專利名稱：一種高效表達(dá)重組人凝血八因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)高效表達(dá)重組八因子的工藝方法。
背景技術(shù)：
天然人凝血八因子(FVIII)是一種大分子糖蛋白，由重鏈和輕鏈結(jié)合而成，總分子量330KD，血漿中含量約O. 2mg/L,以結(jié)合血管性血友病因子(VWF)的形式存在。血液凝集反應(yīng)中，活化的FVIII使FIX的酶活大大提高，催化FX的活化，并結(jié)合組成一個(gè)復(fù)合體，催化凝集鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行下去。FVIII分子的缺失或缺乏導(dǎo)致A型血友病，補(bǔ)充有活性的FVIII是治療A型血友病的有效措施。重組人FVI11與天然FVI11有相同的生理，藥理和免疫特征，并且有杜絕HIV，HDV,蛋白病毒等病源傳播的優(yōu)點(diǎn)，因此，重組FVIII蛋白表達(dá)的研究成為A型血友病治療的一個(gè)重要趨勢(shì)。世界上第一支重組人凝血八因子，即第一代的重組八因子在1990年就已經(jīng)上市。目前全球的八因子銷售年達(dá)到了 70億國(guó)際單位，其中60%為基因工程重組凝血八因子。天然FVIII總是與vWF結(jié)合成復(fù)合物而穩(wěn)定存在。重組FVIII分泌至細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基時(shí)，分子很容易解體，并且被降解，表達(dá)的FVIII得不到積累。利用vWF和FVIII共表達(dá)系統(tǒng)可以很好地解決重組FVIII在細(xì)胞分泌表達(dá)過(guò)程中的不穩(wěn)定和容易降解等問(wèn)題。Kaufman等人的研究表明，F(xiàn)VIII與VWF共表達(dá)后可顯著提高FVIII的表達(dá)水平。此外，在有血清的培養(yǎng)條件下,血清中的VWF可以結(jié)合新生成的VIII，形成比較穩(wěn)定的復(fù)合物,達(dá)到FVIII在細(xì)胞培養(yǎng)液中累積的效果。在利用細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)重組八因子過(guò)程中，為了提高八因子的表達(dá)量，利用有血清培養(yǎng)基或者在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染FVIII和VWF基因，穩(wěn)定了八因子的表達(dá)，但這兩種方法都存在各自的局限性。對(duì)于有血清培養(yǎng)基來(lái)說(shuō)，由于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，外源添加動(dòng)物血清而帶來(lái)了病毒潛在污染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，目前利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物中傾向于無(wú)血清培養(yǎng)替代有血清細(xì)胞培養(yǎng)。而對(duì)于VWF與FVIII基因的共表達(dá)來(lái)說(shuō)，人們?cè)谘芯恐亟M人凝血八因子表達(dá)中發(fā)現(xiàn)，VffF與FVIII共表達(dá)，八因子的表達(dá)量比較低，細(xì)胞株的構(gòu)建也比較復(fù)雜，篩選出的高表達(dá)八因子細(xì)胞株在無(wú)血清培養(yǎng)基中的表達(dá)量一般在O. 1-0.5國(guó)際單位/天/IO6細(xì)胞，此表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到產(chǎn)業(yè)化的要求。可見(jiàn)，目前急需一種新的培養(yǎng)方法來(lái)表達(dá)重組八因子，能夠在無(wú)血清培養(yǎng)條件下實(shí)現(xiàn)重組八因子的工業(yè)化生產(chǎn)，使八因子的表達(dá)簡(jiǎn)單、高效、無(wú)病毒污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)高效表達(dá)重組八因子的工藝方法。本發(fā)明首先公開(kāi)了一種高效表達(dá)重組人凝血八因子的方法，為將外源的血管性血友病因子添加到表達(dá)重組人凝血八因子的細(xì)胞培養(yǎng)液中，并在培養(yǎng)過(guò)程中控制細(xì)胞培養(yǎng)液、中血管性血友病因子與人凝血八因子的活性比為I 10:1。較優(yōu)的，所述表達(dá)重組人凝血八因子的細(xì)胞培養(yǎng)液為無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液。本發(fā)明中所述表達(dá)重組人凝血八因子的細(xì)胞為單獨(dú)表達(dá)重組FVIII的細(xì)胞株，VWF為另外制備，作為分子伴侶額外添加到表達(dá)重組人凝血八因子的細(xì)胞培養(yǎng)液中的外源物質(zhì)。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是將VWF按照一定的比例添加到重組八因子的細(xì)胞培養(yǎng)液中，可大大提高重組八因子的表達(dá)量，這種方法為工業(yè)化八因子的生產(chǎn)提供了一種簡(jiǎn)單實(shí)用的實(shí)現(xiàn)路徑。本發(fā)明的方法不需將八因子和VWF基因共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，簡(jiǎn)化了細(xì)胞株構(gòu)建過(guò)程，提高了高產(chǎn)細(xì)胞株篩選效率，特別適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)重組人凝血八因子。較優(yōu)的，所述高效表達(dá)重組人凝血八因子的方法具體步驟如下
I)表達(dá)細(xì)胞的準(zhǔn)備表達(dá)人凝血八因子的細(xì)胞株的構(gòu)建或者表達(dá)人凝血八因子的凍存細(xì)胞的復(fù)蘇；2)表達(dá)細(xì)胞的擴(kuò)種培養(yǎng)將步驟I)構(gòu)建或復(fù)蘇的人凝血八因子表達(dá)細(xì)胞接種到無(wú)血清培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)3 4天，至細(xì)胞密度達(dá)到I 2 X 106cells/ml，細(xì)胞傳代，振蕩培擴(kuò)增養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到I 2X106cells/ml，獲得種子液；3)細(xì)胞反應(yīng)器培養(yǎng)將步驟2)獲得的種子液接種到細(xì)胞反應(yīng)器的無(wú)血清培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 7天，使細(xì)胞液的細(xì)胞密度達(dá)到I 5X106cellS/ml ;然后向細(xì)胞液中加入外源VWF并對(duì)細(xì)胞液進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，獲得細(xì)胞原液；所述補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程中，控制細(xì)胞液中VWF活性與FVIII活性比為I 10:1 ;4)凝血八因子產(chǎn)品的制備對(duì)細(xì)胞原液進(jìn)行離心、過(guò)濾、純化處理，獲得重組人凝血八因子產(chǎn)品。步驟I)所述表達(dá)人凝血八因子的細(xì)胞株或者表達(dá)人凝血八因子的凍存細(xì)胞為構(gòu)建的單獨(dú)表達(dá)人凝血八因子的細(xì)胞株，并且表達(dá)的FVIII包括全長(zhǎng)FVIII的和B區(qū)有缺失的FVIII片段。構(gòu)建方法為常規(guī)分子生物學(xué)重組蛋白制備方法。較優(yōu)的，步驟2)中構(gòu)建或復(fù)蘇的人凝血八因子表達(dá)細(xì)胞以I 9X105cells/ml的接種量進(jìn)行接種。表達(dá)細(xì)胞的擴(kuò)種培養(yǎng)可以將構(gòu)建或復(fù)蘇的人凝血八因子表達(dá)細(xì)胞接種到三角瓶中，經(jīng)過(guò)搖瓶培養(yǎng)、傳代、搖瓶培養(yǎng)獲得種子液。較優(yōu)的，步驟2)中所述細(xì)胞傳代是以1:2 4的傳代比例傳代。更優(yōu)的，步驟2)中所述細(xì)胞傳代是以1:3的傳代比例傳代。較優(yōu)的，步驟2)中振蕩培養(yǎng)的條件為轉(zhuǎn)速60 150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度32 38。。。較優(yōu)的，步驟3)種子液接種到細(xì)胞反應(yīng)器的接種量為5 10v/v%。較優(yōu)的，步驟3)所述補(bǔ)料培養(yǎng)的條件為補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程中控制溶氧40 80%，PH6. 8 7. 2，攪拌轉(zhuǎn)速40 90轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度32 38°C，根據(jù)葡萄糖的消耗來(lái)進(jìn)行補(bǔ)料，使葡萄糖濃度維持在O. 5 I. 5g/L。更優(yōu)的，步驟3)所述補(bǔ)料培養(yǎng)的條件為補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程中控制溶氧40 80%，PH6. 8 7. 2，攪拌轉(zhuǎn)速40 90轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度37°C，根據(jù)葡萄糖的消耗來(lái)進(jìn)行補(bǔ)料，使葡萄糖濃度維持在I. Og/L。較優(yōu)的，步驟3)反應(yīng)器培養(yǎng)得到的所述細(xì)胞原液的細(xì)胞密度為I 2X IO7ceIls/ml ο步驟4)所述重組人凝血八因子產(chǎn)品的制備所采用的離心、過(guò)濾、純化處理為常規(guī)的蛋白分離純化步驟，獲得的較高純度的FVIII中VWF既可除去也可仍舊保留。本發(fā)明步驟2)表達(dá)細(xì)胞的擴(kuò)種培養(yǎng)及步驟3)細(xì)胞反應(yīng)器培養(yǎng)均可采用現(xiàn)有的常規(guī)無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中為了得到穩(wěn)定的凝血八因子必須要在同一個(gè)細(xì)胞株中共表達(dá)八因子和VWF的難點(diǎn)。本發(fā)明提出了一種有效的細(xì)胞培養(yǎng)途徑，通過(guò)將FVIII和VWF的含量控制在一定的優(yōu)化范圍內(nèi)，使FVIII的表達(dá)被大量累積，并且本發(fā)明的制備工藝表達(dá)細(xì)胞構(gòu)建難度小，特別適合工業(yè)化生產(chǎn)重組人凝血八因子。本發(fā)明的效果包括1)本發(fā)明的生產(chǎn)方法采用的是單獨(dú)表達(dá)八因子細(xì)胞株，不需 要八因子與VWF共轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，前期的細(xì)胞株構(gòu)建和篩選過(guò)程簡(jiǎn)單；2)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程添加了 VWF因子，提高了八因子的累積和穩(wěn)定；3)適合工業(yè)化生產(chǎn)，可非常簡(jiǎn)單地提高八因子表達(dá)量，也容易放大。


圖I :重組八因子的大規(guī)模反應(yīng)器培養(yǎng)工藝流程圖2 :凝血八因子活性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說(shuō)明配方的試劑均為按照常規(guī)條件，如[美]Sambrook. J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗(yàn)指南，第三版。北京科學(xué)出版社2002中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。實(shí)施例一I.實(shí)驗(yàn)方法I)將馴化為無(wú)血清培養(yǎng)的八因子表達(dá)細(xì)胞(八因子表達(dá)細(xì)胞的構(gòu)建參考文獻(xiàn)“凝血因子FVIII在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)研究”，王琪等，藥物生物技術(shù)，2002, 9(5)25Γ255 ；細(xì)胞株無(wú)血清馴化方法可參照細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè)，如invitrogen公司產(chǎn)品手冊(cè)附錄中細(xì)胞培養(yǎng)操作部分)，以9X105cells/ml接種三角搖瓶，培養(yǎng)溫度32°C，搖瓶轉(zhuǎn)速為60轉(zhuǎn)/分鐘；無(wú)血清培養(yǎng)約3天后細(xì)胞密度達(dá)到2X106cellS/ml，以1:2的比例傳代，搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度38°C，轉(zhuǎn)速60轉(zhuǎn)/分鐘，至細(xì)胞密度達(dá)到I 2X106cells/ml。無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液為商業(yè)化SIGMA公司產(chǎn)品SFMII302培養(yǎng)液。2)用含有不同活性重組VWF (重組VWF蛋白的制備參考文獻(xiàn)Recombinant vonWillebrand factor:Potential Therapeutic Use, BernhardE. Fischer, Journal ofThrombosis and Thrombolysis, Volume8, Number3 (1999)，197-205)的培養(yǎng)液換液培養(yǎng)表達(dá)八因子的細(xì)胞(檢測(cè)VWF活性的試劑盒購(gòu)自上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司)，培養(yǎng)24小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行八因子活性分析(見(jiàn)表I)。本實(shí)施例所采用的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液為商業(yè)化SIGMA公司產(chǎn)品SFMII302培養(yǎng)液。3)八因子活性分析方法
采用人凝血因子VIII測(cè)定法(一期法)，可參加中國(guó)藥典三部附錄XN人凝血因子VIII測(cè)定法，具體步驟如下A.試劑(I) 3. 8%枸櫞酸鈉取枸櫞酸鈉9. 5g，加水溶解并稀釋至250ml。⑵咪唑緩沖液(ρΗ7· 3):取咪唑O. 68g和氯化鈉I. 17g，加水使溶解成100ml，加入
O.lmol/L鹽酸溶液42. 2ml，再加水稀釋至200ml，即得。
⑶稀釋液取一體積的3. 8%的枸櫞酸鈉加入5體積咪唑緩沖液混合，加適量20%人血白蛋白至終濃度為1%。⑷激活的部分凝血活酶(APTT)試劑。(5)人凝血因子VIII缺乏血漿為人凝血因子VIII含量低于1%的人血漿或人工基質(zhì)血漿。(6) O. 05mol/L氯化鈣溶液取氯化鈣(CaCl2 · 2H20) 147g，加水溶解并稀釋至1000ml，配制成lmol/L的氯化鈣貯存液，用前用水稀釋20倍，配制成O. 05mol/L氯化鈣溶液。B.人凝血因子VIII標(biāo)準(zhǔn)液的制備用人凝血因子VIII缺乏血漿將標(biāo)準(zhǔn)品(人凝血因子VIII標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自法國(guó)Stago公司)稀釋成每Iml含IIU凝血因子VIII，再用稀釋液分別進(jìn)行10倍、20倍、40倍和80倍稀釋，置冰浴待用。C.待測(cè)樣品溶液的制備用人凝血因子VDI缺乏血漿將待檢測(cè)樣品稀釋成每Iml含IIU凝血因子珊，再用稀釋液進(jìn)行10倍和20倍或40倍稀釋，置冰浴待用。D.樣品的檢測(cè)⑴取激活的部分凝血活酶試劑O. 1ml，置37°C水浴保溫一定時(shí)間(一般4min)，加入凝血因子VDI缺乏血漿O. 1ml、不同稀釋度的人凝血因子VDI標(biāo)準(zhǔn)溶液O. 1ml，混勻，置37°C水浴保溫一定時(shí)間(一般5min),加已預(yù)熱至37°C O. 05mol/L氯化I丐溶液O. Iml,記錄凝固時(shí)間。將標(biāo)準(zhǔn)溶液人凝血因子珊效價(jià)(IU/ml)的對(duì)數(shù)對(duì)其相應(yīng)的凝固時(shí)間(秒)的對(duì)數(shù)進(jìn)行直線回歸處理，求出直線回歸方程，回歸的線性曲線如圖2所示。⑵取激活的部分凝血活酶試劑O. 1ml，置37°C水浴保溫一定時(shí)間(一般4min)，加入凝血因子VDI缺乏血漿O. 1ml、待測(cè)樣品溶液O. 1ml，混勻，置37°C水浴保溫一定時(shí)間(一般5min),加已預(yù)熱至37°C O. 05mol/L氯化I丐溶液O. Iml,記錄凝固時(shí)間。⑶計(jì)算待測(cè)樣品溶液人凝血因子珊效價(jià)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為待測(cè)樣品人凝血因子VDI效價(jià)(IU/ml)。表I不同添加量的VWF對(duì)八因子活性的影響
權(quán)利要求
1.一種高效表達(dá)重組人凝血八因子的方法，為將外源的血管性血友病因子添加到表達(dá)重組人凝血八因子的細(xì)胞培養(yǎng)液中，并在培養(yǎng)過(guò)程中控制細(xì)胞培養(yǎng)液中血管性血友病因子與人凝血八因子的活性比為I 10:1。
2.如權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述表達(dá)重組人凝血八因子的細(xì)胞培養(yǎng)液為無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，具體步驟如下 1)表達(dá)細(xì)胞的準(zhǔn)備表達(dá)人凝血八因子的細(xì)胞株的構(gòu)建或者表達(dá)人凝血八因子的凍存細(xì)胞的復(fù)蘇； 2)表達(dá)細(xì)胞的擴(kuò)種培養(yǎng)將步驟I)構(gòu)建或復(fù)蘇的人凝血八因子表達(dá)細(xì)胞接種到無(wú)血清培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)3 4天，至細(xì)胞密度達(dá)到I 2 X 106cells/ml，細(xì)胞傳代，振蕩培養(yǎng)擴(kuò)增至細(xì)胞密度達(dá)到I 2X106cells/ml，獲得種子液； 3)細(xì)胞反應(yīng)器培養(yǎng)將步驟2)獲得的種子液接種到細(xì)胞反應(yīng)器的無(wú)血清培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 7天，使細(xì)胞液的細(xì)胞密度達(dá)到I 5X 106cells/ml ;然后向細(xì)胞液中加入外源WF并對(duì)細(xì)胞液進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，獲得細(xì)胞原液；所述補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程中，控制細(xì)胞液中VWF活性與FVIII活性比為I 10:1 ; 4)凝血八因子產(chǎn)品的制備對(duì)細(xì)胞原液進(jìn)行離心、過(guò)濾、純化處理，獲得重組人凝血八因子產(chǎn)品。
4.如權(quán)利要求3所述的制備工藝，其特征在于，步驟2)中構(gòu)建或復(fù)蘇的人凝血八因子表達(dá)細(xì)胞以I 9X105cellS/ml的接種量進(jìn)行接種。
5.如權(quán)利要求3所述的制備工藝，其特征在于，步驟2)中所述細(xì)胞傳代是以1:2 4的傳代比例傳代。
6.如權(quán)利要求3所述的制備工藝，其特征在于，步驟2)中振蕩培養(yǎng)的條件為轉(zhuǎn)速60 150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度32 38°C。
7.如權(quán)利要求3所述的制備工藝，其特征在于，步驟3)種子液接種到細(xì)胞反應(yīng)器的接種量為5 10v/v%。
8.如權(quán)利要求3所述的制備工藝，其特征在于，步驟3)所述補(bǔ)料培養(yǎng)的條件為補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程中控制溶氧40 80%，pH6. 8 7. 2，攪拌轉(zhuǎn)速40 90轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度32 38°C，根據(jù)葡萄糖的消耗來(lái)進(jìn)行補(bǔ)料，使葡萄糖濃度維持在O. 5 I. 5g/L。
9.如權(quán)利要求3所述的制備工藝，其特征在于，步驟3)反應(yīng)器培養(yǎng)得到的所述細(xì)胞原液的細(xì)胞密度為I 2X107cells/ml。
10.如權(quán)利要求3所述的制備工藝，其特征在于，步驟3)在培養(yǎng)過(guò)程中控制細(xì)胞培養(yǎng)液中血管性血友病因子與人凝血八因子的活性比為2 3:1。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)高效表達(dá)重組人凝血八因子的工藝方法，具體為將外源的血管性血友病因子添加到表達(dá)重組人凝血八因子的細(xì)胞培養(yǎng)液中，并在培養(yǎng)過(guò)程中控制細(xì)胞培養(yǎng)液中血管性血友病因子與人凝血八因子的活性比為1～10:1。本發(fā)明利用重組人凝血八因子表達(dá)過(guò)程中必須要VWF分子伴侶，穩(wěn)定新生成的人凝血八因子，提高人凝血八因子的累積效果，降低了技術(shù)難度，提高了目標(biāo)蛋白的表達(dá)效果。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102776260SQ20121026209
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月26日
發(fā)明者李軍輝, 楊松峰, 許必雄 申請(qǐng)人:上海泰龍生物醫(yī)藥科技有限公司