專利名稱：重組豬α干擾素及其在制備治療豬巨嗜細胞病毒病的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及重組豬a干擾素的一種新用途，具體的說是重組豬a干擾素及其在制備治療豬巨嗜細胞病毒病的藥物中的應用。
背景技術：
干擾素(Interferon，IFN)是一類具有廣譜抗病毒、抗增殖及免疫調節作用的分泌型糖蛋白，是機體防御系統的重要組成部分。依據干擾素對酸的敏感性通常分為I型干擾素(酸敏感型)和II型干擾素(耐酸型)兩類，幾乎所有脊椎動物均可產生這兩類干擾素。I型干擾素主要起抗病毒和抗腫瘤作用，至今已發現INF-a、@、《、K、t、S以及干擾素樣細胞因子1加^111、1128、1129等；11型又稱免疫干擾素，迄今為止僅發現1即-￥ — 種。由于干擾素具廣譜、高效抗病毒功能，及其對免疫系統起關鍵調節作用，因此成為當今免疫學、遺傳學和分子生物學研究最為活躍的領域之一。目前有5種豬干擾素I型干擾素a、P、Co、S和II型干擾素Y被發現。豬INF-a、co分別是由12個和5個以上的相關功能基因編碼的蛋白質家族，這兩種干擾素的各亞型之間同源性很高，天然INF-a常常是INF-a、Co功能基因表達產物的混合體，而INF-P、6和INF-Y僅由單一基因編碼。現在已完成基因克隆、測序和定位的豬干擾素基因主要包括INF-a、@、o和INF- y。豬a干擾素(PolFN a)在獸醫臨床上可作為廣譜抗病毒藥用于豬病毒性疾病的防治。如對豬的流行性腹瀉、輪狀病毒腹瀉、傳染性胃腸炎等多種病毒性疾病有較好的防治作用，但目前國內用豬a干擾素治療豬巨嗜細胞病毒感染的研究幾乎空白，尚無相關報道。本發明中的豬巨嗜細胞病毒病(porcine cytomegalovirus, PCMV)亦稱細胞包涵體病毒。PCMV屬于皰疹病毒科，P皰疹病毒亞科，巨嗜細胞病毒屬的成員。PCMV分布相當廣泛，該病至報道以來，在英國、日本、德國、美國和澳大利亞先后報道了該病的存在，其血清抗體陽性率達90%以上，全世界98%以上的豬受到過本病毒的感染，感染豬群98%以上的血清抗體均呈陽性。對3-5周齡仔豬的肺巨噬細胞高度敏感，感染后3-14天可看到巨嗜細胞形成和核包涵體，最高峰出現在接種后11-14天。感染豬后，感染細胞體積是正常細胞的6倍。患豬特征性臨診癥狀為食欲廢絕，母豬繁殖障礙，表現為流產、死產、木乃伊胎、產弱仔等；仔豬有明顯的眼炎、鼻炎和肺炎癥狀，生長發育不良，增重差，給豬場造成了嚴重的損失。迄今尚未研制出有效的PCMV疫苗，在化學類治療藥物中，也尚未研制出特效藥物來預防和治療本病。

發明內容
本發明針對現有技術的不足提供一種重組豬a干擾素及其在制備治療豬巨嗜細胞病毒病的藥物中的應用。提供一種重組后的畢赤酵母表達載體pGAPZ a -IFN a的閱讀框序列。
本發明所述的豬a干擾素具有序列表中序列I所示核苷酸序列。一種重組豬a干擾素，通過以下方法制備Al :人工修飾后的豬a干擾素基因的合成將天然IFNa核苷酸序列中的信號肽序列1-69位核苷酸去除，添加XhoI和XbaI酶切位點序列及保護堿基。將基因中第24位氨基酸的三聯體密碼子的第3個堿基進行點突變，即將TGC突變為TGT ;第29位氨基酸的第2個堿基進行點突變，即將ACC突變為ATC ;第48位氨基酸的第3個堿基進行點突變，即將TCC突變為TCT ;第101位氨基酸的第I個堿基進行點突變，即將GAT突變為AAT ;第132位氨基酸的第3個堿基進行點突變，將ACG突變為ACC ;第158位氨基酸的第2位堿基進行點突變，由AAC突變為AGC ;第161位氨基酸的第2位堿基進行點突變，由CTC突變為CCC ;第167位氨基酸的第I個堿基進行點突變，由ATC變為GTC ;第174位氨基酸的第I和第2個堿基進行點突變，由GTC突變為TCC ;第179位氨基酸的第2個堿基進行點突變，由ACA突變為AGA，突變后的基因序列編碼的氨基酸未改變豬天然IFNa的氨基酸序列，又為甲醇酵 母所喜歡的密碼子，在甲醇酵母中具有高表達效率；A2 :構建重組真核表達載體pGAPZ a-IFNa :將克隆得到的IFNa基因，連接到PGM-T載體上，轉化大腸桿菌DH5 a，得到PGM-T-IFN a ^fPGM-T-IFNa和pGAPZ a載體分別酶切后進行連接得pGAPZ a -IFNa，轉化大腸桿菌DH5 a，篩選陽性菌株，質粒經雙酶切后得到了與理論大小一致的載體片段和干擾素目的片段；A3 :真核細胞酵母表達系統高效表達IFN a :將上述重組表達載體pGAPZ a -IFN a經線性化后電轉化受體菌GSl 15，經篩選得到陽性克隆，28度培養，使IFN a進行表達，經SDS-PAGE凝膠電泳分析，分子量19. 4KD,與理論值相符，將發酵上清液用層析柱進行純化收集。將工程菌大量培養并表達的豬a干擾素，取上清液用層析柱純化后，收集目標蛋白洗脫液，經0. 22 ii m微孔濾膜過濾后，采用細胞病變抑制法測定活性，按50%病變計算效價單位。測定用的細胞為牛腎細胞MDBK，攻擊病毒采用水泡性口炎病毒VSV。本發明將純化獲得的豬a干擾素應用于防治豬巨嗜細胞病毒病，實驗證明對豬巨嗜細胞病毒感染細胞具有明顯的保護作用。其用藥途徑通過注射給藥或粘膜給藥，劑型為注射劑或滴鼻劑。


圖I畢赤酵母表達載體pGAPZ a -IFNa的雙酶切(Xhol/Xbal)鑒定；1. DNA MarkerD20002, 3. pGAPZ a -IFN a 雙酶切產物 4. DNA Marker D15000 ；圖2豬干擾素基因畢赤酵母表達載體pGAPZ a-IFNa的線性化；I. DNA MarkerD150002,3pGAPZa -IFNa 線性化產物；圖3 高抗篩選菌株的 PCR 鑒定；I. DNA Marker D2000 2-4,6-8 pGAPZ a -IFN a 轉化酵母陽性克隆子；5，9 :pGAPZa -IFNa轉化酵母陰性克隆子圖4表達產物的SDS-PAGE電泳圖；I.蛋白質Marker 2-5 :陰性菌株6_7 :酵母陽性菌株表達產物圖5重組豬a干擾素對VSV病毒誘導MDBK細胞產生細胞病變的抑制作用；5_1為試驗組(加干擾素)后細胞；5_2為對照組(未加干擾素)的細胞.
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施例一豬a干擾素的制備方法I、人工修飾后的豬a干擾素基因的合成將豬天然IFNa核苷酸序列中的信號肽序列1_69位核苷酸去除，添加XhoI和XbaI酶切位點及保護堿基。
具體操作如下將天然IFNa核苷酸序列中的信號肽序列1_69位核苷酸去除，添加XhoI和XbaI酶切位點序列及保護堿基。將基因中第24位氨基酸的三聯體密碼子的第3個堿基進行點突變，即將TGC突變為TGT ;第29位氨基酸的第2個堿基進行點突變，即將ACC突變為ATC ;第48位氨基酸的第3個堿基進行點突變，即將TCC突變為TCT ;第101位氨基酸的第I個堿基進行點突變，即將GAT突變為AAT ;第132位氨基酸的第3個堿基進行點突變，將ACG突變為ACC ;第158位氨基酸的第2位堿基進行點突變，由AAC突變為AGC ；第161位氨基酸的第2位堿基進行點突變，由CTC突變為CCC ;第167位氨基酸的第I個堿基進行點突變，由ATC變為GTC ;第174位氨基酸的第I和第2個堿基進行點突變，由GTC突變為TCC ;第179位氨基酸的第2個堿基進行點突變，由ACA突變為AGA，突變后的基因序列編碼的氨基酸未改變豬天然IFNa的氨基酸序列，又為甲醇酵母所喜歡的密碼子，在甲醇酵母中具有高表達效率。序列SEQ ID NO. I為人工設計合成的不改變豬天然IFNa氨基酸序列的核苷酸序列，大小為523bp。2、重組真核表達載體pGAPZ a-IFN a的構建以上述人工修飾后合成的豬IFNa基因為模板，設計一對特異性引物進行PCR擴增上游引物IFNl TA CTCGAG AAA AGA TGT GAC CTG CCT CAG，引入 XhoI 酶切位點；下游引物IFN2:GC TCTAGA TCA CTC CTT CTT CCT GAG TCT GTC，引入 XbaI 酶切位點；按以下程序進行擴增94°C預變性3min，94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸lmin，共運行35個循環，最后72°C延伸5min，PCR結束后用瓊脂糖凝膠電泳和膠回收試劑盒回收IFN a基因片段，用T4DNA連接酶與PGM-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5 a，得到陽性重組質粒PGM-T-IFN a。將PGM_T_IFN a和pGAPZ a載體用XhoI和XbaI雙酶切，用膠回收試劑盒分別回收IFNa基因片段和pGAPZa載體，然后用T4DNA連接酶將IFN a基因片段與pGAPZ a連接得DGAPZa-IFN a ,轉化大腸桿菌DH5 a，篩選陽性菌株，提取質粒做XhoI/XbaI雙酶切鑒定，雙酶切后得到了與預期大小一致的載體片段和干擾素目的片段，見圖I。雙酶切鑒定結果正確的送往上海英俊生物工程有限公司進行測序，測序結果表明成功構建7 pGAPZ a -IFN a表達載體，其閱讀框序列見SEQ ID NO. 2。3、IFNa基因的表達3. I重組表達載體pGAPZ a -IFNa轉化畢赤酵母GSl 15用限制性內切酶將pGAPZ a -IFNa線性化，回收線性化完全的酶切產物(圖2)，將線性化的pGAPZ a -IFN a轉化到感受態酵母細胞，于28°C溫箱中培養3_5天。待平板上的單菌落長出后，將其分別依次點種在含抗生素ZeocinTM 500,1000,1500,2000 u g/ml的YPDS平板上，28-30°C孵育2-3天，然后將ZeocinTM 2000 u g/ml的YPDS平板上的單菌落再分別依次點種在ZeocinTM 2500,3000 u g/ml的YPDS平板上，28_30°C孵育2_3天，得重組酵母菌株。3. 2畢赤酵母電轉化菌株的陽性鑒定提取重組畢赤酵母電轉化菌株GS115的基因組DNA和轉化的空載體基因組DNA，用pGAP Forward和3' AOXl引物進行PCR擴增，序列為Forward :5' —GTCCCTATTTCAATCAATTGAA—3'，3 ' AOXl 5 ' —GCAAATGGCATTCTGACATCC—3 '，如是空載體，只能擴增出載體上的片段，大小為466bp，而連接了 IFNa片段的陽性克隆，則能擴增出967bp大小片段(載體片段466bp+IFNa片段50lbp)，結果2-4，6-8均擴增出了 967bp左右的條帶，見圖3，得至Ij了 pGAPZ a-IFN a載體轉化后的酵母陽性菌株。 3. 3重組畢赤酵母電轉化菌株GSl 15的誘導表達挑取重組畢赤酵母電轉化菌株GS115的單克隆菌株，接種于YH)培養基中培育到0D600值達到6. 0，離心收菌；用表達培養基BMGY重懸沉淀，在28_30°C震蕩培養過夜后每日補加純甲醇至終濃度為1% (v/v)進行誘導，繼續培養4天；離心收集上清液；用SDS-PAGE電泳法檢測上清液中的干擾素，結果樣品6，7在19. 4KD左右出現了蛋白條帶，見圖4，與理論值基本相符，選擇該菌株進行發酵、蛋白純化。3. 4重組畢赤酵母發酵菌產業化生產將保存菌株(Pichia pastoris GS115 (pPICz-ifn)劃線接種于YPD平板培養基上，28-30°C恒溫培養24-32h ;再從YPD平板培養基上挑出單菌落，接入250ml三角瓶裝的30mlBMGY培養基中，于200-300rpm/min，28_30°C振蕩培養24h，作為搖瓶種子；搖瓶種子再以10% (V/V)接入IOL發酵罐的BMGY培養基中，200_300rpm，28_30°C進行攪拌培養24h ；然后，每日補加甲醇于培養基中至終濃度為1% (v/v)，用10% (v/v) NH4OH和10% (v/v)H3P04調pH至5. 5，溶氧為50%，連續培養4d ;離心，收集含IFN a的上清液。4、表達產物豬a干擾素的分離純化將重組畢赤酵母菌發酵上清液通過層析柱，用乙酸鈉洗脫目的蛋白峰，再進行陽離子交換柱，洗脫后進一步凝膠層析，目的蛋白得到很好的分離。實施例二豬a干擾素生物學活性測定一、材料方法病毒來源水泡性口炎病毒VSV (保藏編號⑶V-Ol I，購于中國典型培養物保藏中心)。細胞牛腎細胞MDBK (NBL-1，上海生化試劑有限公司)。待檢樣品(豬a干擾素):通過基因工程方法制備。檢測方法細胞病變抑制法，按50%病變計算效價單位。測定用的細胞為牛腎細胞MDBK，攻擊病毒用VSV。生物學活性計算法
供試品生物學活(IU/ml) =PrX
DrxEr
Pr為標準品生物學活性，IU/ml ；Ds為供試品預稀釋倍數；Dr為標準品預稀釋倍數；Es為供試品相當于標準品半效量的稀釋倍數；Er為標準品半效稀釋倍數；待檢樣品及標準品的OD值
權利要求
1.一種重組豬a干擾素，其特征在于，通過以下方法制備 Al :人工修飾后的豬a干擾素基因的合成將天然IFNa核苷酸序列中的信號肽序列1-69位核苷酸去除，添加XhoI和XbaI酶切位點序列及保護堿基。將基因中第24位氨基酸的三聯體密碼子的第3個堿基進行點突變，即將TGC突變為TGT ;第29位氨基酸的第2個堿基進行點突變，即將ACC突變為ATC ;第48位氨基酸的第3個堿基進行點突變，即將TCC突變為TCT ;第101位氨基酸的第I個堿基進行點突變，即將GAT突變為AAT ;第132位氨基酸的第3個堿基進行點突變，將ACG突變為ACC ;第158位氨基酸的第2位堿基進行點突變，由AAC突變為AGC ;第161位氨基酸的第2位堿基進行點突變，由CTC突變為CCC ;第167位氨基酸的第I個堿基進行點突變，由ATC變為GTC ;第174位氨基酸的第I和第2個堿基進行點突變，由GTC突變為TCC ;第179位氨基酸的第2個堿基進行點突變，由ACA突變為AGA，突變后的基因序列編碼的氨基酸未改變豬天然IFN a的氨基酸序列，又為甲醇酵母所喜歡的密碼子，在甲醇酵母中具有高表達效率； A2 :構建重組真核表達載體pGAPZa-IFNa :將克隆得到的IFNa基因，連接到PGM-T載體上，轉化大腸桿菌DH5 a，得到PGM-T-IFN a ^fPGM-T-IFNa和pGAPZ a載體分別酶切后進行連接得PGAPZa-IFN a，轉化大腸桿菌DH5 a，篩選陽性菌株，質粒經雙酶切后得到了與理論大小一致的載體片段和干擾素目的片段； A3 :真核細胞酵母表達系統高效表達IFNa :將上述重組表達載體pGAPZ a-IFN a經線性化后電轉化受體菌GS115，經篩選得到陽性克隆，28度培養，使IFNa進行表達，經SDS-PAGE凝膠電泳分析，分子量19. 4KD,與理論值相符，將發酵上清液用層析柱進行純化收集。
2.根據權利要求I所述的重組豬a干擾素在制備治療豬巨嗜細胞病毒病的藥物中的應用，其特征在于，其用藥途徑通過注射給藥或粘膜給藥，劑型為注射劑或滴鼻劑。
3.根據權利要求2所述的應用制備的藥物，其特征在于，其用藥途徑通過注射給藥或粘膜給藥，劑型為注射劑或滴鼻劑。
全文摘要
本發明公開了一種重組豬α干擾素，通過以下方法制備A1人工修飾后的豬a干擾素基因的合成；A2構建重組真核表達載體pGAPZα-IFNα；A3真核細胞酵母表達系統高效表達IFNα。將工程菌大量培養并表達的豬a干擾素，取上清液用層析柱純化后，收集目標蛋白洗脫液，經0.22μm微孔濾膜過濾后，采用細胞病變抑制法測定活性，按50％病變計算效價單位。測定用的細胞為牛腎細胞MDBK，攻擊病毒采用水泡性口炎病毒VSV。本發明將純化獲得的豬a干擾素應用于防治豬巨嗜細胞病毒病，實驗證明對豬巨嗜細胞病毒感染細胞具有明顯的保護作用。其用藥途徑通過注射給藥或粘膜給藥，劑型為注射劑或滴鼻劑。
文檔編號C12N15/81GK102796758SQ201210284368
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月6日 優先權日2012年8月6日
發明者李猶平, 劉宗秀, 王建軍, 房春林, 陳元坤 申請人:成都乾坤動物藥業有限公司