專利名稱：一種雷公藤細胞固定化的構建方法
技術領域：
本發明公開了一種利用固定化載體材料固定雷公藤細胞的方法，并初步建立了最優固定化雷公藤細胞體系。
背景技術：
雷公藤(Tripterygium wilfordii Hok . fl)是一種雙子葉木質藤本植物,也是一種珍貴的藥用植物。分布于南方福建、江西、浙江、廣東、湖南、湖北、臺灣等省份。雷公藤提取物中含有70種以上的有效成分，主要有；生物堿類、二萜類、三萜類、倍半萜類等次生代謝物。這些成分具有解毒散結、活血化瘀、消炎、抗腫瘤、免疫調整、抗炎、抗生育、抗HIV等多種藥理作用。廣泛用于治療類風濕性關節炎、肺病、腎病、皮膚病、白血病等疾病。
由于植物此生代謝產物具有極其復雜的化學結構，至今仍沒有找到有效的或經濟合成方法。近幾十年來利用植物細胞培養技術生產次生代謝產物的研究獲得了快速發展，其中固定化細胞技術在藥用植物次生代謝產物的工業化生產上具有極大的應用潛力和廣闊的發展前景。微生物固定化細胞技術是20世紀80年代興起的一種生物技術。所謂固定化細胞就是指用物理或化學的手段將游離細胞定位于限定的空間區域，仍保留催化活性且在反復或連續使用后仍具有催化活力。固定化細胞保持了胞內酶系的原始狀態和天然環境，有效地利用游離細胞的完整酶系統和細胞膜的選擇通透性，既具有固定化酶的優點，又具有其自身的優越性。植物細胞固定化后可以進行高密度增殖培養，提高生物反應器單位體積的生物轉化速率，延長發酵細胞的壽命，增加穩定性，利于實現連續化生產等；與懸浮培養相比，它還具有抗剪功能增強，耐受有毒前體的濃度高，易于積累和分離次生產物等優點。自Brodelius在1979年首次利用藻酸鈣凝膠固定化培養長春花生產次生產物以來，通過固定化培養植物細胞生產活性產物的研究取得了重大進展。目前，國內外已建立了包括銀杏、莨菪、長春花、紅豆杉、人參等藥用植物在內的50余種植物細胞固定化培養系統，所產次生代謝物包括有生物堿類、甙類、黃酮類、醌類等。上述研究證明，藥用植物細胞在固定化培養條件下不僅表現出較好的次生代謝產物釋放能力，而且多數活性產物的產量要高于傳統懸浮細胞培養。因此，面臨雷公藤植物資源少、有效成分含量低的問題，本研究提出開展雷公藤固定化細胞培養生產甲素的研究，從而為甲素的高效生產開辟新的途徑。雷公藤甲素是雷公藤中活性最高的環氧二萜內酯化合物，是雷公藤中主要的活性成分，可有效治療自身免疫性疾病，并具明顯的抗白血病和抗腫瘤活性，且相關藥用效價比雷公藤總苷高100-200倍。由于具有廣泛的藥理作用，雷公藤甲素已成為使用最為廣泛的雷公藤活性物質，目前是雷公藤片、雷公多甙片等成藥制劑的主要成分。
目前國內外尚未見有關利用固定化載體對雷公藤細胞進行固定的報道，本發明首次建立了利用固定化載體對雷公藤進行固定的方法及體系。

發明內容
本發明的目的是建立雷公藤細胞固定化培養體系，主要包含四項關鍵技術，分別為(I)雷公藤細胞的培養與取得；(2)細胞固定化的制備；(3)固定化細胞培養系的建立；
(4)固定化細胞的釋放。本發明是通過以下方法實現的
一種雷公藤細胞的固定方法，其特征在于包括以下步驟
1)雷公藤細胞的培養與取得摘取野生雷公藤進行誘導，培養出愈傷組織并將其繼代三次以上，而后將繼代后的愈傷組織切成碎末狀，置于white培養液中，振蕩培養5 6d，獲得雷公藤懸浮細胞溶液;其中所述的white培養液為21. 26g white培養基+0. 5mLIBA+0. 5mL 2，4-D+O. Iml KT, pH=5.8 ；
2)細胞固定化的制備方法取海藻酸鈉水溶液、CaCl2水溶液、NaCl水溶液進行滅菌處理；取出雷公藤懸浮細胞溶液，過濾后將殘渣放入海藻酸鈉溶液中攪拌均勻，將攪拌均勻所得的混合溶液緩慢滴入CaCl2溶液中，使其形成圓形的凝膠珠，將凝膠珠在CaCl2水溶液中浸泡一小時，之后將浸泡的CaCl2溶液倒掉，加入NaCl水溶液洗滌一至兩分鐘，重復洗滌三次；所述的海藻酸鈉水溶液濃度為30g/L;所述CaCl2水溶液濃度為8g/L;所述NaCl水溶液濃度為9g/L;
3)固定化細胞培養體系建立將洗滌后的凝膠珠放入如步驟I)所述的white培養液中，振蕩培養24d,每12d繼代一次；
4)固定化細胞的釋放將步驟3)中培養完成后的培養液進行過濾，過濾出來的凝膠珠放入O. lmol/L, PH=7. 8磷酸緩沖液中振蕩，待凝膠珠溶散后，再次過濾，過濾后的殘渣即得雷公藤細胞。其中，步驟I)與步驟3)中振蕩培養的條件均為在25 °C、黑暗條件、振蕩速率為110r/mino本發明公開了一種利用固定化載體材料固定雷公藤(Tripterygium wilfordiiHok . Π)細胞的方法，并初步建立了最優固定化雷公藤細胞體系。該體系的建立，對于雷公藤甲素的高效生產開辟新的途徑。實驗證明固定化雷公藤細胞能夠富集大量的雷公藤甲素。說明書附圖

圖I和圖2 :雷公藤固定化細胞的效果。
具體實施例方式現舉例說明本發明，但本發明內容不限于此。實施例I
①雷公藤細胞的培養與取得摘取野生雷公藤進行誘導，培養出愈傷組織繼代三次以上，而后取生長勢頭良好的愈傷組織進行稱量、切碎，取O. Sg置于盛有white培養液(white 培養基21. 26g white 培養基 +0. 5mL IBA+0. 5mL 2，4-D+O. Iml KT, pH=5. 8。)的250ml的三角瓶中，25 1黑暗條件下的振蕩培養箱中以llOr/min的速率振蕩培養6d，得到懸浮細胞。②細胞固定化的制備方法取30g/L海藻酸鈉水溶液、8g/L CaCl2水溶液；9g/LNaCl水溶液進行滅菌處理。將懸浮細胞過濾后，取濾渣放入IOOmL滅菌后的海藻酸鈉水溶液中攪拌均勻，將混合物吸入注射器中，再由注射器緩慢滴入CaCl2溶液中，使其形成圓形凝膠珠，滴完后凝膠珠在CaCl2溶液中浸泡一小時，然后將浸泡的CaCl2溶液倒掉，加入NaCl溶液洗滌一至兩分鐘，將水倒掉，重復三次。③固定化細胞培養體系建立將洗滌完的凝膠珠放入盛有如步驟①所述的white培養液的250ml的三角瓶中，放入設置為110r/min ,25 °C黑暗條件下的振蕩培養箱中振蕩培養。為避免培養液中的營養都被消耗完，需要每12d繼代一次。繼代一次后取出。④固定化細胞的釋放將步驟③中繼代完成后的三角瓶中的物質進行過濾，過濾出的凝膠珠的放入O. lmol/L, PH=7. 8磷酸緩沖液中振蕩處理，待凝膠珠溶散后再次過濾，過濾后的殘洛即為雷公藤細胞。雷公藤固定化細胞的效果如圖I所示。
由實施例I得到的雷公藤甲素的測定
在步驟④中，過濾出來的培養液用O. 22 μ m有機系微孔濾頭濾至離心管，留待測雷公藤甲素。將雷公藤細胞，進行研磨，加入5ml甲醇，移至離心管，放至10小時，在4°C條件下，8000r/min離心10分鐘，沉淀后，取上清液，留待測雷公藤甲素。利用高效液相色譜分別對固定化細胞外的培養液及固定化細胞內的雷公藤甲素濃度進行檢測，雷公藤甲素標準品購于成都普瑞法科技開發有限公司。液相色譜儀的參數設置為流動相為60%甲醇，40%水；流速為lmL/min，檢測波長208nm。檢測前將流動相，超純水，甲素標準溶液和發酵液樣品預先超聲波處理半小時。所得的雷公藤固定化細胞中胞內與胞外的雷公藤甲素的含量如表I所示。從中可知，固定化雷公藤細胞能夠富集大量的雷公藤甲素。表I雷公藤固定化細胞甲素含量
權利要求
1.一種雷公藤細胞的固定方法，其特征在于包括以下步驟 1)雷公藤細胞的培養與取得摘取野生雷公藤進行誘導，培養出愈傷組織并將其繼代三次以上，而后將繼代后的愈傷組織切成碎末狀，置于white培養液中，振蕩培養5 6d,獲得雷公藤懸浮細胞溶液;其中所述的white培養液為21. 26g white培養基+0. 5mLIBA+0. 5mL 2，4-D+O. Iml KT, pH=5.8 ； 2)細胞固定化的制備方法取海藻酸鈉水溶液、CaCl2水溶液、NaCl水溶液進行滅菌處理；取出雷公藤懸浮細胞溶液，過濾后將殘渣放入海藻酸鈉溶液中攪拌均勻，將攪拌均勻所得的混合溶液緩慢滴入CaCl2溶液中，使其形成圓形的凝膠珠，將凝膠珠在CaCl2水溶液中浸泡一小時，之后將浸泡的CaCl2溶液倒掉，加入NaCl水溶液洗滌一至兩分鐘，重復洗滌三次；所述的海藻酸鈉水溶液濃度為30g/L;所述CaCl2水溶液濃度為8g/L;所述NaCl水溶液濃度為9g/L; 3)固定化細胞培養體系建立將洗滌后的凝膠珠放入如步驟I)所述的white培養液中，振蕩培養24d,每12d繼代一次； 4)固定化細胞的釋放將步驟3)中培養完成后的培養液進行過濾，過濾出來的凝膠珠放入0. lmol/L, PH=7. 8磷酸緩沖液中振蕩，待凝膠珠溶散后，再次過濾，過濾后的殘渣即得雷公藤細胞。
2.如權利要求I所述的一種雷公藤細胞的固定方法，其特征在于步驟I)與步驟3)中振蕩培養的條件均為在25 °C、黑暗條件、振蕩速率為110r/min。
全文摘要
本發明公開了一種雷公藤細胞固定化的構建的方法。通過對雷公藤細胞的培養與取得、細胞固定化的制備建立固定化細胞培養系。本發明主要包含四項關鍵技術，分別為(1)雷公藤細胞的培養與取得；(2)細胞固定化的制備；(3)固定化細胞培養系的建立；(4)固定化細胞的釋放。通過對本發明產生的雷公藤固定化細胞進行雷公藤甲素含量的測定，發現固定化細胞內雷公藤甲素的含量高達56.5591μg/g，而雷公藤固定化細胞外的溶液中雷公藤甲素的含量高達2.6218mg/L，具有較高的應用價值。
文檔編號C12N11/10GK102807974SQ20121028256
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月10日 優先權日2012年8月10日
發明者封磊, 萬曉琦, 洪偉, 吳承禎, 宋萍 申請人:福建農林大學