一種生產正己醇工程菌的構建方法
【專利摘要】本發明涉及一種生產正己醇的工程菌，其特點為包含梭菌屬Fe-氫酶基因hydA（GenBank登錄號：EU590683）和地衣芽孢桿菌β-葡聚糖酶基因lic（GenBank登錄號：AY225317）的重組基因hyd-lic構建的大腸桿菌工程菌。制備方法包括：hydA基因和lic基因分別克隆、PCR擴增，在連接酶作用下連接成為重組DNA的基因hyd-lic，連接到載體pTE28aT7，得到質粒pTE28aT7-hyd-lic，轉化P.pastoriskM71感受態細胞，搖瓶發酵得到高產正己醇工程菌，以纖維素半水解物為底物發酵生產正己醇。本發明的工程菌酶活達83U/mL，發酵產物正己醇含量最高可達35g/L。
【專利說明】—種生產正己醇工程菌的構建方法
[0001]【技術領域】:
本發明涉及微生物發酵【技術領域】，具體地，本發明涉及一種生產正己醇工程菌的構建方法。
[0002]【背景技術】:
正己醇是一種重要的醫藥、農藥和香料中間體。近年來研究發現它也是一種理想的液體生物燃料，其燃燒熱12402千卡/kg，比0#柴油的燃燒熱9600千卡/kg高2805千卡/kg，是未來柴油的優良替代品，可以替代礦物燃料。工業正己醇的合成通常是采用乙烯催化控制聚合后，再水解、分離而得，還可由正己酸乙酯還原而得。
[0003]目前已能利用生物發酵法制備乙醇、正丁醇、1，3-丙二醇等低碳醇，但是利用生物發酵法制備正己醇的技術還比較少見。美國齊凱姆公司發明了一種間接制備正丁醇和正己醇的方法，在包含碳水化合物源的培養基中進行同型產乙酸發酵得到乙酸酯、乙酸及其混合物，將其中一部分化學轉化為乙醇，一部分和乙醇培養基中產酸發酵制備丁酸酯、丁酸、己酸酯、己酸或其混合物，再將其化學轉化為丁醇和己醇。采用該方法，可以有70 %的碳源轉化為了丁醇和己醇，但是該方法操作過程繁瑣，且正己醇選擇性并不高(丹.W.沃瑟，CN200980112342.X)。本地生物，如Clostridium Kluyveri,已報道發酵乙醇和醋酸纖維素，不僅產生丁酸、己酸、H2，還產生正丁醇和正己醇，但是，并沒有對生物合成正己醇的酶進行定義。張等報道了正己醇合成，通過延伸Atsumi等開發的2-酮酸合成路徑，大腸桿菌催化從葡萄糖合成正己醇。 Liao研究小組等人通過設計具有NAPH和乙酰CoA驅動力的正丁醇人工途徑，獲得新型大腸桿菌合成細胞工廠，正丁醇產量可達30g/L。美國科學家通過引入六碳化合物的合成酶Bktb (β-ketothiolase)，延長改造正丁醇人工合成路徑，開發出一種新型的正己醇合成細胞工廠，即乙酰輔酶A工程菌正丁醇路徑合成正己醇，大腸桿菌工程菌催化，從葡萄糖直接合成正己醇，并初步研究了己醇合成酶及其影響因素(YasumasaDekishimaj Ethan 1.Lanj Claire R.Shenj et.al, Journal of the American ChemicalSociety, 2011,133:11399-11401)。但是目前由于Bktb酶活不高造成正己醇合成途徑碳流較低，使得合成細胞工廠產物仍以正丁醇為主。后期計劃通過定向改造Bktb，提高胞內己醇前體物酮基己酰CoA和可用NADH的量來進一步增加正己醇的生產。
[0004]過去一直沒有微生物能由葡萄糖合成高級醇類，現在研究人員已能通過基因工程手段對大腸桿菌進行改造，使其能夠從葡萄糖合成長鏈醇類，包括異丁醇、2-甲基-1-丁醇或3-甲基-1-丁醇。我們認為，可以通過選擇性地操縱基因，設計微生物，以合成許多不同的燃料和化學品。本發明利用基因工程方法，將梭菌屬Fe-氫酶基因hydA (GenBank登錄號:EU590683)和地衣芽孢桿菌β -葡聚糖酶基因lie (GenBank登錄號:ΑΥ225317)的重組基因hyd-lic插入大腸桿菌構建了正己醇合成工程菌。
[0005]
【發明內容】
:
本發明提供了一種生產正己醇工程菌的構建方法。
[0006]為實現上述目的，本發明采用的技術解決方案如下:
設計引物，pUC19-hydA質粒和pUCm-T_lic質粒分別PCR擴增,在連接酶作用下連接成為重組DNA的基因hyd-lic，
hyd-lic 連接到載體 pTE28aT7，得到質粒 pTE28aT7-hyd_lic，
質粒pTE28aT7-hyd_lic轉化至宿主菌P.pastoris kM71感受態細胞中，利用YPD/G418平板篩選高拷貝轉化子，搖瓶發酵。比色測定法測定酶活。
[0007]工程菌生產正己醇活性檢測:收集重組菌發酵培養的上清液經PEG濃縮，硫酸銨沉淀，透析，制成粗酶液，檢驗產己醇活性如下:用pH3~8的醋酸緩沖液配制20%~60%的纖維素半水解物溶液，適量粗酶液，370C反應24h，再55°C反應12h，然后煮沸lOmin，微孔過濾，HPLC以及LC-MS檢測產物。 本發明制備的工程菌應用于正己醇發酵，檢測到了正己醇的生成，工程菌酶活達83U/mL，發酵產物正己醇含量最高可達35g/L。
[0008]【具體實施方式】:
下面結合具體的實施例，對本發明作進一步的闡述，但不限于這些具體的實施例，而所有的實施例均按上述的操作步驟操作。
[0009]實施例1、生產正己醇工程菌的制備
菌株和質粒:大腸桿菌質粒pTE28aT7購自大連Katara公司、大腸桿菌質粒pUC19購自Promega公司、pUCm_T、P.pastoris kM71購自Invitrogen公司。質粒小量提取試劑盒購自上海生工生物工程公司，膠回收試劑盒購自TaKaRa公司，限制性核酸內切酶BamH1、EcoR1、Not1、Xoh1、SacI和T4 Iigase連接酶購自TakaRa公司。遺傳霉素G418購自上海生工生物工程公司。其他試劑為國產分析純。
[0010]培養基:MD、YPD、BMGY, BMMY培養基，重組酵母常用培養基。
[0011]主要儀器:PCR儀、凝膠成像儀和蛋白電泳儀購自美國BIO-RAD公司，DYY-6C型電泳儀購自北京六一儀器廠，高效液相`色譜儀和液質聯用儀購自美國沃特斯公司。
[0012]表達載體的構建:
按照已發表的梭菌屬Fe-氫酶基因hydA (GenBank登錄號:EU590683)的cDNA序列，設計正反引物:正向引物Pl (5’ -ACGAGGAATTCATGAATTGGCCTACTCG-3’);反向引物P2(5’ -ATATGCGGCCGCGTGAACAGTAGGCAGAG-3’)，正向引物帶有EcoRI酶切位點，反向引物帶有NotI酶切位點，以引物Pl，P2對重組質粒pUC19-hydA PCR擴增獲得hydl基因片段。同樣，設計地衣芽孢桿菌葡聚糖酶基因lie (GenBank登錄號:ΑΥ225317)引物，Ρ1’(5，-ATGATGACCGACGATGAGAT-3’)，Ρ2’( 5 ’-AATGAGCGTGAAGTGGAGTGGAGT-3’)。正向引物帶有BamHI酶切位點，反向引物帶有XohI酶切位點，以引物PI’，Ρ2’，，對重組質粒pUCm-T-lic PCR擴增獲得Iicl基因片段。將hydl和Iicl基因片段，在連接酶T4 Iigase的作用，連接成為重組DNA的基因hyd-lic。連接到大腸桿菌載體pTE28aT7，得到表達質粒pTE28aT7-hyd-lic。
[0013]PCR擴增條件:94°C 30s, 56°C 30s，72°C 2min，30個循環。1%葡聚糖凝膠電泳回收PCR產物。
[0014]工程菌的構建以及高拷貝重組子的篩選:
將表達載體pTE28aT7-hyd-lic，經Sac I酶切線性化后回收含有目的基因的條帶，電擊轉入P.pastoris kM71感受態細胞中，在MD平板長出單克隆，再經YPD/G418平板篩選多拷貝轉化子，G418濃度篩選梯度依次為0.5、1、2 mg/mL,高拷貝轉化子經PCR鑒定。
[0015]PCR擴增條件:94°C 30s, 56°C 30s，72°C 2min，30個循環。1%葡聚糖凝膠電泳回收PCR產物。
[0016]搖瓶發酵產正己醇發酵工程菌:
將鑒定正確的單菌落接種至5 mL Yro培養基，200r/min，30°C培養16 h，以10%的接種量接入BMGY培養基(50mL培養基/250mL三角瓶)，30°C培養24 h，離心收集全部菌體，轉入BMMY培養基(50mL培養基/250mL三角瓶)，30°C，培養120h，每24h補加0.5%的甲醇，并取樣200uL，離心收集上清進行12% SDS-PAGE確定目的蛋白的表達存在形式。
[0017]產正己醇工程菌的合成酶活測定:比色測定法實施例2、產正己醇工程菌的產己醇活性檢測
收集重組菌發酵培養的上清液經聚乙二醇濃縮，硫酸銨沉淀，透析，制成粗酶液，檢驗產己醇活性如下:用PH4.3的醋酸緩沖液配制45%的纖維素半水解物溶液10mL，400uL粗酶液，37°C反應24h，再55°C反應12h，然后煮沸lOmin，微孔過濾，HPLC以及LC-MS檢測產物。
[0018]HPLC條件:示差折光檢測器，色譜柱:Hypersi 1NH2 , 250mm x 4.6mm;柱溫:30°C ;池溫(檢測器):30°C ;流動相:70%乙肪；流速:1 mL/min;進樣量:5μ?。
[0019]質譜條件:離子方式:ESI_、ESI+，離子源溫度:100°C，脫溶劑氣溫度:250°C，質量范圍:100~800 m/z,選擇離子:ESI+:365.5Da;ES1-:341.4Da,光電倍增器電壓:650Volts, Analyser Vacuum:2.6e-5mBar, Gas Flow: 4.21it/hr。
[0020]纖維素水解:
稀酸處理后，里氏木霉中的纖維素酶水解處理纖維素，500C，PH5.6，水解6-12h，獲得纖維素水解物。
[0021]產醇發酵及產物提取:
兩步法發酵:前培養是在L-試管中，以無菌操作加入5ml富營養培養基，以無菌牙簽接入高產正己醇工程菌菌株的菌落。37°C、120r/min培養24h。將前培養物0.5ml接種至含有100ml富營養培養基的500ml三角瓶中，55°C、150r/min振蕩培養12h。4°C，6000g無菌離心lOmin，棄上清，在離心管中以無菌磷酸鹽緩沖液振蕩混勻，然后在4°C，6000g無菌離心12min，棄上清。分別將不含有富營養培養基的菌體無菌接入10瓶含有100ml兩步法發酵培養基的500ml三角瓶中，分別加入微量元素溶液0.lml，55°C、150r/min振蕩培養40h。
[0022]正己醇的提取:
發酵收獲后，收集菌體，過濾絲狀菌體，用萃取劑萃取，在60°C水浴攪拌加熱2h。再減壓蒸餾，回收萃取劑，并得到產物正己醇。
【權利要求】
1.一種生產正己醇工程菌，其特點為包含梭菌屬Fe-氫酶基因hydA(GenBank登錄號:EU590683)和地衣芽孢桿菌β -葡聚糖酶基因lie (GenBank登錄號:ΑΥ225317)。
2.權利要求1所述工程菌的構建方法，包括:設計引物，pUC19-hydA質粒和pUCm-T-lic質粒分別PCR擴增，在連接酶作用下連接成為重組DNA的基因hyd_lic，hyd-lic連接到載體pTE28aT7,得到質粒pTE28aT7-hyd_lic,質粒pTE28aT7- hyd_lic轉化至宿主菌P.pastoris kM71感受態細胞中，搖瓶發酵。
3.利用權利要求 1或2所述工程菌以纖維素水解物為底物發酵制備正己醇。
【文檔編號】C12R1/19GK103571783SQ201210279050
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月8日 優先權日:2012年8月8日
【發明者】不公告發明人 申請人:徐州瑞賽科技實業有限公司