以纖維素為碳源發酵制備中長鏈聚羥基脂肪酸酯的方法
【專利摘要】本發明涉及微生物發酵【技術領域】，具體涉及一種以纖維素為碳源發酵制備中長鏈聚羥基脂肪酸酯（PHAMCL）的方法，其主要技術特征為：構建了一株包含聚羥基脂肪酸酯合成酶基因phaC1的大腸桿菌重組工程菌，在含有纖維素的培養基中發酵，得到中長鏈聚羥基脂肪酸酯。本發明進一步涉及一種生物燃料中長鏈羥基脂肪酸甲酯（3HAME）的制備方法，由中長鏈聚羥基脂肪酸酯在水解酶催化下醇解獲得。該方法原料纖維素價格低廉，PHAMCL表達量可達7.8g/L以上，3HAME燃燒熱達35.5MJ/kg，可以替代石油資源，具有良好的應用前景。
【專利說明】以纖維素為碳源發酵制備中長鏈聚羥基脂肪酸酯的方法
[0001]【技術領域】:
本發明涉及微生物發酵【技術領域】，具體地本發明涉及以纖維素為碳源發酵制備中長鏈聚羥基脂肪酸酯的方法。
[0002]【背景技術】:
聚羥基脂肪酸酯(PHA, polyhydroxyalkanoates),是近20多年迅速發展的生物高分子材料，是微生物合成的一種細胞內聚酯。具有良好的生物相容性、生物可降解性和塑料的熱加工性能，可作為生物醫用材料和生物可降解包裝材料。PHA還具有非線性光學性、壓電性、氣體相隔性等高附加值性能。研究發現，PHA可以作為生物燃料的原料，是一種比較理想的石油替代品。PHA可分為短鏈PHA和中長鏈PHA。短鏈PHA (PHAsa),含C4-C5單體，以PHB(聚三羥基丁酸酯，Poly-3-hydroxybutyrate)為代表,硬度高可塑性低。含6_14個碳原子的中等鏈長的PHA (PHAmcl)是結晶度很低的彈性體，在藥物釋放及組織工程等方面具有很廣闊的應用前景。
[0003]目前聚羥基脂肪酸酯的生產主要是以發酵法為主，但普遍存在成本高或產率低的問題。利用工業廢水和城市廢水中豐富的有機物做碳源生產PHA可降低原料費用，但是產率太低。以葡萄糖為原料制備PHB，原料成本較高，工業生產仍受限制，目前，市場上PHB價格大約為20美元/千克，為普通石化塑料的10倍，因此，PHB還無法與石化塑料相競爭。
[0004]假單胞菌在各種研究過的微生物中合成PHAm能力最強，可以利用多種相關碳源和非相關碳源大量合成和積累的PHA，常用的底物有丙烯酸、葵酸及相應的鹽、葡萄糖、淀粉、生活污水等。目前認為細菌PHA合成酶分為3類，第I類以R.eutropha為代表的PHAm合成酶phaC ;第2類以P.0leovorpha和P.aeruginosa為代表的ΡΗΑΜα的合成酶phaCl和phaC2 ;第 3 類以 Chromatium vinosum和 Tiio-capsia vioiacae 為代表的 PHA合成酶phaC和phaE。以門多薩假單胞菌合成酶基因ph`aCl，利用大腸桿菌表達載體構建基因工程菌，以添加辛酸的LB培養基發酵，制備中長鏈聚羥基脂肪酸酯，產物由3-羥基己酸和3-羥基辛酸兩種單體組成，但是產量還較低。將phaCl基因構建到大腸桿菌JMU193染色體上，獲得高產穩定表達菌株；對宿主細胞進一步改造，雙敲除fadR和fadB/fadA，得到ΡΗΑΜα含量可達細胞干重的30% ;近期研究表明，在大腸桿菌中共表達paaG、paaF和ydbU，可提高產物量至0.37 g/L、0.25 g/L、0.33 g/L，帶有fadB基因的WBlOl菌株，以癸酸鈉為碳源，表達外源phaC2基因，可得到兩倍量ΡΗΑΜα。
[0005]纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，是植物細胞壁的主要成分，是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖，占植物界碳含量的50%以上。纖維素作為一種廉價碳源，是世界上最豐富的可再生自然資源，我國每年僅作物秸桿的纖維產量就可達2億噸以上。已有利用纖維素制備生物乙醇、丁醇等生物燃料的應用。目前還未見以纖維素為碳源發酵制備中長鏈聚羥基脂肪酸酯的報道。
[0006]當脂肪酸碳鏈長度為12-18C時，其甲酯就是生物柴油的基本成分。中長鏈羥基脂肪酸甲酯(3ΗΑΜΕ)是一種新型的生物燃料，對其研究和開發剛剛開始，有人利用酸催化的水解方法，把PHB和MCL PHA分別轉化為3-羥基丁酸甲酯(3ΗΒΜ)和中長鏈羥基脂肪酸甲酯(MCL HAM)，燃燒熱值分別為19.43KJ/kg、36.5KJ/kg (羅容聰，汕頭大學碩士論文，2008)。但是利用水解酶和氫氧化鉀催化醇解的研究還未見報道。
[0007]
【發明內容】
: 針對目前ΡΗΑΜα發酵制備成本高、收率低的問題，本發明提供一種以廉價纖維素為碳源發酵生產中長鏈聚羥基脂肪酸酯的方法。
[0008]本發明的另一個目的是提供利用中長鏈聚羥基脂肪酸酯制備生物燃料中長鏈羥基脂肪酸甲酯(3ΗΑΜΕ)的方法。
[0009]為實現上述目的，本發明采用的技術解決方案如下:
1、中長鏈聚羥基脂肪酸酯PHAm發酵制備:
(I)構建包含聚羥基脂肪酸酯合成酶基因PhaCl的重組工程菌；phaCl基因來源于油田土壤分離出的銅綠假單胞菌，重組工程菌為大腸桿菌重組工程菌。
[0010](2)—定發酵條件下，重組工程菌在以纖維素為碳源的培養基中發酵；培養基中纖維素質量百分含量為0.1~10.0%，優選百分含量0.5~3.0%，發酵溫度30~37°C，采用分批培養的方式。
[0011](3)發酵產物過濾菌體后，用溶劑I萃取，除去溶劑I后，再用溶劑2重結晶，得到產物ΡΗΑΜα。溶劑I選自二氯甲烷、四氯化碳、乙醚，溶劑2選自甲醇、乙醇、乙二醇。
[0012]2、由中長鏈聚羥基脂肪酸酯(ΡΗΑΜα)制備生物燃料中長鏈羥基脂肪酸甲酯(3ΗΑΜΕ):中長鏈聚羥基脂肪酸酯(PHAm)在催化劑作用下，在醇類溶劑與水的混合溶劑中反應10~30h。催化劑為分解酶IP0-701、或氫氧化鉀。醇類溶劑為甲醇、或乙醇、或乙二醇。
[0013]本發明所提供的以纖維素為碳源，含PHAm合成酶基因phaCl的大腸桿菌重組工程菌發酵制備中長鏈聚羥基脂肪酸酯，與現有技術相比，具有如下優點:本發明以廉價纖維素為碳源，大大降低了 PHAsn的生產成本，使ΡΗΑΜα的大規模工業化生產成為可能。本發明產物收率高，優選條件下，纖維素轉化率97%，產物表達量7.5g/L，醇解率98%，中長鏈羥基脂肪酸甲酯(3HAME)含量98.5%，燃燒熱35.5MJ/kg。
[0014]【具體實施方式】:
下面結合具體的實施例，對本發明作進一步的闡述，但不限于這些具體的實施例，而所有的實施例均按上述的操作步驟操作。
[0015]實施例1 質粒及菌株:
克隆載體pBluescript SK_,大腸桿菌E.Coli JMlO 9購自商業公司；
限制性內切酶，Taq酶，T4 DNA連接酶均購自大連寶生物公司。其他化學試劑為國產分析純化學試劑。
[0016]培養基:
PHA合成菌分離培養基:蒸懼水1000mL,牛肉膏IOg,蛋白胨10g,NaCl 5g,葡萄糖20g,瓊粉 15g，ΡΗ7.0，0.IMPa 滅菌 15min。冷卻至 45°C~50°C，加入尼爾紅(Nile Red) 2mL/L(0.25mg Nile Red溶于IOOmL 二甲基亞砜),無菌條件下倒入培養皿,冷卻后備用；
磷酸鹽緩沖溶液:蒸餾水 1000mL, Na2HPO4.Iffi2O 8.95g，KH2PO4 1.5g，PH 7.0 ；0.1MPa高壓蒸汽滅菌，15~20min,備用；基因工程菌富集培養為LB培養基；
發酵培養基為添加0.8%纖維素半水解物的LB培養基，以丙烯酸作為基因工程菌脂肪酸β氧化抑制劑，必要時加入50 μ g/L的氨芐青霉素。
[0017]菌種分離鑒定:
本試驗菌株系本公司采用尼耳紅(Nile Red)熒光染色分離自山東勝利油田土壤，取長期浸于原油中的土壤。以無菌生理鹽水稀釋1000倍，將該土壤懸濁液1.0mL涂布于PHA合成菌分離培養基，于30°C~35°C培養5d~6d。菌落出現后，以ZF-2型三用紫外分析儀312nm波長照射，呈現橘紅色熒光菌落者即為ΡΗΑΜα合成菌。
[0018]PHAmcl合成酶phaCl基因的獲得與重組質粒的構建:
通過對中長鏈PHA合成酶phaCl進行序列分析,設計了保守引物:primer-olf:
5' -CCACGACAGCGGCCTGTTCACCTG-3'，primer-prz:5'-GTCGTCGTCACCGGCCAGCACCAG-3'，以新抗假單胞菌基因組DNA為模版擴增得到一個大的片段，從中分析得到ΡΗΑΜα合成酶基因1680bp大小的開放閱讀框，根據獲得的序列設計PHAm合成酶基因phacl的擴增引物，在上下游分別引入了 XbaI 和 EcoRI 位點:primer-f:5' -GGGGCTCTAGAAAGCGACTCAG-GACATTGGA-3'，primer-r:5'-CCCCGGAATTCTTCTGCGGTTGAGGTGGATG-3'。對 pBluescript SIT 和 PCR擴增產物進行XbaI和EcoRI雙酶處理，回收后在T4DNA連接酶作用下16°C連續過夜，以備轉化。
[0019]PCR 擴增:97°C預變性 10min，94°C變形 60s，58°C退火 30s，72°C延伸 60-120s，30個循環后72°C延伸IOmin。
[0020]將phaCl基因和載體質粒pBluescript SIT同時進行XbaI和EcoRI雙酶切，酶切后利用T4連接酶將phaCl基因連接到質粒pBluescript SIT中，得重組質粒pSK-phaCl。
[0021]大腸桿菌感受態細胞的制備與轉化:
采用鈣法制備大腸桿菌感受態細胞并進行轉化，轉化后接于ImlLB培養集中36°C、150r/min振蕩培養2h,均勻涂布于含有氨節青霉素的LB平板上篩選重組大腸桿菌。篩選得到的菌株利用菌落PCR和限制性內切酶酶切重組質粒驗證重組子。
[0022]重組大腸桿菌發酵生產PHAMCl:
-70°C保藏的重組大腸桿菌在LB培養基平板上活化，以滅菌牙簽挑取單菌落接于20mlLB培養基中，36°C培養過夜，以2%的接種量接種于發酵培養基中，加入ImmoI/L的IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)誘導phaCl的表達，以0.2g/L丙烯酸抑制脂肪酸β氧化，為？撤^合成提供(R)-3-羥基脂肪酸輔酶A前體，發酵培養72h。采取補料分批發酵的方式逐次加入纖維素半水解物底物。
[0023]發酵產物的分離:發酵收獲后，收集菌體，過濾絲狀菌體，用二氯甲烷為萃取劑，在60°C水浴攪拌加熱2h。以旋轉蒸發儀濃縮去除萃取劑，再用甲醇重結晶，白色沉淀即為ΡΗΑΜα。纖維素轉化率97%，產品含量98%，產物表達量7.8g/L。
[0024]PHAm的醇解:最佳醇解條件分別為:在35°C下，以甲醇和水為溶劑，分解酶IPA-750為催化劑，？撤^與甲醇反應時間16h。醇解結束后，先收集分解酶再蒸出大部分的剩余甲醇后，從水中析出產物即為3HAME。醇解率98%，含量98.5%，3HAME燃燒熱35.5MJ/kg ο
[0025]實施例2培養基和重組大腸桿菌工程菌構建同實施例1。
[0026]發酵培養基為添加0.1%纖維素半水解物的LB培養基。
[0027]重組大腸桿菌發酵生產ΡΗΑΜα:
-70°C保藏的重組大腸桿菌在LB培養基平板上活化，以滅菌牙簽挑取單菌落接于20mlLB培養基中，30°C培養過夜，以1.5%的接種量接種于發酵培養基中，加入1.5mmol/L的IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)誘導phaCl的表達，以0.2g/L丙烯酸抑制脂肪酸β氧化，為PHAm合成提供(R)-3-羥基脂肪酸輔酶A前體，發酵培養48h，采取補料分批發酵的方式逐次加入纖維素半水解物底物。
[0028]發酵產物的分離:發酵收獲后，收集菌體，過濾絲狀菌體，用四氯化碳為萃取劑，在60°C水浴攪拌加熱2h。以旋轉蒸發儀濃縮去除萃取劑，再用乙二醇重結晶，白色沉淀即為ΡΗΑΜα。纖維素轉化率95%，產品含量97%，產物表達量8.lg/L。
[0029]PHAmcl的醇解:在30°C下，以乙醇和水為溶劑，氫氧化鉀為催化劑，ΡΗΑΜα與甲醇在80°C下反應8~10h，然后先蒸出大部分甲醇后，加入水洗滌無機雜質等，再析出3HAME。醇解率91.6%,含量95.4%ο
[0030]實施例3
培養基和重組大腸桿菌工程菌構建同實施例1。
[0031 ] 發酵培養基為添加7.0%纖維素半水解物的LB培養基。
[0032]重組大腸桿菌發酵生產PHAmcl:
-70°C保藏的重組大腸桿菌在LB培養基平板上活化，以滅菌牙簽挑取單菌落接于20mlLB培養基中，37°C培養過夜，以2%的接種量接種于發酵培養基中，加入ImmoI/L的IPTG誘導phaCl的表達，以0.2g/L丙烯酸抑制脂肪酸β氧化，為？撤【合成提供(R)_3_羥基脂肪酸輔酶A前體，發酵培養72h，采取補料分批發酵的方式逐次加入纖維素半水解物底物。
[0033]發酵產物的分離:發酵收獲后，收集菌體，過濾絲狀菌體，用乙醚為萃取劑，在60°C水浴攪拌加熱2h。以旋轉蒸發儀濃縮去除萃取劑，再用乙醇重結晶，白色沉淀即為ΡΗΑΜα。纖維素轉化率77.2%，產品含量86.5%，產物表達量8.5g/L。
[0034]PHAmcl的醇解:在37°C下，以乙二醇和水為溶劑，分解酶IPA-750為催化劑，反應時間10h，醇解結束后，先收集分解酶再蒸出大部分的剩余甲醇后，從水中析出產物。醇解率82.6%，含量 91.1%。
【權利要求】
1.一種中長鏈聚羥基脂肪酸酯(ΡΗΑΜα)的制備方法，包括以下步驟: (O構建包含聚羥基脂肪酸酯合成酶基因PhaCl的重組工程菌； (2)一定發酵條件下，重組工程菌在以纖維素為碳源的培養基中發酵； (3)發酵產物過濾菌體后，用溶劑I萃取，除去溶劑I后，再用溶劑2重結晶，得到產物PHAmcl。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)所述的PhaCl基因來源于油田土壤分離出的銅綠假單胞菌，重組工程菌為大腸桿菌重組工程菌。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:培養基中纖維素質量百分含量為0.1~10.0%。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的發酵條件為:發酵溫度30~37°C，采用分批培養的方式。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的溶劑I選自二氯甲烷、四氯化碳、乙醚，溶劑2選自甲醇、乙醇、乙二醇。
6.一種根據權利要求1所述中長鏈聚羥基脂肪酸酯(PHAsn)制備生物燃料中長鏈羥基脂肪酸甲酯(3HAME)的方法，其特征在于:中長鏈聚羥基脂肪酸酯(ΡΗΑΜα)在催化劑作用下，在醇類溶劑與水的混合溶劑中反應10~30h。
7.根據權利要求7所述的方法，其特征在于:所述的催化劑為分解酶IP0-701、或氫氧化鉀。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于:所述的醇類溶劑為甲醇、或乙醇、或乙二`醇。
【文檔編號】C12R1/385GK103571894SQ201210279029
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月8日 優先權日:2012年8月8日
【發明者】不公告發明人 申請人:徐州瑞賽科技實業有限公司