專利名稱：一種寬pH作用范圍木聚糖酶及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種木聚糖酶及其應用，特別是一種寬pH作用范圍的木聚糖酶，屬于酶工程和基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
木聚糖(Xylan) (EC 3. 2. I. 8)是植物細胞壁半纖維素組分的主要成分，占植物碳水化合物總量的三分之一。在自然界中，木聚糖是繼纖維素之后含量最為豐富的多聚糖。木聚糖的主鏈由多個毗喃木糖基通過β_1，4-糖苷鍵連結(jié)形成，側(cè)鏈含多種不同取代基。木聚糖酶屬于0-glycoside hydrolases(EC 3. 2. I. x),可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖單糖。它是一種復合酶，主要包括 endo-β-I, 4-xylanase (EC 3· 2· I. 8)和 β-xylosidase (EC3. 2. I. 37)。前者從主鏈內(nèi)部隨機作用于β -I, 4-糖苷鍵，將木聚糖分解成低聚木糖；后者則作用于低聚木糖的末端，釋放出木糖單糖。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的endo- β -I, 4-xylanase主要分布在5、7、8、10、11、43等家族的糖苷水解酶中，其中大部分屬于GH familylO和11兩大家族。GH familylO木聚糖酶通常含有兩個結(jié)構(gòu)域，包括催化結(jié)構(gòu)域和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Cellulose Binding Domain:CBD), 相對分子質(zhì)量一般大于30kDa，在結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)“桶狀”;而GH familyll木聚糖酶多為單結(jié)構(gòu)域，只含有催化結(jié)構(gòu)域，相對分子質(zhì)量一般小于30kDa，在空間結(jié)構(gòu)上呈“右手半握狀”。
迄今，已經(jīng)有一些關(guān)于放線菌來源的木聚糖酶的報道，其中大部分為鏈霉菌， 如 Streptomyces sp. SffUlO, S. thermotrificans, S. lividans, S. olivaceoviridis E-68等等。現(xiàn)今一些來源于鏈霉菌的木聚糖酶在pH 10.0時已經(jīng)沒有酶活，如來源于 Streptomyces sp.S9 的 XynAS9, Streptomyces sp. strain AMT-3 的 xylanase, Streptomyces sp. S2 7 的 xylanase, Streptomyces sp. SffUlO 的 XynSW2A/B ;而來源于 Streptomyces megaspores DSM 41476 的一個擁有寬 pH 的木聚糖酶 XYNAM6 在 ρΗ10· O 和11.O的殘留酶活也只有38%和15%。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題在于提供一種寬pH作用范圍穩(wěn)定性的木聚糖酶，所述其氨基酸序列如以下I)或2)或3)所示
I)其氨基酸序列為SEQ ID NO. I所示序列；
2)在I)限定的氨基酸序列的基礎(chǔ)上氨基酸序列經(jīng)過一個或者幾個氨基酸取代、缺失或添加，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列；
3)與I)或2)限定的氨基酸序列具有90%以上同源性，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列。
所述木聚糖酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
所述的木聚糖酶的寬pH作用范圍是指pH 4. 5 10. O。
本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供了一株含木聚糖酶的基因工程菌。
本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供了一種木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟
I)設(shè)計引物克隆木聚糖酶的基因xynA ；
2).將基因克隆到重組表達載體上；
3).將重組表達載體轉(zhuǎn)化到宿主細胞中。
所述重組表達載體為pUC系列，pET系列，pT7-7，或pGEX中的任意一種。
所述重組表達載體為pET_20b。
所述宿主細胞為為細菌，酵母或真菌。
所述細菌為E. coli BL21(DE3)、E. coli W3110、Ε· coli JM109、E. coli JM109(DE3)、Ε· coli DH5 α 中任意一種。
本發(fā)明所述的木聚糖酶XynA的最適ρΗ5. 5,最適溫度60°C;有較寬的pH作用范圍， 尤其在堿性環(huán)境下pH4. 5 10. O范圍內(nèi)相對酶活均在50%以上，pHll. O時仍有41%的酶活，比木聚糖酶XYNAM6的在堿性范圍內(nèi)殘余酶活高；pH穩(wěn)定范圍在3 11之間，殘余酶活力均在80%以上。重組XynA基因工程菌表達胞外酶活為213. 5U/mL,是野生菌Sti^ptomyces sp. HJ酶活的11倍。因此，在竹原纖維生物酶脫膠、紙漿漂白、食品等行業(yè)具有潛在利用價值。


圖I純化所得XynA的SDS-PAGE圖。
I、標準蛋白分子量；
2、純化后樣品(XynA)。
圖2 XynA的最適pH及pH穩(wěn)定性曲線圖。
圖3 XynA的最適溫度及溫度穩(wěn)定性曲線圖。
圖4重組XynA的發(fā)酵過程圖。
■:大腸桿菌OD6tltl曲線；
O :重組XynA的酶活曲線。
圖5 重組 XynA 的 SDS-PAGE 圖。
I、標準蛋白分子量；
2、重組 XynA。
具體實施方式
實施例I :菌種的篩選和鑒定
采用的竹塊為一年生毛竹，將竹材沿縱向截成50cm左右的長段，洗凈后浸入慪竹液中，室溫發(fā)酵一段時間。將Iml慪竹液在IOOml含木聚糖5g/L、(NH4)2SO4 O. 5g/L、酵母浸出液 O. 5g/L、MgSO4 · 7H20 O. 3g/L、K2SO4 O. lg/L、KH2PO4 I. Og/L、CaCl2 · 2H20 0. 2g/L、 微量元素溶液0. 5ml的培養(yǎng)基中37°C富集培養(yǎng)24h。然后將富集培養(yǎng)液以梯度稀釋的方法接種到含上述培養(yǎng)基成分的瓊脂培養(yǎng)皿中。在37°C培養(yǎng)2-4天后，挑單菌落至選擇培養(yǎng)基 (竹粉 20g/L、(NH4)2SO4 2. 5g/L、K2HPO4 O. 5/L、MgSO4 lg/L、瓊脂 20g/L)。在上述兩種培養(yǎng)基平板上都可以生長的菌落被選出進行發(fā)酵培養(yǎng)，選出可產(chǎn)木聚糖酶的優(yōu)勢菌株。對選出的優(yōu)勢菌株進行16S ribosomal DNA鑒定,鑒定結(jié)果顯不有一株優(yōu)勢菌株與Streptomyces viridochromogenes (FJ790787)同源性達 99%,因此可確定為 Streptomyces species。將該產(chǎn)木聚糖酶的鏈霉菌命名為Streptomyces sp. HJ,并保藏。
實施例2 Streptomyces sp. HJ的發(fā)酵及XynA的純化
在含蛋白胨1%、酵母浸出液O. 5%、牛肉膏O. l%、NaCl O. 5%的種子培養(yǎng)基中接入一定量的Str印tomyces sp. HJ, 30°C, 200 rpm搖床培養(yǎng)24h后接含麩皮3%、蛋白胨O. 3%、酵母浸出液 O. 3%,KNO3 1%>KH2PO4 O. 05%、Na2HPO4 ·12H20 O. 05%、無水 MgSO4 O. 05%、Tween800. 1% 的發(fā)酵培養(yǎng)基，同樣條件培養(yǎng)3 4d后，離心收集上清即為粗酶液，酶活達到19U/mL。
通過硫酸銨分級沉淀的方法確定40%(w/v)硫酸銨恰好使XynA完全鹽析。因此, 將發(fā)酵液上清緩慢加入40%(w/v)硫酸銨鹽析過夜，12，OOOXg, 40C，離心30min ;用適量緩沖液A (20mM醋酸-醋酸鈉，pH5. 0)將沉淀溶解，4°C透析過夜、膜過濾(0. 45 μ m)后即為上樣樣品。SP Sepharose Fast Flow陽離子交換柱(16cmX15cm)用緩沖液A平衡后上樣，依次用緩沖液A、含(TlMNaCl的緩沖液A、含I M氯化鈉的緩沖液A洗脫結(jié)合蛋白，流速為lmL/min。將收集管中有酶活的樣品用緩沖液A透析過夜后，上緩沖液A平衡過的MonoS 5/50GL，分別用緩沖液A、含(Tl M NaCl的緩沖液A、含I M NaCl的緩沖液A洗脫，收集酶活力組分并進行蛋白電泳分析。最終獲得的純酶比活為861U/mg，純化倍數(shù)為47. 8，得率為 20%(表I)。SDS-PAGE表明，木聚糖酶純化后為一條帶，分子量約為43kDa (圖I)。
表I Streptomyces sp. HJ 所產(chǎn) XynA 的純化
權(quán)利要求
1.一種寬PH作用范圍木聚糖酶，其特征在于其氨基酸序列如以下I)或2)或3)所示 I)其氨基酸序列為SEQ ID NO. I所示序列； 2 )在I)限定的氨基酸序列的基礎(chǔ)上氨基酸序列經(jīng)過一個或者幾個氨基酸取代、缺失或添加，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列； 3)與I)或2)限定的氨基酸序列具有90%以上同源性，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求I所述木聚糖酶的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.含有權(quán)利要求I或2所述木聚糖酶的基因工程菌。
4.權(quán)利要求3所述基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟 1)設(shè)計引物克隆木聚糖酶的基因xynA； 2).將基因克隆到重組表達載體上； 3).將重組表達載體轉(zhuǎn)化到宿主細胞中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述重組表達載體為pUC系列，pET系列，pT7-7,或pGEX中的任意一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述重組表達載體為pET-20b。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述宿主細胞為為細菌，酵母或真菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述細菌為E.coli BL21(DE3)、E.coli W3110.E. coli JM109、E.coli JM109 (DE3)、E. coli DH5 a 中任意一種。
全文摘要
本發(fā)明提供一種寬pH作用范圍木聚糖酶XynA(EC 3.2.1.8)及其應用，屬于酶工程和基因工程領(lǐng)域。該木聚糖酶XynA來源于Streptomyces sp.HJ，其最適pH5.5，pH穩(wěn)定范圍3～11；最適溫度60℃，50℃半衰期為30h；Km和Vmax分別為3.45mg/mL，845.23μmol/min/mg。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1，成熟蛋白436個氨基酸殘基。重組XynA在E.coli BL21(DE3)中表達胞外酶活為213.5U/mL，是野生菌Streptomyces sp.HJ酶活的11倍。XynA有較寬的pH作用范圍，尤其在堿性環(huán)境下，其可能在竹原纖維生物酶脫膠、紙漿漂白等行業(yè)具有潛在利用價值。
文檔編號C12R1/465GK102978188SQ20121028434
公開日2013年3月20日 申請日期2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月6日
發(fā)明者吳敬, 陳晟, 何潔, 宿玲恰, 陳堅 申請人:江南大學