專利名稱：凝固酶原以及使用所述酶檢測內毒素或(1→3)-β-D-葡聚糖的方法
技術領域：
本發明涉及編碼鱟來源的凝固酶原的核酸，含有所述核酸的病毒、攜帶所述病毒的細胞及使用所述細胞的制備凝固酶原的方法，還涉及使用由此獲得的凝固酶原檢測Et或BG的方法和檢測試劑盒。
背景技術：
已知有使用鱟的變形細胞溶解物(鱟血球提取液，以下僅稱為“溶解物”)測定Et或BG的方法。所述方法基于溶解物由Et或BG而凝固。所述凝固反應是因若干凝固因子被逐級活化而引起的(專利文獻1、非專利文獻I)。例如，BG與溶解物接觸，則將存在于溶解物中的G因子活化為活性G因子。所述活性G因子又將存在于溶解物中的Pro-CE活化為CE。所述CE限制性水解存在于溶解物中的凝固蛋白原分子的特定位點，由此生成凝固蛋白凝膠，從而凝固溶解物。CE也作用于合成底物(例如、叔丁氧羰基-亮氨酰-甘氨酰-精氨酸-pNA(B0C-Leu-Gly-Arg-pNA))，水解其酰胺鍵，從而釋放PNA。因此，可通過測定生成的顯色物質(pNA)的吸光度來定量BG (專利文獻I)。Pro-CE已被克隆(非專利文獻2)，但是難以使用所述核酸表達保持活性的蛋白質(Pro-CE)0也就是說，Pro- CE已經被克隆，但是本文獻公開的技術方案僅是用于獲得編碼目的蛋白的cDNA的靶克隆的標準方法。即僅僅是使用抗CE抗體從Xgtll cDNA文庫(150萬個克隆)中篩選出23個克隆，亞克隆到pUC118/119載體中后，測定堿基序列。事實上，僅是這些操作，其所需工作量也非常大，因此沒有進行絲氨酸蛋白酶前體ProCE的酶活性(CE的蛋白酶(酰胺酶)活性)的表現和由活性B因子的PioCE的活化，或在活性C因子和B因子的共存下的酶活性的定量再現實驗(重構)。測定特定蛋白質堿基序列的工作和獲得所述蛋白質的重組體，并用其構建特定的測試系統的工作是需要全新水平的高技術創造性的課題。專利文獻1:特開平08-122334號公報專利文獻2 :特開2006-271384號公報非專利文獻I J. Protein Chem.，5，p255_268 (1986)非專利文獻2 J. Biol. Chem.，265 (36) · P22426-22433 (1990)

發明內容
發明擬解決的問題本發明旨在提供可穩定、廉價、大量制備具有一定品質的Et或BG的測定試劑的編碼鱟來源的Pro-CE的核酸，含有所述核酸的病毒，攜帶所述病毒的細胞和使用所述細胞制備Pro-CE的方法，通過使用所述制備方法獲得的使用Pro-CE檢測Et或BG的方法和檢測試劑盒。用于解決問題的方法發明人在為解決上述問題而進行研究的過程中發現，通過使用攜帶含有編碼Pro-CE的DNA的病毒的細胞，可制備具有Pro-CE活性的蛋白質，并發現可由此穩定、廉價、大量制備具有一定品質的Et和BG的檢測試劑，從而完成本發明。包括上述背景技術部分在內，本申請文件通篇使用的縮寫如下。Pro-CE :凝固酶原(pro-clotting enzyme)CE :凝固酶(clotting enzyme)AcNPV :首猜銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒BG : (I — 3) - β-D-甸聚糖Et :內毒素(也稱為“脂多糖”)HEPES :2_[4_ (2_ 輕乙基)-1-哌嗪]乙橫酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinyl]ethanesulfonic acid)HRP :辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)
MO1:感染復數(multiplicity of infection)NPV :核型多角體病毒(nuclear polyhedrosis virus)PBS :憐酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline)PCR :聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction)pNA :對硝基苯胺PVDF :聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride)SDS :十二燒基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate)SDS-PAGE :十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳LAL:鱟變形細胞溶解物即本發明提供編碼鱟來源的Pro-CE的核酸(以下稱為“本發明的核酸”)。這里所謂當選自中國當(Tachypleus tridentatus)、美洲當(LimulusPolyphemus)、馬來當(Tachypleus gigas)和圓尾當(Tachypleus rotundicauda)(也稱為東南亞當(Carcinoscorpius rotundicauda))這 4 種中的任一種。且其中所謂“編碼鱟來源的Pro-CE的核酸”更優選為選自下述(A) (C)中的核酸。(A)編碼含有序列號4所示氨基酸序列的蛋白質的DNA、(B)編碼“含有序列號4所示氨基酸序列中I個或多個氨基酸缺失、取代、插入或移位了的氨基酸序列且具有鱟來源的凝固酶原活性的蛋白質”的DNA、(C)由上述(A)或(B)的DNA轉錄得到的RNA。且其中所謂“編碼鱟來源的Pro-CE的核酸”優選選自下述(a) (d)中的核酸。(a)含有序列號3的堿基序列I 1143所示的堿基序列的DNA、(b)具有下述特征的DNA :在含有序列號3的堿基序列I 1143所示的堿基序列的堿基序列上，具有由所述堿基序列編碼的蛋白質的氨基酸序列中I個或多個氨基酸缺失、取代、插入或移位的堿基變異，且表達的蛋白質具有鱟來源的凝固酶原活性，(c)由上述(a)或(b)的DNA轉錄得到的RNA。本發明還提供含有本發明的核酸的病毒(以下稱為“本發明的病毒”)。這里所謂“病毒”優選為桿狀病毒。在桿狀病毒中也優選為NPV，更優選為AcNPV。本發明還提供攜帶本發明的病毒的細胞(以下稱為“本發明的細胞”)。對這里所謂“細胞”無特定限制，可考慮是否與上述本發明的病毒相符等自由選擇。即如大腸桿菌源、細菌源、酵母源、昆蟲源的細胞等。如上所述，合適的本發明的病毒為桿狀病毒，若選擇所述病毒，則優選昆蟲源的細胞。本發明還提供至少包括使本發明的細胞生長，并從其生長物中回收鱟來源的Pro-CE的步驟的制備鱟來源的Pro-CE的方法(以下稱為“本發明的制備方法”)。本發明還提供通過本發明的制備方法制備的Pro-CE (以下稱為“本發明的酶”)。本發明還提供E t的檢測方法(以下稱為“本發明的方法1”)，其特征在于使待檢測內毒素的被檢樣品與本發明的酶和“表現出通過與E t接觸使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體” 共存，以伴隨本發明的酶轉化為CE的酶活性作為指標，對所述樣品中的E t進行檢測。本發明的方法I中，“表現出通過與Et接觸使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”是“表現出通過與活性C因子接觸使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”和鱟來源的C因子和/或重組C因子。且其中所述“表現出通過與活性C因子接觸使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”是鱟來源的B因子和/或重組B因子。上述C因子和B因子優選均為重組型，本發明的方法I的最優選形式之一為例如，使待檢Et的被檢樣品與C因子和B因子同本發明的酶一起共存，且所述C因子和B因子均為重組型。若立足于檢測靈敏度等方法的有效性，則優選使用鱟來源的天然型C因子和B因子實施本發明的方法1，但欲回收作為天然的C因子和B因子的原料的鱟體液，則需捕獲鱟，并回收不對其持續生長產生障礙的限度的體液。在所述捕獲和回收體液時，難免對鱟造成某種程度的壓力，而且還有人指責由于環境破壞等原因鱟的個體數量在減少。因此如果將實施本發明的方法I中使用的所有級聯反應蛋白質均改為重組型，則尤其從保護珍貴生物資源的觀點來看意義深遠，對生物保護、動物代替的貢獻也無以估量。作為Et檢測系統的元件使用的C因子或B因子為重組型因子時，對于用于整合編碼所述因子的基因的載體和用于轉入所述載體的宿主的選擇可無特定限制，但也與前述重組型Pro-CE —樣，作為載體的病毒優選桿狀病毒，在桿狀病毒中也優選NPV，更優選AcNPV。因此，宿主雖可例舉大腸桿菌源、細菌源、酵母源、昆蟲源的細胞等，但本發明的病毒適選桿狀病毒，在選擇所述病毒時，適選昆蟲源的細胞。另外，所謂“將伴隨本發明的酶向CE轉化的酶活性作為指標”是指，定量或定性檢測由本發明的酶Pro-CE向CE轉化而誘導的酶活性，并將其作為被檢樣品中Et的存在量或存在指示。有關“出現伴隨Pro-CE向CE轉化的酶活性的現象”，可例舉由于CE的存在，伴隨凝固蛋白凝膠生成的溶解物的凝固(可根據凝膠化或渾濁程度的變化等進行檢測)，通過合成顯色底物的酰胺鍵的水解而分離的顯色色素的顯色等。尤其是，通過使用合成顯色底物，可構建高靈敏度的再現性好的測定系統。而且，也無需使用鱟來源的溶解物，從保護珍貴生物資源的角度也是十分有益的。有關合成顯色底物,可例舉例如、X-A-Y (式中、X為保護基、Y為顯色色素、A為三肽)所示的物質。由于CE的存在而切斷A-Y鍵，顯色色素Y顯色，形成Et的存在的定量或定性指示。這里，保護基X可例舉，肽的公知保護基，例如、叔丁氧羰基、苯甲酰基等；作為顯色色素Y，可例舉例如、pNA、MCA (7-甲氧基香豆素-4-醋酸)、DNP (2，4-二硝基苯胺)、丹磺酰(Dansyl)色素等。有關三肽,可例示例如,Leu-Gly-Arg (LGR :單字母表示)、和Ile-Glu-Gly-Arg (IEGR :單字母表示)、Val-Pro-Arg (VPR :單字母表示)等。在定量實施本發明的方法I時，可預先使用Et的標準品，制作顯示E t量和指示強度(顯色色素Y產生的顯色的強度或由于溶解物的凝固導致的混濁程度等)之間關系的相關數據(典型的是標準曲線)，以其為基準，以檢測出的指示強度作為基礎，檢測被檢樣品中的Et。對上述被檢樣品無特定限制，除了注射用水、藥品、輸液、血液制劑、醫療儀器(醫療用具)、醫藥部外品、化妝品等之外，還可列舉食品，飲用水，空氣、江河、土壤等環境樣品，天然蛋白質或基因重組蛋白質，核酸，酶，糖，電解質和血液、體液、組織等生物體成分等。本發明還提供用于實施本發明的方法I的Et檢測試劑盒(以下、稱為“本發明的試劑盒1”)，其特征在于其組分至少含有本發明的酶和“表現出通過與Et接觸使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”。而且本發明的試劑盒I優選為“表現出通過與內毒素接觸使凝固酶原轉化為凝固酶的活性的絲氨酸蛋白酶前體”是“表現出通過與活性C因子接觸使凝固酶原轉化為凝固酶的活性的絲氨酸蛋白酶前體”和”鱟來源的C因子和/或重組C因子”。而且，所述“表現出通過與活性C因子接觸使凝固酶原轉化為凝固酶的活性的絲氨酸蛋白酶前體”優選是鱟來源的B因子和/或重組B因子。

另外，在本發明的試劑盒I中，上述C因子和B因子均為重組型是合適的，有關本發明的試劑盒I的最適形式之一，可例舉作為其構成含有的C因子和B因子均為重組型的形式。也就是說，有關本發明的試劑盒I中所含的級聯反應蛋白質，更優選僅是本發明的酶、重組C因子和重組B因子。本發明的試劑盒I中，可根據用本發明的試劑盒I實施的本發明的方法I的形式而選擇用于實施本發明的方法I而使用的試劑等，例如上述合成顯色底物(X-A-Y)、緩沖液、稀釋液、鹽、鱟的溶解物等，并包含于試劑盒的組成中。本發明還提供一種BG檢測方法(以下稱為“本發明的方法2”)，其特征在于使待檢BG的被檢樣品與本發明的酶和“表現出通過與BG接觸使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”共存，以伴隨凝固酶原轉化為凝固酶的酶活性作為指標，對所述樣品中的BG進行檢測。本發明的方法2中，“表現出通過與BG接觸使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”優選為鱟來源的G因子和/或重組G因子。上述G因子適選重組型，有關本發明的方法2的最適形式之一，可例舉使待檢BG的被檢樣品與本發明的酶同G因子一起共存，且所述G因子全部為重組型。而且，在本發明的方法2中使用的G因子是重組型的合適理由與本發明的方法I中C因子和B因子適選重組型的理由相同。而且，有關可獲得重組型G因子時的載體的病毒，適選桿狀病毒，在桿狀病毒中也優選NPV，更優選AcNPV，這與上述C因子和B因子相同。而且，有關宿主，可例舉大腸桿菌源、細菌源、酵母源、昆蟲源的細胞等，合適的本發明的病毒為桿狀病毒，在選擇所述病毒時，適選昆蟲源的細胞，理由同上。而且，所謂“以伴隨由本發明的酶向CE轉化的酶活性作為指標”是指定量或定性檢測出現本發明的酶Pro-CE向CE轉化的現象，并以其作為被檢樣品中的BG的存在量或存在的指示，這與本發明的方法I相同，有關“出現本發明的酶Pro-CE向CE轉化的現象”的內容也與本發明的方法I公開的相同。本發明的方法2中也可適用合成顯色底物X-A-Y。在定量實施本發明的方法2時，可預先使用BG的標準品，制作表示BG量和指示強度(顯色色素Y產生的顯色的強度或由于溶解物的凝固導致的混濁程度等)之間關系的相關數據(典型的是校正曲線)，以其為基準，以檢測出的指示強度作為基礎，檢測被檢樣品中的BG0對上述被檢樣品無特定限制，除了注射用水、藥品、輸液、血液制劑、醫療儀器(醫療用具)、醫藥部外品、化妝品等之外，還可列舉食品，飲用水，空氣、江河、土壤等環境樣品，天然蛋白質或基因重組蛋白質，核酸，酶，糖，電解質和血液、體液、組織等生物體成分等。而且本發明還提供用于實施本發明的方法2的BG檢測試劑盒(以下、稱為“本發明的試劑盒2”)，其特征在于其組分至少含有本發明的酶和“表現出通過與BG接觸使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”。本發明的試劑盒2，其中的“表現出通過與BG接觸使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”優選為鱟來源的G因子和/或重組G因子。而且本發明的試劑盒2中，上述G因子適選為重組型，本發明的試劑盒2的最適形式之一可例舉作為其構成含有的G因子(α、β亞單位)均為重組型的形式。也就是說，有關本發明的試劑盒2所含的級聯反應蛋白質，更優選僅是本發明的酶、重組G因子。

本發明的試劑盒2中，可根據用本發明的試劑盒2實施的本發明的方法2的形式而選擇用于實施本發明的方法2而使用的試劑等，例如上述合成顯色底物(X-A-Y)、緩沖液、稀釋液、鹽、鱟的溶解物等，并包含于試劑盒的組成中。發明的效果由于通過使用本發明的核酸可提供對穩定，有效，大量且廉價制備具有一定品質的Pro-CE有用的本發明的病毒，因此本發明的核酸極為有用。而且，通過使用本發明的病毒可提供對穩定，有效，大量且廉價制備具有一定品質的Pro-CE有用的本發明的細胞，因此本發明的病毒極為有用。而且，通過使用本發明的細胞可穩定，有效，大量且廉價制備具有Pro-CE的活性的一定品質的蛋白質，而且由此可提供本發明的方法和本發明的試劑盒，因此極為有用。進而，通過本發明的方法和本發明的試劑盒，不用從珍貴生物資源鱟中制備溶解物，就可進行E t和BG的檢測、測定，提供了對生物保護、動物代替、成本、精度、再現性等方面極為有用的方法。附圖的簡要說明

圖1表示Pro-CE重組病毒的目的序列N末端、C末端區域的測序分析結果。圖2表示Pro-CE表達產物的蛋白質印記結果。圖3表示在BG濃度為Ing/mL時上清部分的反應性。圖4表示在BG濃度為10ng/mL時上清部分的反應性。
圖5表示由于使用DS-3GII成分的BG的反應性。圖6表示在Et濃度為10ng/mL時上清部分的反應性圖7表示在Et濃度為100ng/mL時上清部分的反應性。圖8表示在使用重組G因子(5倍稀釋)時的BG的反應性。圖9表示在Et反應中需使用的重組B因子的研究結果。圖10表不在Et反應中所使用的各樣品中所述反應的結果。圖11表示對在高濃度的Et存在下各因子對Boc-LGR-pNA底物的水解特性進行研究的結果。圖12表示在O IOOmM之間研究硫酸鎂濃度對完全重構體系的Et反應的影響的結果。圖13表示在O IOmM之間研究硫酸鎂濃度對完全重構體系的Et反應的影響的結果。圖14表示在O 5mM之間研究氯化鈣濃度對完全重構體系的Et反應的影響的結
果O圖15表示在O 2. 5mM之間研究氯化鈉濃度對完全重構體系的Et反應的影響的結果。圖16表示對使用Boc-LGR-pNA和Boc-VPR-ρΝΑ作為底物時的完全重構體系的Et反應的差異進行研究的結果。發明的最佳實施形式以下通過本發明的最佳實施形式對本發明進行說明。1.本發明的核酸本發明的核酸為編碼鱟來源的Pro-CE的核酸。本發明的核酸中“編碼鱟來源的Pro-CE的核酸”只要是編碼鱟來源的Pro-CE的核酸，則無特定限制。例如，可例示由序列號I記載的堿基序列構成的核酸(序列號2僅表示基于所述堿基序列的氨基酸序列)，但如果是本領域技術人員就容易理解的是，具有由于遺傳密碼的簡并性而導致差異的堿基序列的堿基序列所構成的核酸也包含于本發明的核酸中。這里使用的“核酸”可以是DNA，也可以是RNA，本領域技術人員可根據其用途進行選擇。例如，在更為重視穩定性時，可選擇DNA。有關這種核酸，可例示編碼源于如下鱟的Pro-CE的核酸中國當(Tachypleustridentatus),美洲當(Limulus Polyphemus),馬來當(Tachypleus gigas)和圓尾當(Tachypleus rotundicauda) 這其中優選編碼源于中國當(Tachypleus tridentatus)或美洲當(LimulusPolyphemus)的Pro-CE的核酸，更優選編碼源于中國當(Tachypleus tridentatus)的Pro-CE的核酸。本發明的核酸也可化學合成，也可通過基因工程方法制備。在通過基因工程方法制備時，可按照常規方法從例如美洲當(Limulus Polyphemus),中國當(Tachypleustridentatus),馬來當(Tachypleus gigas)和圓尾當(Tachypleus rotundicauda)等當的血球(變形細胞)中制備出cDNA文庫，使用所述文庫以及例如5號序列或6中記載的人工制備的堿基序列的引物，通過PCR法，使目的DNA擴增進行制備。可通過使用凝膠電泳等基于分子量的分離方法，容易地分離PCR產物。而且這里所謂“編碼鱟來源的Pr0-CE的核酸”更優選為下述(A) (C)的核酸。(A)編碼含有序列號4所不氣基酸序列的蛋白質的DNA、(B)編碼“含有序列號4所示氨基酸序列中I個或多個氨基酸缺失、取代、插入或移位了的氨基酸序列且具有鱟來源的凝固酶原活性的蛋白質”的DNA、(C)由上述(A)或(B)的DNA轉錄得到的RNA。這里所謂“編碼含有序列號4所示氨基酸序列的蛋白質的DNA”是編碼源于中國鱟(Tachypleus tridentatus)的 Pro-CE 的 DNA。而且在天然存在的蛋白質中，由于編碼其的DNA的多態性或變異可導致氨基酸序列中發生氨基酸的取代，缺失，插入或移位等變異，此外由于生成后的蛋白質在細胞內和純化中的修飾反應等可發生氨基酸的磷酸化，糖基化，脂質添加，脯氨酸的羥化等翻譯后修飾，盡管如此，但也存在與沒有變異的蛋白質呈現基本等同的生理、生物學活性的變異蛋白質。這樣，即使對于“由(A)的DNA編碼的蛋白質”存在若干差異，卻沒有發現其功能有大的差異的“由(B)的DNA編碼的蛋白質”可認為與“由(A)的DNA編碼的蛋白質”基本上相同。即使在人為地在蛋白質的氨基酸序列中導入如上所述變異時也是一樣，此時還可制備出各種各樣的變異體。例如，已知將人白細胞介素2 (IL-2)的氨基酸序列中的某個半胱氨酸殘基取代為絲氨酸的多肽仍然保持白細胞介素2的活性(Science，224，1431 (1984))。這種“具有變異的蛋白質”可通過“位點特異性突變”等公知方法制成。而且，已知某些種類的蛋白質具有對于活性非必需的肽區域。例如，存在于被分泌到細胞外的蛋白質中的信號肽或可在蛋白酶的前體等中發現的前序列等與其相當，大部分這些區域在翻譯后或向活性蛋白質轉換時被除去。這種蛋白質是以在一級結構上不同的形態存在，但最終具有與“由(A)的DNA編碼的蛋白質”基本等同功能的蛋白質。上述“由(B)的DNA編碼的蛋白質”就是為了定義這類蛋白質。

而且，本申請文件中所謂“多個氨基酸”表示在不喪失所述蛋白質的活性的范圍內可發生變異的氨基酸的數目，例如，為含有600個氨基酸殘基的蛋白質時，表示2 30個左右，優選2 15，更優選2 8個。由(B)的DNA編碼的蛋白質具有鱟來源的Pro-CE的活性。Pro-CE的活性，可通過使所述Pro-CE、合成底物(例如叔丁氧羰基-亮氨酰-甘氨酰-精氨酸-pNA(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA))、Et、C因子和B因子共存來研究其反應性，從而進行確認。具體而言，如果所述Pro-CE具有活性，由于通過使所述Pro-CE、合成底物、Et、C因子共存，pNA逐漸游離，因此通過對所述PNA的生成量進行吸光度測定可檢測了解。具體的方法請參照實施例2。這里使用的所謂“共存”只要是所共存物質達到相互接觸的狀態，則無特定限制。具體是指使之與這些所述Pro-CE，合成底物，Et，C因子和B因子相接觸，或達到與所述Pro-CE，合成底物，BG和G因子相互接觸的狀態。而且這里所用的“反應”是指通過使所述Pr0-CE與合成底物共存，所述Pro-CE轉化為CE，作用于合成底物，通過水解所述酰胺鍵游離pNA的反應。而且，有關前述(A)的編碼“含有序列號4所示氨基酸序列的蛋白質”的DNA，可例示由序列號3中I 1143號堿基所示的堿基序列定義的DNA。而且還可使用登錄于GenBank的登錄號為No. D161657的DNA。而且，有關前述(B)的編碼“含有序列號4所示氨基酸序列中I個或多個氨基酸缺失、取代、插入或移位了的氨基酸序列且具有鱟來源的凝固酶原活性的蛋白質”的DNA，可例示例如前述(A)的DNA或與所述DNA互補的DNA或與這些DNA在嚴緊條件下雜交的DNA。這里所謂“嚴緊條件”是指所謂形成特異性雜交體，不形成非特異性的雜交體的條件(Sambrook, J. et al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual, second Edition, ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989)等參照)。有關“嚴緊條件”，具體可例舉在含有 50% 甲酰胺、4XSSC、50mM HEPES (pH7. O),10 XDenhardt's solution、100 μ g/ml 鮭魚精子DNA的溶液中，于42°C下使之雜交，然后在室溫下用2XSSC、0. 1%SDS溶液、50°C下用
O.1XSSC、0. 1%SDS溶液進行清洗的條件。有關本發明的核酸，還優選再與編碼標記肽等的DNA相連。作為標記肽，可例舉例如蛋白質A、胰島素信號序列、Hi S-標簽、FLAG、CBP (I丐調蛋白(calmodulin)結合蛋白)、GST (谷胱甘肽-S-轉移酶)等。而且，本發明的核酸中還包括由上述(A)或(B)的DNA轉錄得到的RNA。本發明的核酸可在例如后述“本發明的病毒”的制備中使用，進而還可在本發明的細胞等的制備中利用。2.本發明的病毒本發明的病毒為含有本發明的核酸的病毒。對本發明的核酸的說明如前所述。本發明的病毒中的所謂“含有核酸”，只要含有所述核酸即可，再含有其它堿基或核酸也無妨。因此，不僅可 含有例如所述核酸，還可再含有編碼標記肽等的核酸等。例如，本發明的病毒還包含含有與“上述本發明的核酸中的(A)或(B)的DNA”和“編碼標記肽等的DNA”相連接的DNA的載體。所含有的核酸若設計成這樣，則存在著其可作為與標記肽等的融合蛋白表達，可容易地進行所述表達蛋白質的純化，檢測和分析等這樣的優點。有關標記肽，可例舉例如蛋白質A、胰島素信號序列、His-標簽、FLAG、CBP (鈣調蛋白結合蛋白)、GST (谷胱甘肽-S-轉移酶)等。例如，與蛋白質A的融合蛋白可通過使用結合了 IgG的固定相的親合層析簡便地進行純化。同樣，就與His標簽的融合蛋白來說，可使用結合了磁性鎳的固定相，就與FLAG的融合蛋白來說，可使用結合了抗FLAG抗體的固定相。另外，與胰島素信號的融合蛋白由于被分泌到細胞外(培養基等)，因此無需進行細胞破碎等提取操作。對本發明的病毒的制備方法無特定限制。制備本發明的病毒的方法的其中一例如下所示。更具體的方法請參照實施例。首先，制備編碼鱟來源的Pro-CE的核酸。所述核酸為前述(A)的DNA時，首先制備編碼“含有序列號4所示氨基酸序列的蛋白質”的DNA。而在使用前述(B)的DNA時，首先制備編碼“含有序列號4所示氨基酸序列中I個或多個氨基酸缺失、取代、插入或移位了的氨基酸序列且具有鱟來源的凝固酶原活性的蛋白質”的DNA。所述DNA只要是編碼各個指定蛋白質的DNA，則無特定限制。有關這些DNA，由于遺傳密碼簡并而存在各種不同的堿基序列，可使用含有其中任一種堿基序列的DNA。通過將這種核酸導入病毒，可制備本發明的病毒。
導入這種核酸的病毒只要是可在基因轉染中使用的病毒，則無特定限制。尤其優選桿狀病毒。其中也優選NPV。NPV只要是被分類為NPV的病毒，則無特定限制，例如可使用 AcNPV、蠶 NPV (Bombyx moriNPV、BmNPV)等。尤其優選 AcNPV。向病毒導入核酸可通過使用轉移載體的同源重組進行。對轉移載體的種類無特定限制，可例示例如PPSC8 (7。口亍4 >寸< 工社)、pFastBac ( 4 >匕卜口 y' 二 >社)、PVL1393 ( 7 r —彡> 工 >社)等，其中優選pPSC8。這些轉移載體還可使用市售品。對使用轉移載體的同源重組方法無特定限制。其具體一例請參照實施例。含有前述(A)或(B)的DNA的病毒是否被制備出來，可通過例如分析制備出的病毒的堿基序列，研究是否含有編碼鱟來源的Pro-CE的DNA，由所制備的病毒表達的蛋白質是否具有鱟來源的Pro-CE的氨基酸序列，由所制備的病毒表達的蛋白質是否具有Pro-CE的活性等進行確認。本發明的病毒在可在例如后述“本發明的細胞”的制備中使用，進而還可在本發明的方法等中利用。3.本發明的細胞本發明的細胞是攜帶本發明的病毒的細胞。對“本發明的病毒”的說明如前所述。這里所用的“細胞 ”只要是本發明的病毒可感染且可表達本發明的病毒所含有的鱟來源的Pro-CE的細胞即可。有關其中一例，可例舉源于昆蟲的細胞。而且，有關源于昆蟲的細胞，可例示Sf9細胞。對使細胞攜帶本發明的病毒的方法并無特定限制，例如在使用NPV作為病毒時，僅使本發明的病毒與細胞相接觸，即可使本發明的病毒感染所述細胞，從而使所述細胞攜帶本發明的病毒。其具體方法的其中一例請參照后述實施例。本發明的細胞由于具有制備鱟來源的Pro-CE的能力，因此以這些性質作為指標，選擇本發明的細胞。本發明的細胞可利用于例如后述本發明的制備方法等中。4.本發明的制備方法本發明的制備方法是鱟來源的Pro-CE的制備方法，其至少包括使本發明的細胞生長，并從其生長物中回收鱟來源的Pro-CE的步驟。“本發明的細胞”如前所述。本申請文件中所謂“生長”是包括轉化細胞的增殖、嵌合了轉化細胞的動物、昆蟲等的生長的概念。而且，這里所謂“生長產物”是包括使轉化細胞生長后的培養基(培養液上清)，經培養的細胞自身，來自嵌合了細胞的動物、昆蟲等中的分泌物、排出物等的概念。生長條件(培養基和培養條件等)只要是可使本發明的細胞生長，使鱟來源的Pro-CE得以制備的條件，則無特定限制，可根據所使用的載體和細胞等進行適當選擇。例如，有關培養溫度，可例示20 40°C左右。本發明的細胞的生長時間，還可根據所使用的本發明的細胞的量，所希望的Pro-CE的產量，其它的生長條件等適當調節。從生長物中回收鱟來源的Pro-CE的方法可由本領域技術人員，根據生長物的種類，從一般的方法中適當選擇并使用。
例如、Pro-CE以被分泌于培養基(培養液上清)中的可溶性形態產生時，可回收培養基，直接使用。而且，當Pro-CE以被分泌到細胞質中的可溶性形態或不溶性(膜結合性)形態產生時，通過使用氮氣蝕裝置的方法、均質化、玻璃珠粉碎法、聲波處理、滲透壓休克法、凍融法等通過細胞破碎進行的提取、表面活性劑提取、或它們的組合等處理操作，可提取這些Pro-CE，其提取物可直接作為Pro-CE使用。本發明的制備方法只要至少含有“使本發明的細胞生長，并從其生長物中回收鱟來源的Pro-CE的步驟”即可，但也可再含有其它步驟。例如，還可包括對所回收的Pro-CE再進行純化的步驟。純化可以是不完全純化(部分純化)，也可是完全純化，可根據Pro-CE的使用目的等適當選擇。有關純化方法，可具體例舉例如通過使用硫酸銨或硫酸鈉等進行的鹽析、離心分離、透析、超濾法、吸附層析、離子交換層析、疏水性層析、逆相層析、凝膠過濾法、凝膠浸透層析、親合層析、電泳法等，或它們的組合等處理操作。所制備的蛋白質是否由Pro-CE構成，是否保持鱟來源的Pro-CE的活性等，通過分析所回收的蛋白質的氨基酸序列，分子量，電泳結果，使用與Pro-CE特異性反應的抗體的蛋白質印記等可確認。如果根據本發明的方法，可極為有效地制備保持Pro-CE活性的蛋白質。5.本發明的酶本發明的酶是通過本發明的制備方法制備的Pro-CE。“本發明的制備方法”如前所述。本發明的酶可在后述本發明的方法I等中使用。
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6.本發明的方法I本發明的方法I是一種靈敏的Et檢測方法，其特征在于使待檢Et的被檢樣品與本發明的酶和“表現出通過與Et接觸而使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”共存，以伴隨本發明的酶轉化為CE的酶活性作為指標，對所述樣品中的Et進行檢測。“本發明的酶”如前所述。這里所用的所謂“共存”只要是所共存物質達到相互接觸的狀態，則無特定限制。例如，只要可使這些本發明的酶、待檢Et的被檢樣品和“表現出通過與Et接觸而使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”達到相互接觸的狀態，則無特定限制，可使之共存于溶液中，使Pro-CE或表現出通過與Et接觸使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體附著于適當的固定相上，使之與前述“表現出通過與Et接觸而使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”或Pro-CE接觸。而且，本發明的方法I中，“表現出通過與E t接觸而使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”優選為“表現出通過與活性C因子接觸而使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”和“鱟來源的C因子和/或重組C因子”。所述“表現出通過與活性C因子接觸而使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”還優選為鱟來源的B因子和/或重組B因子。可在本發明的方法I中使用的“C因子”和“B因子”只要保持其功能，則無特定限制。例如，可使用通過層析等純化源于中國當(Tachypleus tridentatus)、美洲當(LimulusPolyphemus)、馬來當(Tachypleus gigas)和圓尾當(Tachypleus rotundicauda)這 4 種鱟中的任一種的溶解物而獲得的天然的C因子成分、B因子成分，也可使用重組C因子、B因子。天然的C因子、B因子，可用結合了硫酸葡聚糖、硫代丙基等的載體或特異性吸附載體等處理溶解物，從而獲得C因子、B因子的成分。而且，就重組體而言，由于例如中國鱟(Tachypleus tridentatus)和圓尾當(Tachypleus rotundicauda)源的天然 C 因子的氨基酸序列是公知的，因此可適于基于這些序列制備。對所述方法無特定限制，例如可用如下方法獲得。可合成在C末端添加了 His-標簽的C因子的目的堿基序列，導入轉移載體(例如pPSC8、夕力5 才社制造)中，將獲得的表達載體(Factor C/pPSC8) DNA與桿狀病毒(AcNPV)DNA共轉染到Sf9細胞中，對從培養上清獲得的病毒液進行純化，再通過擴增制備。B因子也可用同樣的方法獲得。C因子和B因子，它們的氨基酸序列和其編碼基因都是已知的(C因子有市售，在后述實施例中公開了所述市售品。序列號15表示B因子基因的堿基序列。B因子的氨基酸序列示于序列號16)，這些因子的重組體可基于這些序列信息，用與上述本發明的酶基本相同的步驟制備。而且，只要是本領域技術人員就容易理解具有由于遺傳密碼的簡并而導致的公知的C因子的堿基序列與序列號15不同的堿基序列的堿基序列，在基于其制備的蛋白質具有C因子或B因子原來的作用的范圍內，其可以是本發明中可使用的C因子和B因子。有關使重構體系運作的條件，可例舉無需經過昆蟲細胞(作為反應的場所提供)，而在無細胞的體系中，為了至少順利地推進級聯反應的起動、絲氨酸蛋白酶前體的逐級活化和CE的反應，優選進行一定加熱，和以堿土類金屬(鈣、鍶、鋇、鈹、鎂等)、堿金屬(鋰、鈉、鉀等)為代表的金屬離子共存等。本發明的方法I中，有關級聯反應蛋白質，更優選僅使本發明的酶、重組C因子和重組B因子共存。

本說明書中使用的所謂“級聯反應”是指以下反應“1. ”和/或“2. ”；1.在溶解物中加入Et，存在于溶解物中的C因子(Et感受性因子、分子量123，000)被活化，生成的活性C因子通過對B因子(分子量64，000)的特定位點限制性水解從而生成活性B因子，活性B因子通過使Pro-CE (分子量54，000)活化而轉化為CE，CE通過對凝固蛋白原(凝固蛋白、分子量19，723)的由二硫鍵橋連的環內的特定位點，即…Arg18-Thr19…之間和…Arg46-Gly47…之間進行限制性水解,將H-Thr19…Arg46-OH所不的肽C(氨基酸28殘基)游離，同時將其余部分轉化為凝固蛋白凝膠的一系列反應。2.若在溶解物中加入BG，存在于溶解物中的G因子(BG感受性因子)被活化，活性G因子使Pro-CE得以活化，從而轉化為CE，對凝固蛋白原的由二硫鍵橋連的環內的特定位點進行限制性水解，從而生成凝固蛋白凝膠的一系列反應。而且所謂“級聯反應蛋白質”是指構成“級聯反應”的蛋白質。是指絲氨酸蛋白酶前體(C因子、B因子、G因子和Pro-CE)，具體在上述級聯反應“1. ”中是指C因子、B因子和Pro-CE，在“2. ”中是指G因子和Pro-CE。而且根據后述實施例可知，可在本發明的方法I中使用的通過基因工程方法獲得的各凝固因子其來源可不同。例如，還可通過包括使本發明的酶、圓尾鱟(Tachypleusrotundicauda)源的C因子和美洲當(Limulus Polyphemus)源的B因子共存的步驟來檢測Et0本發明的方法I可通過使用后述本發明的試劑盒I簡便地實施。
7.本發明的試劑盒I而且，本發明的試劑盒I是用于實施本發明的方法I的Et檢測試劑盒，其特征在于其組分至少含有本發明的酶和“表現出通過與Et接觸而使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”。“本發明的酶”如前所述。 而且，所述“表現出通過與活性C因子接觸而使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”優選為鱟來源的B因子和/或重組B因子。而且本發明的試劑盒I優選僅由作為級聯反應蛋白質的本發明的酶，重組C因子和重組B因子構成。本領域技術人員也可基于本發明的方法I適當利用本發明的試劑盒I。在本發明的試劑盒I中使用的“C因子”，“B因子”和“級聯反應”等用語的意思等與本發明的方法I中所使用的相同。并且如前所述，為了實施本發明的方法I所使用的試劑等，例如上述合成顯色底物(X-A-Y)、緩沖液、稀釋液、鹽、鱟的溶解物等，可根據通過本發明的試劑盒I實施的本發明的方法I的形式進行選擇，并包含于試劑盒的組成中。8.本發明的方法2而且本發明的方法2是BG檢測方法，其特征在于使待檢BG的被檢樣品與本發明的酶和“表現出通過與BG接觸使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”共存，以伴隨本發明的酶轉化為凝固酶的酶活性作為指標，對所述樣品中的BG進行檢測。“本發明的酶”如前所述。本發明的方法2的“表現出通過與BG接觸使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”優選為鱟來源的G因子和/或重組G因子。可在本發明的方法2中使用的“G因子”只要保持著其功能，則無特定限制。例如，還可使用通過層析等對源于4種鱟的任一種的溶解物進行純化而獲得的天然G因子成分，還可使用重組G因子。而且，就重組體G因子而言，G因子是由α亞單位和β亞單位構成的蛋白質，可按下述流程制備。首先制備編碼鱟來源的G因子的α亞單位的DNA。有關所述DNA，可例示例如登錄于GenBank的登錄號為No. 16622的DNA(17號序列，氨基酸序列為18號序列)。用BamHI/HindIII處理所述DNA，回收含有目的基因序列的DNA片段。對所述樣品進行平滑末端化處理后，與用NruI處理的pPSC8 (轉移載體)相混合，進行連接反應。然后用連接產物轉化大腸桿菌(E.coli) JM109，獲得轉化細胞。純化確認了目的大小片段的質粒。用篩選出的表達載體(G因子-a /pPSC8) DNA和桿狀病毒(AcNPV) DNA共轉染Sf9細胞。然后，從所述培養液上清中純化獲得的病毒液，再進行擴增。使所述病毒液感染expres SF+細胞，通過對培養液離心分離，獲得上清部分和沉淀部分。可從這些成分中獲得G因子的α亞單位。而且，對于β亞單位而言，可通過在獲得α亞單位的方法中，將使用的DNA取代為編碼鱟來源的G因子的β單位的DNA來獲得。而且，有關編碼β單位的DNA，還可使用例如登錄于GenBank的登錄號為No. 16623 (1 9號序列)的堿基序列或其氨基酸序列(20號序列)。而且，如果是本領域技術人員則容易理解的是具有由于遺傳密碼的簡并而導致的與序列號16和17不同的堿基序列的堿基序列，在基于其制備的蛋白質具有G因子原來的作用的范圍內，可以是本發明中可使用的G因子。
有關使重構體系運作的條件，可例舉無需經過昆蟲細胞(作為反應的場所提供)，在無細胞的體系中，為了至少順利地推進級聯反應的起動、絲氨酸蛋白酶前體的逐級活化和CE的反應，優選進行一定加熱，和堿土類、堿金屬等金屬離子共存等。而且本發明的方法2更優選僅使作為級聯反應蛋白質的本發明的酶和重組G因子共存。而且，與本發明的方法I 一樣，可使用來源相同的本發明的酶和重組G因子，也可組合不同來源的酶。本發明的方法2中使用的“共存”、“級聯反應”、“級聯反應蛋白質”等用語的意思與本發明的方法I中所使用的相同。本發明的方法2可在后述本發明的試劑盒2中利用。9.本發明的試劑盒2而且本發明的試劑盒2是用于實施本發明的方法2的BG檢測試劑盒，其特征在于其組分至少含有本發明的酶和“表現出通過與BG接觸使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶前體”。“本發明的酶”如前所述。本發明的試劑盒2中的“表現出通過與BG接觸使Pro-CE轉化為CE的活性的絲氨酸蛋白酶”優選為鱟來源的G因子和/或重組G因子。所述G因子為重組型更合適，有關本發明的試劑盒2的最適形式之一，可例示作為其構成而含有的G因子均為重組型的形式。即，有關包含于本發明的試劑盒2中的級聯反應蛋白質，更優選僅是本發明的酶、重組G因子。本領域技術人員 也可基于本發明的方法2適當利用本發明的試劑盒2。本發明的試劑盒2中使用的“G因子”與本發明的方法2中所使用的含義相同。而且，“級聯反應” “級聯反應蛋白質”與本發明的方法I中所使用的含義相同。而且，如前所述，為了實施本發明的方法2所使用的試劑等，例如上述合成顯色底物(X-A-Y)、緩沖液、稀釋液、鹽、鱟的溶解物等，可根據通過本發明的試劑盒2實施的本發明的方法2的形式進行選擇，并包含于試劑盒的組成中。
實施例以下通過實施例更具體說明本發明。實施例1.使用昆蟲細胞的Pro-CE的表達在轉移載體(pPSC8)中導入序列號3所示的cDNA (在序列號3的I 1125所示的堿基序列的C末端上添加了 His-標簽序列)(由九州大學大學院醫學研究院分子細胞生化學領域(現在，東北大學大學院生命科學研究科)的牟田達史博士贈與。所述cDNA是按前述非專利文獻2中記載的方法制備的)，篩選具有指定堿基序列的克隆。用篩選出的表達載體(PC/pPSC8) DNA和桿狀病毒(AcNPV) DNA共轉染Sf9細胞。從所述培養液上清中純化獲得的病毒液，再進行擴增。從感染了桿狀病毒的細胞中提取病毒DNA，再進行測序分析。使獲得的病毒液感染昆蟲細胞expresSF + (注冊商標工(ProteinScience)社制造)，使用蛋白質印記分析表達產物。以下，對這些步驟進行詳細說明。1.表達載體的構建向O. 2mL 的離心管中加入 PC/pUC118 (20ng/y g) I μ L,2. 5mM dNTP12 μ L、K0D 緩沖液 #15 μ L, 25mM 氯化鎂溶液 2 μ L, PC-F、PC-R (4pmol/ μ L)各 2· 5 μ L，KOD DNA 聚合酶(東洋紡社制造)I μ L和24 μ L滅菌的純水，并攪拌，進行PCR。在確認含有目的基因后，用TE緩沖液使總量達到16 μ L。在獲得的PCR產物中加入IOOmM ATP I μ LUOXBuffer I μ L和Τ4多核苷酸激酶(夕力9 才株式會社制造)，于37 溫育30分鐘。純化PCR產物后，與經Sma I處理的PPSC12相混合，進行連接反應。用連接產物轉化大腸桿菌(E. coli)JM109，獲得了轉化細胞(PC/pPSC12)。用Xbal/Bglll消化PC/pPSC12，回收含有目的基因的片段。將獲得的片段與用相同的酶處理的PPSC8相混合，進行連接反應。用連接產物轉化大腸桿菌(E. coli)JM109，獲得了轉化細胞。對確認了目的大小片段的質粒進行純化，確認其序列。在序列分析時，使用以下引物和ABI Prism Big Dye Terminator Cycle SequencingKit Ver. 3 (Applied Biosystems 社),在分析時使用自動測序儀 ABI Prism 310 GeneticAnalyzer (Applied Biosystems社)。引物序列示于序列表的5 10號序列。序列號5 :PC_F序列號6:PC_R序列號7:PSC2序列號8 PSC4序列號9 :PC 453/472-F序列號10 PC 683/664-R將確認插入了目的基因的克隆接種于含有50 μ g/mL氨芐青霉素的IOOmL的LB培養基中，于30°C過夜培養。回收增殖的菌體，按照Plasmid Midi Kit (QIAGEN社制造)的操作手冊純化質粒。

2.共轉染在接種于25cm2燒瓶中的1.0X IO6個Sf9細胞中加入2. 3 μ g含有編碼Pro-CE的cDNA 的表達載體，85ng 線性 AcNPV DNA 和含有 5 μ LLIPOFECTIN Reagent (Invitrogen 社制造)的無血清Sf-900II培養基(Invitrogen社制造)200 μ L0于28°C靜置6小時后，力口入無血清Sf-900II培養基使得培養液量達到5mL。再于28°C培養5天后，回收培養上清，并作為共轉染溶液。3.重組病毒的純化重組病毒的純化用溶菌斑測試法進行。具體的方法如下。將2. OX IO6個Sf9細胞接種于直徑為60mM的平皿中，于28°C靜置I小時，使細胞附著于底面上。用無血清Sf-900II培養基將前述共轉染溶液稀釋至104、IO5UO6和IO7倍，將ImL等份的這些溶液加入細胞，于室溫下平穩振蕩I小時。然后，除去平皿上清(病毒液)，灌入含有O. 5% SeaKemGTG瓊脂糖(BMA社制造)的無血清Sf-900II培養基4mL，于28°C靜置培養8天。在每個培養基中挑取6個不存在多角體(Polyhedra)的感染的昆蟲細胞的溶菌斑，各懸浮于ImL的無血清Sf-900II培養基中，作為病毒原液。4.重組病毒的增殖然后，進行重組病毒的增殖(重組病毒液的制作)。具體方法如下。在接種于25cm2燒瓶中的2. OX IO6個Sf9細胞中等份加入O. 5mL上述病毒原液，于28°C靜置培養I小時。加入無血清Sf-900II培養基使得培養液量達到5mL，靜置培養3天，作為第I代病毒液。
在接種于75cm2燒瓶中的6. O X IO6個Sf9細胞中全量加入第I代病毒液，于28°C靜置培養I小時。然后，加入IOmL無血清Sf-900II培養基，再培養3天。培養后，回收培養上清，于3，000 X g、4°C離心15分鐘，分成上清和沉淀兩部分。回收所述培養上清，作為第2代病毒液。5.重組病毒液的制作用無血清Sf-900II培養基將處于對數生長期的培養中的昆蟲細胞expresSF +稀釋成1. 5 X IO6個/mL的50mL于125mL的三角燒瓶中。在其中加入O. 5mL上述第2代病毒液，于130rpm，于28°C振蕩培養3天。培養后，于10，000 X g、4°C下將培養液離心30分鐘，分成上清和沉淀兩部分。回收所述培養上清，作為第3代病毒液。6.基因插入確認然后，確認DNA插入細胞。具體方法如下。將如上所述回收的第3代病毒液O. 7mL加入1. 5mL離心管中，加入等量的20%聚乙二醇，IM氯化鈉溶液，充分混合，靜置I小時。然后，于10，000 X g離心分離10分鐘，分成上清和沉淀兩部分。回收所述沉淀，按照QIAamp DNA Miki Kit (QIAGEN社制造)的操作手冊溶解于180yL Buffer ALT中，提取病毒DNA。以提取的病毒DNA作為模板，用以下的引物，如下述進行PCR。序列號11 PSC N3F序列號12 PSC N3R在O. 2mL的離心管中加入1“1^上述病毒0嫩，5“1^ KOD Plus的10XPCR緩沖液，5μ L 2mM dNTPs,2y L 2 5mM 硫酸鎂溶液，PSCN3F 和 PSCN3R 引物(4pmol/mL)各 3· 75 μ L，I μ L KOD-Plus-DNA聚合酶(東洋紡社制造)和19. 5 μ L滅菌的純水，充分攪拌。用所述溶液，通過重復進行30個“于94°C下I分鐘，于58°C下I分鐘，于72°C下4分鐘”這樣的循環，進行PCR。用瓊脂糖凝膠對10μ L的PCR產物進行電泳，確認了擴增片段的長度。對獲得了目的長度片段的PCR產物進行純化，確定N末端側和C末端側的序列。使用與前述“1. ”相同的試劑和儀器進行測序分析，使用如下引物。引物序列示于序列表的13號和14序列。序列號13 PSCNF2序列號14 PSC37.滴度測定將2. OX IO6個Sf9細胞接種于直徑為60mM的平皿中，于28°C靜置I小時，使細胞附著于底面上后，除去培養液。用無血清Sf-900II培養基將第3代病毒液稀釋至105、106、IO7和IO8倍，在平皿中等份加入ImL這些溶液，于室溫下平穩振蕩I小時。然后，去掉平皿上清(病毒液)，灌入4mL含有O. 5%SeaKemGTG瓊脂糖(BMA社制造)的無血清Sf-900II培養基，于28°C靜置培養7天。對每個培養基中所觀察到的溶菌斑進行計數，得出滴度。8.表達實驗用無血清Sf-900II培養基將昆蟲細胞expresSF+稀釋成1. 5X106個/mL，以每瓶IOOmL分裝到9個250mL的三角燒瓶中。向其中加入第3代病毒液使得分別達到MOI=O. 2、1、5(各3瓶)于130rpm，28°C下分別振蕩培養48、72、96小時。培養后，將培養液于3，000X g、4°C下離心20分鐘，分成沉淀和上清兩部分。
9.表達產物的確定對前述“8. ”中回收的樣品，按照常規方法進行SDS-PAGE。通過半干印記法將蛋白質轉到雜交膜上，在以下條件下進行蛋白質印記。而且，整合到病毒中的“編碼Pro-CE的DNA”被設計成以結合了 His-標簽的形式表達。樣品的處理對于上清，加入Laemmli樣品緩沖液(BI0-RAD社制造)，于99°C熱處理3分鐘。對于沉淀，在相當于200 μ L的沉淀中加入400 μ L的PBS懸浮后，加入Laemmli樣品緩沖液，于99°C熱處理3分鐘。 樣品用量20 μ L/泳道。SDS-PAGE凝膠濃度使用10 20%凝膠(BIO-RAD社制造)。SDS-PAGE 凝膠通電 150V、CV。雜交膜使用PVDF。雜交通電15V、CV、30分鐘。一級抗體使用五組氨酸抗體(Penta、His Antibody) (QIAGEN社制造)。二級抗體使用山羊抗小鼠IgG (H+L)-HRP綴合物(BIO-RAD社制造)。檢測使用免疫印跡熒光素HRP底物(Milipore社制造)。10.結果重組病毒的目的序列的測序分析結果示于圖1。上半部分表示分析結果，下半部分表示Pro-CE的序列。由此清楚了重`組病毒中Pro-CE的N末端，C末端的序列一致。由此確認了重組病毒中存在編碼Pro-CE的DNA的堿基序列。而且，滴度測定的結果為O. 7X108pfu/mL。前述“9. ”的結果是，在目的位置(約40kDa附近)確認了與抗His-標簽抗體反應的條帶(圖2)。圖2的M為分子量標記，48，72，96分別表示48小時感染區、72小時感染區、96小時感染區，S表示未感染病毒區，A表示野生型病毒感染區。由此確認了 Pro-CE的表達。實施例2.重組Pro-CE的活性確定用無血清Sf-900II培養基將昆蟲細胞expresSF+稀釋成1. 5X106個/mL，以每瓶IOOmL分裝到9個250mL的三角燒瓶中。向其中加入第3代病毒液使得分別達到MOI=O. 2、
1、5 (各3瓶)，于130rpm、28°C下分別振蕩培養48、72、96小時。培養后，于3，000Xg、4°C下將培養液離心20分鐘，分成沉淀和上清兩部分。將上清冷凍保存。樣品I Μ0Ι=0. 2，48 小時樣品2 Μ0Ι=0. 2，72 小時樣品3 Μ0Ι=0. 2，96 小時樣品4 M0I=1,48 小時樣品5 :M0I=1，72 小時樣品6 M0I=1,96 小時樣品7 :M0I=5，48 小時樣品8 M0I=5, 72 小時樣品9 M0I=5,96 小時樣品10 :未感染病毒細胞
樣品11 :野生型病毒感染細胞(試劑)DS-3GII成分源于當血球提取液的G因子(通過硫酸葡聚糖Sepharose CL-6B(以下DS-Sepharose)獲得的成分純化產物)DS-1OAII成分源于鱟血球提取液的Pro-CE (DS-Sepharose純化產物)BG :用蒸餾水1. 495mL溶解CSBG (1495ng/vial)后，進行10倍連續稀釋。1.使用上清部分和G因子的BG濃度為I 100ng/mL下的反應性首先，對上述9個樣品的上清，研究所表達的蛋白質是否保持著Pro-CE的活性。用含有150mM NaCl的50mL Tris-HCl緩沖液(pH7. 5)將培養后的上清部分各稀釋10倍。在所述稀釋物(各25 μ L)中加入DS-3GII成分(25 μ L)、葡聚糖(終濃度2. 4%)，Tris-HCl 緩沖液(ρΗ8. O)(終濃度 80mM), MgSO4 (終濃度 64mM), CaCl2 (終濃度 O. 4mM),Na2SO4 (終濃度8mM)，注射用蒸餾水(15 μ L)，Boc-Leu-Gly-Arg-pNA底物(參照前述專利文獻I)(終濃度O. 24mM)和25 μ L BG溶液(O、1、10、100ng/mL)，總容量達到125 μ L，然后移至Wellreader SK603中，于37°C下使之反應2小時后，自動測定405nm波長(對照波長492nm)下的吸光度。而且，作為陽性對照，使用DS-1OAII成分。做兩次平行實驗，計算出吸光度的平均值。其結果示于圖3，4和表I中。表I
權利要求
1.編碼鱟來源的凝固酶原的核酸。
2.權利要求1所述的核酸，其中所述當選自中國當(Tachypleustridentatus)、美洲當(Limulus Polyphemus)、馬來當(Tachypleus gigas)和圓尾當(Tachypleusrotundicauda)。
3.權利要求1所述的核酸，其中所述編碼鱟來源的凝固酶原的核酸選自以下(A) (C) (A)編碼含有序列號4所不氣基酸序列的蛋白質的DNA、 (B)編碼“含有序列號4所示氨基酸序列中I個或多個氨基酸缺失、取代、插入或移位了的氨基酸序列且具有鱟來源的凝固酶原活性的蛋白質”的DNA、 (C)由上述(A)或(B)的DNA轉錄得到的RNA。
4.權利要求1所述的核酸，其中所述編碼鱟來源的凝固酶原的核酸選自以下(a) (C) Ca)含有序列號3的堿基序列I 1143所示的堿基序列的DNA、 (b)具有下述特征的DNA:在含有序列號3的堿基序列I 1143所示的堿基序列的堿基序列上，具有使由所述堿基序列編碼的蛋白質的氨基酸序列中I個或多個氨基酸缺失、取代、插入或移位的堿基變異，且所表達的蛋白質具有鱟來源的凝固酶原活性， (c)由上述(a)或(b)的DNA轉錄得到的RNA。
5.帶有權利要求1 4中任一項所述的核酸的病毒。
6.權利要求5所述的病毒，其中所述病毒為桿狀病毒。
7.權利要求6所述的病毒，其中所述桿狀病毒為核型多角體病毒。
8.攜帶權利要求5 7中任一項所述的病毒的細胞。
9.權利要求8的細胞，其中所述細胞為昆蟲來源的細胞。
10.制備鱟來源的凝固酶原的方法，其至少包括使權利要求8或9所述的細胞生長，并從其生長物中回收鱟來源的凝固酶原的步驟。
11.根據權利要求10的方法制備的凝固酶原。
12.內毒素檢測方法，其特征在于使待檢測內毒素的被檢樣品與權利要求11所述的凝固酶原和“表現出通過與內毒素接觸使凝固酶原轉化為凝固酶的活性的絲氨酸蛋白酶前體”共存，以伴隨凝固酶原轉化為凝固酶的酶活性作為指標，對所述樣品中的內毒素進行檢測。
13.權利要求12所述的內毒素檢測方法，其特征在于“表現出通過與內毒素接觸使凝固酶原轉化為凝固酶的活性的絲氨酸蛋白酶前體”是“表現出通過與活性C因子接觸使凝固酶原轉化為凝固酶的活性的絲氨酸蛋白酶前體”和鱟來源的C因子和/或重組C因子。
14.權利要求13所述的內毒素檢測方法，其特征在于“表現出通過與活性C因子接觸使凝固酶原轉化為凝固酶的活性的絲氨酸蛋白酶前體”是鱟來源的B因子和/或重組B因子。
15.權利要求12 14中任一項所述的內毒素檢測方法，其特征在于僅使作為級聯反應蛋白質的權利要求11所述的凝固酶原、重組C因子和重組B因子共存。
16.用于實施權利要求12所述的檢測方法的內毒素檢測試劑盒，其特征在于其組分至少含有權利要求11的凝固酶原和“表現出通過與內毒素接觸使凝固酶原轉化為凝固酶的活性的絲氨酸蛋白酶前體”。
17.權利要求16所述的內毒素檢測試劑盒，其特征在于“表現出通過與內毒素接觸使凝固酶原轉化為凝固酶的活性的絲氨酸蛋白酶前體”是“表現出通過與活性C因子接觸使凝固酶原轉化為凝固酶的活性的絲氨酸蛋白酶前體”和鱟來源的C因子和/或重組C因子。
18.權利要求17所述的內毒素檢測試劑盒，其特征在于“表現出通過與活性C因子接觸使凝固酶原轉化為凝固酶的活性的絲氨酸蛋白酶前體”是鱟來源的B因子和/或重組B因子。
19.權利要求16 18中任一項所述的內毒素檢測試劑盒，其特征在于其組分僅含有作為級聯反應蛋白質的權利要求11所述的凝固酶原、重組C因子和重組B因子。
20.(I — 3)-β-D-葡聚糖檢測方法，其特征在于使待檢測(I — 3)-β-D-葡聚糖的被檢樣品與權利要求11的凝固酶原和“表現出通過與(I — 3)-β -D-葡聚糖接觸使凝固酶原轉化為凝固酶的活性的絲氨酸蛋白酶前體”共存，以伴隨凝固酶原轉化為凝固酶的酶活性作為指標，對所述樣品中的(I — 3)-β-D-葡聚糖進行檢測。
21.權利要求20所述的(I—3)-β-D-葡聚糖檢測方法，其特征在于“表現出通過與(I — 3)-β- -葡聚糖接觸使凝固酶原轉化為凝固酶的活性的絲氨酸蛋白酶前體”是鱟來源的G因子和/或重組G因子。
22.權利要求20或21的(I—3)-β-D-葡聚糖檢測方法，其特征在于僅使作為級聯反應蛋白質的權利要求11所述的凝固酶原和重組G因子共存。
23.用于實施權利要求20所述的檢測方法的(I—3)-β-D-葡聚糖檢測試劑盒，其特征在于其組分至少含有權利要求11所述的凝固酶原和“表現出通過與(I — 3)-β -D-葡聚糖接觸使凝固酶原轉化為凝固酶的活性的絲氨酸蛋白酶前體”。
24.權利要求23所述的(I—3)-β-D-葡聚糖檢測試劑盒，其特征在于“表現出通過與(1 — 3)-13-D-葡聚糖接觸使凝固酶原轉化為凝固酶的活性的絲氨酸蛋白酶前體”是鱟來源的G因子和/或重組G因子。
25.權利要求23或24所述的(I— 3) - β -D-葡聚糖檢測試劑盒，其特征在于其組分僅含有作為級聯反應蛋白質的權利要求11所述的凝固酶原和重組G因子。
全文摘要
本發明提供可穩定、廉價、大量制備具有一定品質的用于測定(1→3)-β-D-葡聚糖和內毒素的試劑的編碼鱟來源的凝固酶原的DNA，含有所述DNA的病毒，攜帶所述病毒的細胞和使用所述細胞制備凝固酶原的方法，以及使用所述酶測定(1→3)-β-D-葡聚糖和內毒素的方法。本發明中選擇編碼包含例如序列號4所示的氨基酸序列的蛋白質的DNA等作為編碼鱟來源的凝固酶原的核酸，基于所述DNA得到了重組體形式的所述凝固酶原。通過使用所得到的酶，并利用鱟的溶解物的級聯系統元件，可得到對(1→3)-β-D-葡聚糖和內毒素的靈敏的檢測方法和檢測試劑盒。
文檔編號C12N5/10GK103060349SQ20121027273
公開日2013年4月24日 申請日期2007年7月6日 優先權日2006年7月7日
發明者田村弘志, 高橋昭治 申請人:生化學工業株式會社