)權(quán)和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的需求，也是保護(hù)優(yōu)異除草劑的迫切需要。國(guó)際市場(chǎng)上百草枯僅次于草甘膦，但是尚未見(jiàn)抗百草枯作物出現(xiàn)。為了獲得豐富百草枯抗性資源，我們從百草枯污染的土壤中篩選抗性微生物，繼而從中分離抗性基因。本發(fā)明從抗性土壤中分離了 I個(gè)百草枯抗性菌株(S3)并對(duì)其進(jìn)行了一些列的生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)分類。本發(fā)明還從S3中分別克隆了 I個(gè)基因PnPQR，該基因ORF全長(zhǎng)均為1233bp，編碼410個(gè)氨基酸殘基，含有11個(gè)跨膜區(qū)(TMS)，屬于非典型的主要易化超家族(Majorfacilitator superfamily, MFS)。該基因在大腸桿菌BL21菌株中異源表達(dá),能提高大腸桿菌對(duì)百草枯的抗性。過(guò)量表達(dá)的PnPQR轉(zhuǎn)基因煙草植株TO代葉片分析初步表明，該基因能賦予煙草百草枯抗性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是獲得一株具有百草枯(Paraquat，PQ)抗性的菌株并了解該菌株的特征特性。本發(fā)明的菌株是一種利用稀釋平板法從PQ污染的土壤懸浮液中分離得到的具有高抗百草枯(PQ)的硝化還原假單胞菌(Pseudomonas nitroreducens)菌株,是能夠在含強(qiáng)氧化劑 PQ (50mmol/L)或者硝普鈉(Sodium nitroprusside, SNP, 200 u mol/L)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的革蘭氏陰性，短桿菌，具有硝化還原特性和反硝化還原特性，接觸酶陽(yáng)性、吲哚實(shí)驗(yàn)陰性。—株對(duì)百草枯(Paraquat, PQ)具有抗性的硝化還原假單胞桿菌菌株,該菌株是利用稀釋平板法從PQ污染的土壤懸浮液中分離得到的，該菌株現(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC 6300。本發(fā)明還公開(kāi)了一種植物表達(dá)載體pCAMBIA2301_PnPQR，是通過(guò)下述步驟制備(I)從硝化還原假單胞桿菌(Pseudomonas nitroreducens) CGMCC 6300 中分離百草枯抗性基因PnPQR 以Pl :5’ -CCACTCCGATGTCCAATC-3’ 和 P2 :5’ -TTACCCGCTCGTCCCTAT-3’ 為引物，通過(guò)PCR從硝化還原假單胞桿菌(Pseudomonas nitroreducens) CGMCC 6300中分離序列如SEQ ID NO. I所示的目標(biāo)基因PnPQR，將PnPQR連接到pMD18_T載體中，構(gòu)成pMD-PnPQR載體；(2) pCAMBIA2301載體啟動(dòng)子和終止子的添加以pBI121 為模板，應(yīng)用引物 35SF :5’ -AATTCGATTAGCCTTTTCAATTTCAG-S'和 35SR
5’ -GAGCTCAGGAAGITCAITTCAITTGGAG-3’，擴(kuò)增 CaM 35S 啟動(dòng)子片段；用 EcoR I 和 SacI 對(duì)PCR產(chǎn)物和pCAMBIA2301同時(shí)進(jìn)行雙酶切，用T4 Iigase連接成pCAMBIA2301_35S ;再以PBI121 為模板，用引物 NOSF :5’ -GCATGCATCGITCAAACAITTGGCAATAA-3’ 和 NOSR :5’ -GANTCGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3’，擴(kuò)增 NOS 終止子片段，再用 Sph I 和 HindIII 對(duì) PCR 產(chǎn)物和 pCAMBIA2301-35S-N0S 同時(shí)進(jìn)行雙酶切，用 T4 Iigase 連接成 pCAMBIA2301-35S_N0S。(3) pCAMBIA2301-PnPQR植物表達(dá)載體的構(gòu)建以pMD-PnPQR 為模板 P3 :5’ -GAAGGATCCTCCACTCCGATGTCCAATC-3’ 和 P4 :5’ -CTAGAGCTCTTACCCGCTCGTCCCTAT-3’為引物，擴(kuò)增包括PnPQR編碼區(qū)全長(zhǎng)片段，用BamHI和SacI對(duì)PCR產(chǎn)物和pCAMBIA2301-35S-N0S載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切，用T4 Iigase連接成pCAMBIA2301-PnPQR。上述植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-PnPQR用于煙草的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。本發(fā)明菌株能在含強(qiáng)氧化劑百草枯PQ(50mmol/L左右)或者硝普鈉(Sodiumnitroprusside, SNP, 200 u mol/L左右)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；具有硝化還原特性和反硝化還原特性，接觸酶陽(yáng)性。本發(fā)明菌株屬硝化還原假單胞菌；對(duì)多種抗生素具有抗性。本發(fā)明菌株對(duì)于抗氧化性、硝化還原和反硝化機(jī)制的研究是不可多得的資源。本發(fā)明菌株對(duì)于雜草的控制和其它農(nóng)業(yè)化學(xué)工業(yè)的研究也起著重要作用。PnPQR基因在大腸桿菌BL21菌株中異源表達(dá)，能提高大腸桿菌對(duì)百草枯的抗性；過(guò)量表達(dá)的PnPQR轉(zhuǎn)基因煙草植株TO代葉片分析初步表明，該基因能賦予煙草百草枯抗性。


圖I是S3在含有不同PQ濃度的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線。圖2是JM109在含有不同PQ濃度的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線。圖3是S3在含有不同SNP濃度的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線。圖4是JM109在含有不同SNP濃度的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線。圖5是S3菌株的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)生分析。圖6是重組菌BL21/pET32a_PnPQR在不同濃度的PQ培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)。圖7是轉(zhuǎn)基因植株(T0代)的百草枯抗性分析。CK :野生型，PQR :轉(zhuǎn)PnPQR植株，I 1000 Ii mol/L, 2 100 u mol/L, 3 :5 u mol/L。菌株S3于2012年6月20保藏在位于中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)3號(hào)院中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC 6300 ;分類命名是硝基還原假單胞菌Pseudomonas nitroreducens。
具體實(shí)施例方式I)百草枯(Parauqat, PQ)污染土壤的采集土壤樣品(沙壤土，含水量7%)主要采集于南京紅太陽(yáng)集團(tuán)公司和深圳諾普信農(nóng)化股份有限公 司，采集地離生產(chǎn)車(chē)間約200m，采集深度(T30cm。2)菌株的分離與篩選采用稀釋平板分離法(李順鵬.微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 2003)將土壤懸浮液平鋪于含有不同濃度百草枯(0，1，10，20，50臟01/1)的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑90mm)上，將培養(yǎng)皿置于30°C培養(yǎng)48h，觀察生長(zhǎng)情況。從土壤懸浮液中成功地分離了 4個(gè)抗20mmol/L PQ (百草枯標(biāo)樣購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer-Schafers’ s實(shí)驗(yàn)室)的單克隆,經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的篩選，選擇了 I個(gè)抗50mmol/L PQ的單克隆進(jìn)行純化,用于進(jìn)一步的研究工作。此單克隆命名為S3。純化的菌株在瓊脂平板劃線，30°C培養(yǎng)36h后，進(jìn)行觀察。S3單克隆菌落直徑約
2.1_，淺黃色，圓形半透明，邊緣光滑而整齊；革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體紅色，為革蘭氏陰性菌，短桿狀。結(jié)晶紫染色無(wú)芽孢。3)分離菌株的生化鑒定使用細(xì)菌ATB自動(dòng)化儀(bio-Merieux ATB Expression, France)鑒定分離菌株的碳源利用情況，具體步驟參考說(shuō)明書(shū)(ID 32 GN V3. I) (ID32 GN試劑盒購(gòu)自法國(guó)梅里埃，Lennart Meri,公司)，并利用Database V3. 0.進(jìn)行分析。表明它能夠分解衣康酸、辛二酸鹽、乙酸鹽、DL-乳酸鹽、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、丙酸鹽、癸酸鹽、戊酸鹽、檸檬酸鹽、3-羥基-丁酸鹽、4-羥基-苯甲酸鹽、L-脯氨酸共13種碳源；不能分解李糖、N-乙酰葡萄糖胺、D-核糖、肌醇、蔗糖、麥芽糖、丙二酸鹽、L-丙酸鹽、甘露醇、水楊酸、D-蜜二糖、L-巖藻糖、D-山梨酸、組氨酸、5-酮基-葡萄糖酸鹽、糖原、3-羥基-苯甲酸鹽、2-酮葡萄糖酸鹽、L-絲氨酸共19種碳源。常規(guī)的生理生化鑒定參考伯氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)(Holt J G.Bergey’s Manual ofDeterminative Bacteriology, (9th edition) [M]，1984，500pp),其中包括革蘭氏染色試驗(yàn)、厭氧生長(zhǎng)試驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、硝化還原試驗(yàn)、反硝化試驗(yàn)、吲哚反應(yīng)、硫化氫試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)等。鑒定結(jié)果表明S3是一種兼性厭氧、非葡萄糖發(fā)酵型細(xì)菌。它的最適生長(zhǎng)溫度為30° C，4° C和41° C都不能正常生長(zhǎng)。其它生理生化特性見(jiàn)表I。表I S3的其它生化特性
持 ft+/-# Iltt+/- Itfl+/-
笮ut染色-鹽還設(shè)《驗(yàn)+ wmmmmmm +
驗(yàn)++ 驗(yàn)青* 漏定-
+驗(yàn)- wmmmmmML +
頌觀化％酵領(lǐng)-酸;趟—駄;1試驗(yàn)1-
V-P14 -性試驗(yàn)+ -IM ―廣利丨1〗-
驗(yàn)-橡酸鹽的 1丨1+驗(yàn)+
'11 ! MR)丨式驗(yàn)- fP鱗脂Sf試驗(yàn)- 反M1Hfcbt驗(yàn)+
a* “ + ” 陽(yáng)性；陰性。4)分尚菌株的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(杭州博日科技公司)說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌基因組DNA。利用16S rDNA的保守序列設(shè)計(jì)引物(許敬亮等，中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2006，26 (3) :307 310)，16sF:5’-AGTTTGATCCTGGCTCA-3’ (SEQ ID NO. I )，和16sR:5’-TACCTTGTTACGACTT-3’ (SEQID NO. 2)，用于擴(kuò)增分離菌株的 16s rDNA 基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO. 3)。PCR擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min ;94°C變性40s，53°C退火40s，72°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán);最后72°C延伸IOmin0 PCR產(chǎn)物直接利用3730測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序(中國(guó)上海英杰)，獲得1441-bp的核苷酸片段。以此片段為種子，在NCBI進(jìn)行Blastn比對(duì)，下載同源序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。下載序列的多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生分析采用 ClustalX 軟件(Thompson et al Nucleic. Acids Res, 1997，25 (24) : 4876 4882)和UPGMA (MEGA version 3. I)程序進(jìn)行，16sDNA基因的核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析表明(圖5), S3與Pseudomonas親緣關(guān)系較近,其中與Pseudomonas nitroreducens的一致性為96%,與其他Pseudomonas的一致性為在87-93%之間，而與Gammaproteobacteria中其它屬 的同源性都在77-84%之間。5)發(fā)明菌株對(duì)百草枯和硝普鈉抗性的分析將分離到的菌株劃線，挑取單克隆至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基里，30°C震蕩培養(yǎng)至0D600=0. 6時(shí)，取40 ii L上述0D600=0. 6的培養(yǎng)物接種于含40mL不同濃度的PQ(0, 0. 05, 0. I, 0. 5, 5, 20 and 50mmol/L)和 SNP (0，20，200 y mol/L)的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基于IOOmL的三角瓶中，30°C，200rpm震蕩培養(yǎng)，取不同培養(yǎng)時(shí)間用分光光度計(jì)(Beckman)測(cè)量0D600值，并用Excel 2003繪制生長(zhǎng)曲線圖(圖I)，以大腸桿菌工程菌株JM109(Novagen)和 BL21 (DE3) (Novagen) (Openwetware. 2008. Citing online sources:E.coli genotypes, 2008,購(gòu)于上海英濰捷基貿(mào)易有限公司)做對(duì)照。結(jié)果表明，與不含PQ的培養(yǎng)基相比，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(即20h前)低濃度PQ (0. 5mmol/L以下)，培養(yǎng)基上S3的生長(zhǎng)沒(méi)有得到明顯地抑制，高濃度PQ (20 and 50mmol/L)生長(zhǎng)受到了一定程度的抑制，在SNP(20，200 u mol/L)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)沒(méi)有受到明顯的影響(圖3);然而，工程菌株Escherichiacoli JM109在0. lmmol/LPQ (圖2)的培養(yǎng)基上幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)，在含SNP (20，200 y mol/L)的培養(yǎng)基上它的生長(zhǎng)也受到了嚴(yán)重的抑制(圖4)。分離菌株的最小抑菌濃度(minimuminhibitory concentrations, MICs)測(cè)量米用肉湯稀釋法。將菌株接種后震蕩培養(yǎng)至0D600=0. 6，然后轉(zhuǎn)接至含30mL培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中使其終濃度為5X105CFU ^mL-U 30°C，200rpm震蕩培養(yǎng)60h后用分光光度計(jì)(Beckman)測(cè)量0D600，0D600彡0. 4記為陽(yáng)性，0D600<0. 4記為陰性。介于陽(yáng)性和陰性之間的PQ的濃度被稱為MICs。培養(yǎng)基中含如下濃度的PQ : 0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100mmol/L。結(jié)果表明S3能夠生長(zhǎng)在含有低于70mmol/L PQ的培養(yǎng)基上，但是在高于80mmol/L PQ的培養(yǎng)基上，不能生長(zhǎng)，因此S3的MIC為70-80mmol/L，而對(duì)照E. coli JM109的 MIC 為 0-0. lmmol/L0 S3 的抗性是 E. coli JM109 的 700 倍。6)發(fā)明菌株的藥敏實(shí)驗(yàn)對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、四環(huán)素類等的藥敏實(shí)驗(yàn)采用藥敏紙片擴(kuò)散法，以銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853)作為質(zhì)控菌株。具體操作標(biāo)準(zhǔn)參考Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; SeventeenthInformational Supplement (NCCLS，2007)。將細(xì)菌培養(yǎng)物涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48h后統(tǒng)計(jì)抑菌圈的大小。對(duì)于抑菌圈的解釋依據(jù)NCCLS CLSI對(duì)于Pseudomonasaeruginosa 和 non-Enterobacteriaceae 的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于 NCCLS CLSI 沒(méi)有的抗生素(青霉素G10IU,苯唑青霉素I U g，氨節(jié)青霉素10 V- g,頭孢氨節(jié)30 u g,頭孢唑林30 u g,頭孢拉定30 u g，頭孢呋新30 u g，舒普深75/75 y g，四環(huán)素30 y g，強(qiáng)力霉素30 u g，美滿霉素30 u g，紅霉素15y g，麥迪霉素30ii g，氯霉素30ii g，氯潔霉素g，復(fù)方新諾明23. 75/1. 25u g),按如下標(biāo)準(zhǔn)確定抗/感抗性R :抑菌圈直徑< 13_，中介I :抑菌圈直徑為14-16mm，敏感S :抑菌圈直徑> 17mm。從藥敏試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看(表2)，S3對(duì)青霉素G (100 y g)，氨基糖苷類抗生素(丁胺卡那30 y g和慶大霉素IOyg)及喹諾酮類(奧復(fù)星(氟嗪酸)5 u g，環(huán)丙沙星(奔克)和亞胺(配能)硫霉素(IOy g)敏感。而對(duì)多數(shù)青霉素類(青霉素G除外)、頭孢菌素類(除復(fù)達(dá)欣和菌必治為中間狀態(tài))、氯霉素、他唑巴坦/哌拉西林，多粘菌素B，復(fù)方新諾明(SMZ/TMP)，痢特靈和萬(wàn)古霉素。
表2藥敏紙片法檢測(cè)分離菌株對(duì)抗生素的敏感性
權(quán)利要求
1.一株對(duì)百草枯具有抗性的硝化還原假單胞桿菌(Pseudomonas nitroredu_cens)菌株S3，它的保藏號(hào)為CGMCC6300。
2.一種植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-PnPQR，其特征在于通過(guò)下述方法制備 (1)從硝化還原假單胞桿菌(Pseudomonasnitroreducens) CGMCC 6300中分離百草枯抗性基因PnPQR 以 Pl :5’ -CCACTCCGATGTCCAATC-3’ 和 P2 :5’ -TTACCCGCTCGTCCCTAT-3 '為引物，通過(guò)PCR從硝化還原假單胞桿菌(Pseudomonas nitroreducens) CGMCC 6300中分離序列如SEQID NO. I所示的目標(biāo)基因PnPQR，將PnPQ連接到pMD18_T載體 中，構(gòu)成pMD-PnPQR載體； (2)pCAMBIA2301載體啟動(dòng)子和終止子的添加以 pBI121 為模板，應(yīng)用引物 35SF :5’ -GAATTCGATTAGCCTTTTCAATTTCAG-3'和 35SR :5’-GAGCTCAGGAAGITCAITTCAITTGGAG-3’，擴(kuò)增 CaM35S 啟動(dòng)子片段；用 EcoR I 和 SacI 對(duì) PCR產(chǎn)物和PCAMBIA2301同時(shí)進(jìn)行雙酶切，用T4 Iigase連接成pCAMBIA2301_35S ;再以pBI121為模板，用引物 NOSF :5’ -GCATGCATCGITCAAACAITTGGCAATAA-3’ 和 NOSR :5’ -GANTCGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3’，擴(kuò)增NOS終止子片段，再用Sph I和HindIII對(duì)PCR產(chǎn)物和PCAMBIA2301-35S-N0S 同時(shí)進(jìn)行雙酶切，用 T4 Iigase 連接成 pCAMBIA2301-35S_N0S ； (3)pCAMBIA2301-PnPQR植物表達(dá)載體的構(gòu)建以 pMD-PnPQR 為模板 P3 :5’-GAAGGATCCTCCACTCCG ATGTCCAATC-3’ 和 P4 :5’-CTAGAGCTCTTACCCGCTCGTCCCTAT-3 '為引物，擴(kuò)增包括PnPQR編碼區(qū)全長(zhǎng)片段，用BamHI和SacI對(duì)PCR產(chǎn)物和pCAMBIA2301-35S-N0S載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切，用T4 Iigase連接成pCAMBIA2301-PnPQR。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株對(duì)百草枯(PQ)具有抗性的硝化還原假單胞桿菌(Pseudomonasnitroreducens)菌株，菌株編號(hào)為S3。它從PQ污染的土壤分離獲到，屬革蘭氏陰性短桿菌，能在含強(qiáng)氧化劑PQ或者硝普鈉(SNP)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，具有硝化還原特性和反硝化還原特性，接觸酶陽(yáng)性、吲哚實(shí)驗(yàn)陰性；有利于研究細(xì)菌抗氧化性、硝化還原和反硝化機(jī)制；同時(shí)對(duì)于雜草的控制和其它農(nóng)業(yè)化學(xué)工業(yè)的研究也起著重要作用。本發(fā)明從S3中克隆了PnPQR基因，該基因編碼一個(gè)非典型的主要易化超家族(MFS)成員。PnPQR在大腸桿菌BL21菌株中表達(dá)，能提高其對(duì)百草枯的抗性。過(guò)量表達(dá)PnPQR的轉(zhuǎn)基因煙草植株具有百草枯抗性。
文檔編號(hào)C12R1/38GK102747022SQ201210256009
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月23日
發(fā)明者倪萬(wàn)潮, 鞏元勇, 張香桂, 徐鵬, 束紅梅, 沈新蓮, 郭書(shū)巧 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院