專利名稱：一種提高煙草煙葉鉀含量的育種方法
技術領域：
本發明涉及一種提高煙草煙葉鉀含量的育種方法。
背景技術：
根據大量資料統計，鉀是烤煙吸收量和體內含量最高的營養元素，也是影響我國烤煙質量進一步提高的重要限制因素。而我國大多數植煙土壤不能提供充足的鉀供給烤煙以滿足優質煙葉生產的需求。因此，生產上需要投入大量的鉀肥。連年大量施用 化肥，不但增加煙農的生產成本，而且加速土壤理化性質的惡化。遺憾的是我國優質煙葉平均鉀含量依然較低，與國外優質煙葉相比至少還低20%以上(我國優質煙葉2%左右，國外優質煙葉大
2.5%)。影響烤煙體內鉀含量的因素有許多，主要有土壤和氣候；栽培措施；品種或基因型等。土壤和氣候是自然形成的，人類較難改變。栽培措施提高煙葉鉀含量，多年實踐證明有一定的局限性，何況再增加鉀肥用量也不可取。因此，選育高鉀含量烤煙新品種將是解決烤煙鉀含量的關鍵途徑之一。然而常規育種存在遠緣雜交不親合、雜種性狀不穩定、分離世代長等問題；體細胞雜交技術雖然在一定程度上克服了雜交不親合現象，但存在再生頻率低、變異后代群體小、體細胞無性系變異、遺傳不穩定等問題；自Hess提出花粉粒可以吸收外源DNA的研究報道以后，總DNA導入技術在作物育種中得到廣泛應用，它逾越了常規育種中的生殖障礙，彌補了細胞工程技術繁瑣、植株再生頻率低、后代群體小，難以篩選等缺陷，在目前煙草遺傳背景尚不明了、優良基因來源有限、轉基因研究仍受到貿易壁壘負面影響的形勢下，不失為一條切實可行的品種改良的捷徑。利用帶有目的基因的供體植物DNA (包括遠緣供體DNA)直接轉化受體，篩選目的性狀變異后代，培育農作物新品種的方法，是植物基因工程與分子生物技術在農業育種上的實際應用。花粉管通道法是利用植物開花受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精細胞。近年來，我國已通過此技術在棉花、大豆、水稻、小麥、煙草等多種作物上獲得成功。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種花粉管通道法，將高鉀植物商陸的總基因組DNA導入到烤煙品種紅花大金元中，以期獲得高鉀含量烤煙的方法。本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的，其步驟如下一種提高煙草煙葉鉀含量的育種方法利用花粉管通道法將高鉀植物商陸的總體DNA導入煙草品種紅花大金元(從中國煙草中南試驗站購買)中進行栽培，具體包括以下步驟(I)供體DNA的提取取0. 2g幼嫩煙草冰凍葉片入硯缽中一加入2XCTAB提取液700 u I研磨后轉入I. 5ml離心管一于65°C保溫20_30min —冷卻后加入等體積的氯仿 異戍醇混勻IOmin — 10000r/min離心IOmin —取上清液至一新管一加入100 u I 5M NaCl和Iml冰冷乙醇沉淀DNA —挑出DNA沉淀，用70%乙醇洗凈干燥一溶解于100 u ITE中；所述的2XCTAB 提取液配方為2%CTAB, I. 4M NaCl, IOOmM Tris-HCl, IOOmM EDTA，pH8. 0，2%P -巰基乙醇；所述的氯仿異戊醇的體積比為24 : I ;(2)導入方法選擇生長健壯、主莖中上部已開放的花朵，將其花冠褪下，露出柱頭，然后用左手拇指甲做砧板托住柱頭，右手拿刀片沿與柱頭成45°C角切除1/4 1/3柱頭，最后將DNA提取液滴于柱頭上，再將花冠戴上；導入時間從早晨6:00花初放開始，然后每一小時導入一次，至下午4:00花凋萎止。所述的提高煙草煙葉鉀含量的育種方法中，將高鉀植物商陸的總體DNA導入煙草品種后，再以煙草煙葉鉀含量不低于2%的標準進行篩選。煙葉鉀含量測定在煙株成熟期時，每個處理選取有代表性的植株6株整株收獲， 洗凈后在105°C下殺青30min，然后在80°C下烘干，粉碎過篩，將0. 45mm篩的樣品0. Ig置于150mL三角瓶中，加5%乙酸IOOmL,塞上橡皮塞，在搖床或振蕩器上振蕩萃取30min，用定性濾紙過濾，棄去前幾毫升濾液，收集后續濾液，最后用原子吸收光譜儀測定鉀的濃度。本發明的積極效果是首次將煙草作為受體，將高鉀植物商陸的總基因組DNA導入烤煙品種紅花大金元中，獲得了高鉀含量烤煙；以滿足優質煙葉生產的需求。應用花粉管通道導入外源植物總基因組DNA可以引起煙草受體的形狀變異，通過篩選，可以得到各方面形狀表現好的品種，而且由于是在自花受粉的基礎上，部分DNA片段或目的基因進入受體基因組，避免了供體與受體基因的全面重組，因而易于穩定；同時，利用花粉管通道將植物總基因組DNA導入煙草的育種方法，操作簡單方便，也是目前解決煙草遠源雜交改良品種較有效的方法之一。


圖I為熒光定量PCR法測定不同煙草高鉀新品系和對照中相關高鉀基因的mRNA轉錄水平。
具體實施例方式以下實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。實施例I :本發明方法實施后煙草后代主要性狀的表現按照以下方法進行DNA導入(I)供體DNA的提取取0. 2g幼嫩煙草冰凍葉片入硯缽中一加入2 X CTAB提取液700 u I研磨后轉入I. 5ml離心管一于65°C保溫20_30min —冷卻后加入等體積的氯仿 異戍醇混勻IOmin — 10000r/min離心IOmin —取上清液至一新管一加入100 u 15M NaCl和Iml冰冷乙醇沉淀DNA —挑出DNA沉淀，用70%乙醇洗凈干燥一溶解于100 u ITE中；所述的2XCTAB 提取液配方為2%CTAB, I. 4M NaCl，IOOmM Tris-HCl, IOOmM EDTA, pH8. 0，2%^ -巰基乙醇；所述的氯仿異戊醇的體積比為24 : I ;(2)導入方法選擇生長健壯、主莖中上部已開放的花朵，將其花冠褪下，露出柱頭，然后用左手拇指甲做砧板托住柱頭，右手拿刀片沿與柱頭成45°C角切除1/4 1/3柱頭，最后將DNA提取液滴于柱頭上，再將花冠戴上；導入時間從早晨6:00花初放開始，然后每一小時導入一次，至下午4:00花凋萎止。
I.煙草后代主要農藝性狀的表現以商陸為供體，烤煙品種紅花大金元為受體，配制導入組合，每個組合處理20朵花，成熟后獲％1082粒(Dtl為導入當代種子)。2000年種植Dtl,共212株發育成正常植株。成熟期(移栽后65d)分別取中部葉測定煙葉鉀含量，結果見表I。從表I中可知，供體植物商陸的總基因組DNA導入烤煙后，煙葉鉀含量產生了較大變幅。15%的煙株煙葉鉀含量高于2. 5%，其中有I株煙葉鉀含量高達5. 06%。可見，外源DNA導入處理，顯著改變了受體煙葉鉀含量，證明導入的有效性。表I Dtl代煙葉含鉀量(中部葉)
煙葉鉀含fi (%) <2,0 2.0 2. 5 2. 5 3. 5 3. 5 4. 5 4. 5 5. 0 >5,0 株數(株)1285215124I
出現頻率ObO0.250.070 Uh0.020.005收獲時，煙葉鉀含量高于2. 5%的煙株單收單脫，獲D1代種子，經過連續九年種植，以煙葉鉀含量高于2. 5%為主要選擇壓力，同時考慮株型和抗病性，將選出的D9代的三個株系進行主要性狀考查，結果見表2。由表2可知，導入后的D9代株系的主要農藝性狀與受體(紅花大金元)相比，株高、葉數、節距和生育期均無多大變化。而在葉面積(長X寬)、莖圍和產量三個性狀方面，不同的品系表現不一樣。D9-05和D9-06的葉面積最大,和受體相比達到極顯著水平差異；09-05和09-12的產量最高，和受體相比達到顯著水平差異；在莖圍方面，與受:體相比，D9-06和D9_12兩個品系達到極顯著水平差異。表2 D9代主要農藝性狀基本調查表
株高葉數長X寬莖圍節距屯存期卜葉甫產量
品種/糸
tcm) (片)(CnT)(cm) (cm) (d)(g)Ckg/hm")
D9-OS199.5 27 1753.3* 11.8* 6.3 124 104.8 2729.8**
D9-06214.8 29 1762.8* 12.2** 6.0 128 115.5* 2622. 7
D9-12215,7 30 1698.8 12.6** 6.8* 128 118.2* 2724,9**
受體(紅花大
一195. I 27 1728. 5 9.4 5.8 122 112.8 2628.5*
金元)注*表示在LSRatl5水平有顯著差異，**表示在LSRatll水平有顯著差異。2.煙草后代煙葉鉀含量的表現煙葉含鉀量的高低作為質量評價的重要指標之一。試驗結果表明，新品系的煙葉含鉀量均比對照(紅花大金元)較大的提高(表3);與對照相比，以D9-05和D9-06的增幅最大，其中D9-05的中部葉含鉀量平均數超過I. 9%，總和超過5. 7% ；D9-06的下部葉含鉀量平均數超過2. 17%，總和超過6. 51%。表3三個新品系煙葉含鉀量與對照比較的差異顯著性n ^IT鉀含量平均數比較總和的比較
m系(或m種) 部位 -v-mr n tn -v-mr _平均數_-MM__走數
上部葉2.350.50*7.051.50*
D9-05中部葉3.981.90**11.945. 70**
下部葉3.891.64*11.674.92**
上部葉2.820.97"8.462.91"
D Db屮部葉3.611.53w10.834.59**
F部葉4. 422. 17*13.266.51*
上部葉2.560.7Im'7.682. 13"
D9-12中部葉3.471.39**10.41-I. 17**
下部葉3.531.28**10.593.84**
紅介+人一上部葉1.855.55
ilHf7c 中部葉2.086.24
下部葉2.256. 75注*表示在LSRatl5水平有顯著差異廣表示在LSRatll水平有顯著差異。多重比較時，相同部位進行比較。實施例2 :本發明方法實施后煙草后代煙葉質量的表現I.煙葉外觀質量表現煙葉外觀質量評價結果表明(表4):紅花大金元與D9_05和D9_12品系在成熟度上表現基本一致，而D9-06品系成熟較晚；油分最多的是紅花大金元，其次是09-06品系；紅花大金元與D9-05、D9-06和D9-12結構大部分均為疏松；D9-05、D9-06和D9_12在飽滿度、均勻度、色澤上均好于K327。這說明，新品系在煙葉外觀質量上，稍好于對照紅花大金元，但差異不顯著。表4不同品系的煙葉外觀質量評價比較
均勻度
品種(系)部位成熟度組織結構油分飽滿度Uniformit 色澤 Variety Position Maturity Structure Oil Plumpness yChorma
B成熟稍密稍有-有 CBC
D9-05C成熟疏松有-稍有 BBB
X 成-尚熟疏松稍有-有 CCC B 成-尚熟稍密有-稍有 CBBD UhC 成-尚熟疏松稍有-有 CCB
X 成-尚熟疏松稍有 CBB B 成-尚熟稍密稍有-有 BBB D -1) C 成熟疏松有-稍有 CBC X 成熟疏松稍有-有 BCC 紅花大金 B 成熟疏松稍有 C C B 元 C 成熟疏松有-稍有 BCB __X 成-尚熟尚疏松有__B__C__B注部位中的B、C、X分別代表上部煙葉、中部煙葉和下部煙葉(下同)。
2.煙葉化學成分表現分別取不同品系和紅花大金元葉片，烘烤后煙葉混合煙樣進行化學成分的常規分析(表5):①在下部葉片中，09-06和09-12品系的總糖含量稍低于對照紅花大金元而D9-05品系稍聞于對照紅花大金兀，但均未達到顯著水平；D9_05、D9-06和D9_12新品系的還原糖均高于對照紅花大金元而總氮和煙堿稍低于對照紅花大金元，但均未達到顯著水平；還原糖/煙堿、K2O和Cl—上均高于對照紅花大金元而在K2o/cr上均低于對照紅花大金元。②在中部葉片中，新品系的總糖、還原糖、還原糖/煙喊、K2O和K20/C1均聞于對照紅花大金元，其中在總糖上與對照的差異不顯著、在還原糖上與對照的差異達顯著水平、在還原糖/煙堿上與對照的差異除與D9-12品系差異不顯著外同09-05和09-06品系呈顯著水平、在K2O上除與BD9-06品系差異達顯者水平外同D9-12和D9-05品系差異不顯者、在K2O/Cl上同D9-12、D9-05和D9-06品系達極顯著水平；總氮和Cr均低于對照紅花大金元，對照與D9-06品系差異達顯著水平而與D9-12和D9-05品系差異不顯著；只有D9-12品系的煙堿高于對照紅花大金元，D9-05和D9-06品系的煙堿低于對照紅花大金元且對照與D9-06品系達到了顯著水平；③在上部葉片中，新品系的總糖、還原糖和Cr均低于對照紅花大金元，其中對照在總糖上除與d9-12品系差異不顯著外同d9-05和D9-Oe品系呈顯著水平、在還原糖上差異均 不顯著而在Cr上差異均達極顯著水平；在K2O和K2o/cr上均高于對照紅花大金元，其中對照與D9_06品系差異均不顯著而與D9_12和D9_05品系差異均達顯著水平；D9_05和D9_06品系的總氮和煙堿均高于對照紅花大金元且差異達極顯著水平，而D9-12品系的低于對照紅花大金元且差異不顯著水平；D9-12品系的還原糖/煙堿高于對照紅花大金元且差異不顯著，而D9-05和D9-06品系的低于對照紅花大金元且差異達顯著水平。表5不同品系主要化學成分比較
權利要求
1.一種提高煙草煙葉鉀含量的育種方法，其特征在于，利用花粉管通道法將高鉀植物商陸的總體DNA導入煙草品種紅花大金元中進行栽培，具體包括以下步驟 (1)供體DNA的提取取0.2g幼嫩煙草冰凍葉片入硯缽中一加入2XCTAB提取液700 u I研磨后轉入I. 5ml離心管一于65°C保溫20_30min —冷卻后加入等體積的氯仿 異戍醇混勻IOmin — 10000r/min離心IOmin —取上清液至一新管一加入100 u I 5M NaCl和Iml冰冷乙醇沉淀DNA —挑出DNA沉淀，用70%乙醇洗凈干燥一溶解于100 u ITE中；所述的 2X CTAB 提取液配方為2%CTAB, I. 4M NaCl，IOOmM Tris-HCl，IOOmM EDTA, pH8. 0，2% ^ -巰基乙醇；所述的氯仿異戊醇的體積比為24 : I ; (2)導入方法選擇生長健壯、主莖中上部已開放的花朵，將其花冠褪下，露出柱頭，然后用左手拇指甲做砧板托住柱頭，右手拿刀片沿與柱頭成45°C角切除1/4 1/3柱頭，最后將DNA提取液滴于柱頭上，再將花冠戴上；導入時間從早晨6:00花初放開始，然后每一小時導入一次，至下午4:00花凋萎止。
2.根據權利要求I所述的提高煙草煙葉鉀含量的育種方法，其特征在于，將高鉀植物商陸的總體DNA導入煙草品種后，再以煙草煙葉鉀含量不低于2. 5%的標準進行篩選。
全文摘要
本發明是一種提高煙草煙葉鉀含量的育種方法。利用花粉管通道法將高鉀植物商陸的總體DNA導入栽培煙草品種紅花大金元中，引起其后代煙葉鉀含量大幅度提高，為煙草新品種的選育、改良和種質資源的創新提供了豐富的變異來源。
文檔編號C12N15/87GK102787139SQ20121025605
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月23日 優先權日2012年7月23日
發明者夏凱, 徐雙紅, 戴林建, 朱列書, 王翔, 符建國, 鐘軍 申請人:湖南農業大學