針對人cd22抗體的抗獨特型抗體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了針對人CD22抗體的抗獨特型抗體及其應用。該針對人CD22抗體的抗獨特型抗體包括3個抗體重鏈互補決定區和3個抗體輕鏈互補決定區；所述3個抗體重鏈互補決定區的氨基酸序列分別如序列表中序列1的第31-35位、第50-66位和第99-106位，所述3個抗體輕鏈互補決定區的氨基酸序列分別如序列表中序列1的第154-168位、第184-190位和第223-231位。該抗獨特型抗體特異性針對人CD22抗體，可以阻抑人CD22抗體與其自然配體人CD22抗原結合。
【專利說明】針對人CD22抗體的抗獨特型抗體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體及其應用。
【背景技術】
[0002]應用單克隆抗體(MAb)進行靶向治療并非是一種新奇或復雜的理念。然而，這一理念的實施涉及到多個學科知識技術的整合，包括抗體分子設計，細胞系優化，產業化生產，提純，配方優化和各種質控檢測，以確保所生產的單抗藥物能夠達到預期的臨床效果。到目前為止，已有上百個針對各種適應癥的治療性單抗產品處于各個臨床試驗階段。與之相對應，大量基于或衍生于抗體的理念和技術手段都隨著單抗產業的發展而日新月異，以期擴大現有產品的應用范圍。
[0003]其中一個衍生物基于免疫網絡學說，由Niels Jerne在1974年首先提出(參看JerneNK:1974.Ann Immunol 125C: 373-389)。Jerne 提出，免疫系統是一個通過抗獨特型抗體互相作用來進行調節控制免疫反應的一個網絡。這一認識后來被進一步拓展應用到抗獨特型抗體的其它用途。抗獨特型抗體通常也被叫做Ab2，是針對免疫抗體Abl (即免疫系統針對外來抗原產生的抗體)并對其獨特位(抗體分子表面獨特的抗原識別簇)具有特異性識別吸附能力的抗體。Ab2可以分成三個不同的類別:l)Ab2a識別原始Abl抗體上抗原結合部位(ABS)以外的獨特位；2)Ab2i3識別抗原結合部位的位點并模擬其對應空間結構，從而形成外來抗原的“內影像”;3)Ab2 Y同樣識別抗原結合部位的位點，但并不對外來抗原的結構進行模擬。
[0004]一般認為，最具吸引力的是Ab2抗體類型中Ab2 0抗體，尤其是當試圖用Ab2@抗體作為替代抗原發展針對自身抗原或惰性抗原的有效疫苗時，例如針對腫瘤特異抗原或腫瘤相關抗原的腫瘤疫苗，以及一些針對細菌，病毒和寄生蟲等病原體的疫苗。但是，其他類型的Ab2抗體也不可忽視，它們可以用來發展有關的檢測方法，協助具有藥用價值的治療性Ab I抗體的生產和臨床效價評估。
[0005]人⑶22抗原在成熟或惡性B細胞表面表達(Dr0ken et al.1989.LeucocyteTyping IV:White cell differentiation antigens.New York,Oxford UniversityPress.P.63-64)。⑶22是一種防止免疫系統過激反應或自身免疫疾病的調節分子(Hattaet al.1999.1mmunogenetics 49:280-286)。
[0006]SM03是由鼠源抗體RFB4衍生的一種抗⑶22嵌合抗體(楊蕾等。2006。重組抗B細胞淋巴瘤嵌合抗體的構建及鑒定。中國新藥雜志，15卷3期:186-192)，并已在非何氏淋巴瘤的治療上進入臨床試驗階段(Li et al.2012.Landes BioScience J 4(2):256-266)。由于SM03單抗以成熟B細胞為目標并抑制其功能，這一單抗產品應用已擴展到其它自身免疫疾病適應癥的治療，尤其是類風濕性關節炎(RA)和系統性紅斑狼瘡(SLE)。
[0007]對SM03單抗運用框架重塑技術進行的人源化改造進一步推進了抗⑶22抗體的應用(梁瑞安，等。2006。應用抗體“框架重塑”技術構建人源化抗體fSM03。中國新藥雜志，15卷21期:1832-1836)。經人源化改造的SM03單抗被命名為SM06。SM03和SM06針對人CD22抗原上的同一個位點，且具有類似的親和力。然而，在氨基酸序列和結構上，SM03和SM06只有抗原識別部位相同，這一相同部分由它們各自的互補決定區(CDR)序列構成。
[0008]SM03和SM06都能特異性識別吸附人⑶22抗原，而且結合后抗體-抗原復合體會發生明顯的內化。這一特性使得對SM03和SM06單抗產品的生物活性檢測變得十分困難。其它針對可內化抗原的抗體類產品也有類似的困難，例如恒定鏈，CD33等等。此外，臨床藥代動力學研究需要一個方便穩健的方法來測定游離SM03，SM06 (以及RFB4)和它們的各種衍生物(scFv單鏈抗體，Fab,雙體抗體，免疫毒素，藥物結合體等等)的含量，用以評估其血清半衰期。由于可溶性游離⑶22并不普遍，且外源性⑶22較不穩定，一種合適的針對SM03及其衍生物的抗獨特型抗體就顯得極具應用價值。
【發明內容】

[0009]本發明所要解決的一個技術問題是提供針對人CD22抗體的抗獨特型抗體，該抗獨特型抗體特異性針對人CD22抗體(“CD22抗體族”)，可以吸附“CD22抗體族”，其吸附片段對“CD22抗體族”抗體分子可變區具特異性反應，其吸附片斷具體對“CD22抗體族”抗體分子抗原結合部位(ABS)具特異性反應。該抗獨特型抗體可以阻抑人CD22抗體與其自然配體人⑶22抗原結合。
[0010]本發明中所述人⑶22抗體均為含有如下3個抗體重鏈互補決定區和3個抗體輕鏈互補決定區，且能夠與人⑶22抗原特異性結合的抗體:重鏈OTR1的序列是IYDMS、重鏈CDR2的序列是YISGGGTTYYPDTVKG、重鏈CDR3的序列是HSGYGSSYGVLFAY，輕鏈CDR1的序列是RASQDISNYLN、輕鏈CDR2的序列是YTSILHS、輕鏈CDR3的序列是QQGNTLPWT。所述人CD22抗體包括鼠源抗體(如RFB4)，嵌合抗體(如SM03)、人抗體、和人源化抗體(如SM06)以及它們的各型衍生物如scFv單鏈抗體，雙抗體，雙特異性抗體，抗體結合體及其他各種形式抗體融合蛋白等，統稱“CD22抗體族”。
[0011]本發明所提供的針對人CD22抗體的抗獨特型抗體，它包括3個抗體重鏈互補決定區和3個抗體輕鏈互補決定區(圖3中的6個框區域)；所述3個抗體重鏈互補決定區的氨基酸序列分別如序列表中序列I的第31-35位(⑶R1X第50-66位(⑶R2)和第99-106位(CDR3),所述3個抗體輕鏈互補決定區的氨基酸序列分別如序列表中序列I的第154-168位(CDR1)、第 184-190 位(CDR2)和第 223-231 位(CDR3X
[0012]其中，該抗獨特型抗體的上述6個互補決定區形成與人CD22抗體的獨特型部分特異結合的結構。下述實施例1的實驗證明，含有上述6個互補決定區的單鏈抗體可與3種人⑶22抗體(RFB4、SM03和SM06)特異性結合，這3種人⑶22抗體的序列相同部分只有3個抗體重鏈互補決定區和3個抗體輕鏈互補決定區。所述人CD22抗體為含有序列表中序列8-10所示的3個抗體重鏈互補決定區和序列表中序列11-13所示的3個抗體輕鏈互補決定區的能與人CD22特異性結合的抗體，如RFB4、SM03和SM06。其中，序列8為CDR1的序列，序列9為CTR2的序列，序列10為CTR3的序列，序列10為CTR1的序列，序列11為CTR2的序列，序列12為OTR3的序列。
[0013]進一步，所述針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體包括重鏈可變區和輕鏈可變區；所述重鏈可變區的氨基酸序列如序列表中序列I的第1-116位，所述輕鏈鏈可變區的氨基酸序列如序列表中序列I的第131-240位。[0014]進一步，所述針對人CD22抗體的抗獨特型抗體具體可為:
[0015]a)重鏈的氨基酸序列是序列表中的序列2，輕鏈的氨基酸序列是序列表中的序列3 (下述實施例3的包含輕重鏈恒定區序列的抗獨特型鼠源IgG2a/kappa免疫球蛋白分子IdmG2a/k)；
[0016]b)將序列表中的序列2中除所述3個抗體重鏈互補決定區外的氨基酸序列進行氨基酸殘基的取代、缺失或添加，和/或將序列表中的序列3中除所述3個抗體輕鏈互補決定區外的氨基酸序列進行氨基酸殘基的取代、缺失或添加得到的針對人CD22抗體的抗獨特型抗體，優選為將所述序列2中除第1-117位的重鏈可變區外的氨基酸序列進行氨基酸殘基的取代、缺失或添加，和/或將所述序列3中除第1-111位的輕可變區外的氨基酸序列進行氨基酸殘基的取代、缺失或添加得到的針對人CD22抗體的抗獨特型抗體；
[0017]c)序列表中的序列I所示的單鏈抗體(下述實施例1和2中圖3所示的單鏈抗體)，或在序列表中序列I的氨基端或羧基端加上組氨酸標簽得到的融合蛋白；
[0018]d)將序列表中的序列I除所述3個抗體重鏈互補決定區和所述3個抗體輕鏈互補決定區外的氨基酸序列進行氨基酸殘基的取代、缺失或添加得到的針對人CD22抗體的抗獨特型抗體，優選為將所述序列表中序列I的第117-130位所示的連接肽序列進行氨基酸殘基的取代、缺失或添加得到的針對人CD22抗體的抗獨特型抗體；
[0019]e)重鏈的氨基酸序列是序列表中的序列6 ;輕鏈的氨基酸序列是所述序列表中的序列3 (下述實施例5的IdGmFdA,圖14顯示的是IdGmFdA的重鏈氨基酸序列)；
[0020]f )重鏈的氨基酸序列是序列表中的序列7 ;輕鏈的氨基酸序列是所述序列表中的序列3 (下述實施例5的IdGmFdG,圖15顯示的是IdGmFdG的重鏈氨基酸序列)；
[0021]g)重鏈的氨基酸序列是序列表中的序列4 ;輕鏈的氨基酸序列是所述序列表中的序列3 (下述實施例5的IdGmD，圖12顯示的是IdGmD的重鏈氨基酸序列)；
[0022]h)重鏈的氨基酸序列是序列表中的序列5 ;輕鏈的氨基酸序列是所述序列表中的序列3 (下述實施例5的IdDmD，圖13顯示的是IdDmD的重鏈氨基酸序列)。
[0023]其中，序列表中的序列I由240個氨基酸殘基組成，序列表中的序列2由447個氨基酸殘基組成，序列表中的序列3由219個氨基酸殘基組成，序列表中的序列4由502個氨基酸殘基組成，序列表中的序列5由408個氨基酸殘基組成，序列表中的序列6由305個氨基酸殘基組成，序列表中的序列7由264個氨基酸殘基組成。
[0024]其中，針對人CD22抗體的抗獨特型抗體可以多種形態表達為附膜蛋白，這些形態包括:跨膜IgD抗體(下述實施例5的IdGmD和IdDmD)，或與糖蛋白A (下述實施例5的IdGmFdA)或GPI蛋白融合(下述實施例5的IdGmFdG)的單鏈抗體scFv,Fab,Fab’，F(ab’)2。
[0025]編碼上述任一種針對人CD22抗體的抗獨特型抗體的核酸分子屬于本發明的保護范圍。
[0026]其中，所述核酸分子可以是DNAjB cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以是RNA,如mRNA或hnRNA等。
[0027]所述核酸分子具體可為如下I) -6)中任一所述的基因:
[0028]I)上述a)所述抗體的重鏈的編碼序列是序列表中的序列9，上述a)所述的抗體的輕鏈鏈的編碼序列是序列表中的序列10 ；
[0029]2)上述c)所述抗體的編碼序列是序列表中的序列8 ；[0030] 3)上述e)所述抗體的的重鏈的編碼序列是序列表中的序列13，上述e)所述抗體的輕鏈鏈的編碼序列是序列表中的序列10 ；
[0031]4)上述f)所述抗體的的重鏈的編碼序列是序列表中的序列14，上述f)所述抗體的輕鏈鏈的編碼序列是序列表中的序列10 ；
[0032]5)上述g)所述抗體的的重鏈的編碼序列是序列表中的序列11，上述g)所述抗體的輕鏈鏈的編碼序列是序列表中的序列10 ；
[0033]6)上述h)所述抗體的的重鏈的編碼序列是序列表中的序列12，上述h)所述抗體的輕鏈鏈的編碼序列是序列表中的序列10。
[0034]其中，序列表中的序列I由240個氨基酸殘基組成，由序列表中的序列8的DNA編碼，序列8由720個核苷酸組成；序列表中的序列2由447個氨基酸殘基組成，由序列表中的序列9的DNA編碼，序列9由1344個核苷酸組成；序列表中的序列3由219個氨基酸殘基組成，由序列表中的序列10的DNA編碼，序列10由660個核苷酸組成；序列表中的序列4由502個氨基酸殘基組成，由序列表中的序列11的DNA編碼，序列11由1509個核苷酸組成；序列表中的序列5由408個氨基酸殘基組成，由序列表中的序列12的DNA編碼，序列12由1227個核苷酸組成；序列表中的序列6由305個氨基酸殘基組成，由序列表中的序列13的DNA編碼，序列13由918個核苷酸組成；序列表中的序列7由264個氨基酸殘基組成，由序列表中的序列14的DNA編碼，序列14由795個核苷酸組成。
[0035]下述al、a2或a3的生物材料也屬于本發明的保護范圍:
[0036]al.含有上述任一種核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或重組細胞系；
[0037]a2.表達上述任一種針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體的重組表達載體、重組微生物或重組細胞系；
[0038]a3.表達任一種基因的重組表達載體、重組微生物或重組細胞系。
[0039]上述生物材料中，al所述的表達盒，是指能夠在宿主細胞中表達上述任一種針對人CD22抗體的抗獨特型抗體的DNA，該DNA不但可包括啟動上述任一種針對人CD22抗體的抗獨特型抗體基因轉錄的啟動子，還可包括終止上述任一種針對人CD22抗體的抗獨特型抗體基因轉錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。a2和a3所述的重組微生物具體可為酵母，細菌，藻和真菌。a2和a3所述的重組細胞系不包括植物的繁殖材料，具體可為細胞膜表面表達上述任一種針對人CD22抗體的抗獨特型抗體的重組細胞系(細胞株)。
[0040]本發明還提供了上述任一種針對人CD22抗體的抗獨特型抗體的下述多個用途:[0041 ] bl.檢測人⑶22抗體濃度的試劑，其活性成分為上述任一種針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體；
[0042]b2.檢測由人CD22抗體引起的人抗鼠抗體反應的試劑，其活性成分為上述任一種針對人CD22抗體的抗獨特型抗體；
[0043]b3.檢測由人CD22抗體引起的人抗嵌合抗體反應的試劑，其活性成分為上述任一種針對人CD22抗體的抗獨特型抗體；
[0044]b4.檢測由人CD22抗體引起的人抗人抗體反應的試劑，其活性成分為上述任一種針對人CD22抗體的抗獨特型抗體；
[0045]b5.檢測人CD22抗體介導的補體依賴細胞毒反應的試劑，其活性成分為細胞膜表面表達上述任一種針對人CD22抗體的抗獨特型抗體的重組細胞系；
[0046]b6.檢測人CD22抗體介導的抗體依賴細胞介導細胞毒反應的試劑，其活性成分為細胞膜表面表達上述任一種針對人CD22抗體的抗獨特型抗體的重組細胞系；
[0047]bl.檢測人⑶22抗體生物活性的試劑，其活性成分為細胞膜表面表達上述任一種針對人CD22抗體的抗獨特型抗體的重組細胞系；
[0048]b8.上述任一種針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體在制備檢測人⑶22抗體濃度試劑中的應用；
[0049]b9.上述任一種針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體在制備檢測由人⑶22抗體引起的人抗鼠抗體反應試劑中的應用；
[0050]bl0.上述任一種針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體在制備檢測由人⑶22抗體引起的人抗嵌合抗體反應試劑中的應用；
[0051]bll上述任一種針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體在制備檢測由人⑶22抗體引起的人抗人抗體反應試劑中的應用；
[0052]bl2.細胞膜表面表達上述任一種針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體的重組細胞系在制備檢測人CD22抗體介導的補體依賴細胞毒反應試劑中的應用；
[0053]bl3.細胞膜表面表達上述任一種針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體的重組細胞系在制備檢測人CD22抗體介導的抗體依賴細胞介導細胞毒反應試劑中的應用；
[0054]bl4.細胞膜表面表達上述任一種針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體的重組細胞系在制備檢測人CD22抗體生物活性試劑中的應用；
[0055]bl5.檢測人CD22抗體對腫瘤細胞的穿透性和/或吸附性試劑，其活性成分為權利要求1-3中任一所述抗體。
[0056]bl6.上述任一種針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體在制備檢測人⑶22抗體對腫瘤細胞的穿透性和/或吸附性試劑中的應用。
[0057]其中，上述bl和b8具體可為將上述任一種針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體作為診斷試劑來監測免疫治療中患者血液中人CD22抗體的含量，監測所注射人CD22抗體藥物的藥代動力學行為。可按照如下方法檢測樣品血清中“CD22抗體族”(人CD22抗體)抗體
含量:
[0058]I)用上述任一種針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體包被ELISA酶標板，上述任一種針對人⑶22抗體包括scFv單鏈抗體，或完整IgG，或鼠源IgG2a/kappa種型，及其它同種型；
[0059]2)在酶標板上加入待測血清樣本；
[0060]3)在酶標板上加入諸如過氧化物酶標記的抗人Fe特異性抗體這樣的二抗以及；
[0061]4)根據吸附的二抗多少測得待測血清中的抗人⑶22抗體含量。
[0062]上述b7和bl4中，細胞膜表面表達上述任一種針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體的重組細胞系可以通過抗體介導，發生補體依賴細胞毒反應(CDC)或抗體依賴細胞介導細胞毒反應(ADCC)，用以快速估測人⑶22抗體(如SM03或SM06)的生物活性，從而達到質量控制的目的。利用細胞膜表面表達上述任一種針對人CD22抗體的抗獨特型抗體的重組細胞系，通過補體依賴細胞毒反應評估人⑶22抗體生物學活性的檢測方法，具體可包含以下步驟:[0063]I)將細胞膜表面表達上述任一種針對人CD22抗體的抗獨特型抗體的重組細胞系與抗CD22抗體共同孵育；
[0064]2)在混合物中加入補體蛋白；
[0065]3)孵育適宜時間后量度其補體依賴細胞毒效應(⑶C)的效果。
[0066]利用細胞膜表面表達上述任一種針對人CD22抗體的抗獨特型抗體的重組細胞系，通過抗體依賴細胞介導細胞毒效應評估人CD22抗體生物學活性的檢測方法，具體可包含以下步驟:
[0067]I)將細胞膜表面表達上述任一種針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體的重組細胞系與抗CD22抗體共同孵育；
[0068]2)加入外周血單核細胞(PBMC);
[0069]3)孵育適宜時間后量度其抗體依賴細胞介導細胞毒效應(ADCC)的效果。
[0070]上述b2-b4、b9_bll具體可為將上述任一種針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體作為HAHA, HACA或HAMA等抗抗體免疫反應研究中的陽性對照。由于這些抗抗體反應可能會影響病人的臨床結果(Gruber van Haarlem et al.2000.Cancer Res.60:1921-1926),或與非預期的過敏反應相關，導致顯著的藥代動力學行為改變及影響注射抗體藥物的體內分布，因此對其監測會對抗體免疫治療的治療選項產生重要影響。本發明所提供的檢測注射了嵌合或人源化抗人CD22單克隆抗體的個體中由人CD22抗體引起的人抗嵌合抗體反應(HACA)或人抗人抗體反應(HAHA)的方法包含如下步驟:
[0071]I)從接受注射的個體收集血清樣本；
[0072]2)在ELISA酶標板上包被⑶22抗原，同時加入靈敏濃度的抗⑶22游離抗體，加入不同倍數稀釋的血清樣本，不加入血清樣本的孔作為陰性對照，加入一定濃度抗CD22獨特型抗體的孔作為陽性對照；
[0073]3)清洗后加入HRP標記的抗人IgG Fe 二抗，檢測靈敏濃度的抗⑶22抗體對⑶22抗原的吸附信號；
[0074]4)檢測血清樣本中抗CD22抗獨特型抗體的存在與否，如抗CD22抗獨特型抗體存在則佐證了個體中HACA或HAHA反應的發生。
[0075]上述bl5和bl6中，可將上述任一種針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體(如下述實施例3的包含輕重鏈恒定區序列的抗獨特型鼠源IgG2a/kappa免疫球蛋白分子，)應用腫瘤組織切片免疫組織化學分析，研究“⑶22抗體族”藥物對腫瘤細胞的穿透性和/或吸附性。
[0076]本發明提供了一種特異性辨識抗人⑶22抗體(包括鼠源抗體(如RFB4)，嵌合抗體(如SM03)、人抗體、和人源化抗體(如SM06)以及它們的各型衍生物如scFv單鏈抗體，雙抗體，雙特異性抗體，抗體結合體及其他各種形式抗體融合蛋白等，統稱“CD22抗體族”)抗原結合部位(ABS)的抗獨特型抗體，即針對人CD22抗體的抗獨特型抗體。本發明提供的針對人CD22抗體的抗獨特型抗體，可應用于辨識及評估“CD22抗體族”抗體的濃度和生物活性，并用于臨床定量分析血清中的“CD22抗體族”抗體含量。本發明還可應用于檢測“CD22抗體族”單抗藥物臨床試驗中病人可能出現的人抗鼠抗體反應(HAMA)，人抗嵌合抗體反應(HACA)和人抗人抗體反應(HAHA)。同時，還提供了構建能表達針對人CD22抗體的抗獨特型抗體的細胞系的方法；并將此類細胞用于檢測“CD22抗體族”單抗產品介導的補體依賴細胞毒反應(CDC)和/或抗體依賴細胞介導細胞毒反應(ADCC)的，實現了單抗產品的生物活性檢測和評估。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0077]圖1為表達scFv單鏈抗體的噬菌體#1_#3對鼠源⑶22抗體(RFB4)，人鼠嵌合⑶22抗體(SM03)，人源化⑶22抗體(SM06)的特異性吸附。
[0078]圖2A為噬菌體#1_#3所表達的重鏈互補決定區(⑶R)序列。
[0079]圖2B為噬菌體#1_#3所表達的輕鏈CDR序列。 [0080]圖3為對RFB4，SM03，SM06具有特異性識別吸附的噬菌體#3所展示的scFv序列完整序列。所框區域為補充決定區。scFv單鏈抗體構成為重鏈可變區-連接序列-輕鏈可變區。所用連接氨基酸序列為G4-S-G-S-G-S-S-G4。
[0081]圖4為噬菌體#3表達的可容性scFv可以在流式細胞計數實驗中抑制SM03抗體對Raji細胞的吸附。從左至右的三個峰分別為空白對照、SM03+scFv (phage#3)和SM03。
[0082]圖5為采用噬菌體#3表達的可容性scFv測得的SM03治療的淋巴瘤患者藥代動力學表現(360mg/m2劑量組，靜脈注射，每周一次，連續給藥4周)。
[0083]圖6為表達鼠源IgG2a/kappa免疫球蛋白抗獨特型抗體IdmG2a/的可擴增DNA載體。
[0084]圖7為IdmG2a/k的提純抗體在還原和非還原情況下的SDS-PAGE電泳圖。圖中，I和2為還原電泳結果,3為分子量標準(BenchMark?蛋白分子量標準,美國Invitrogen公司產品，批次:688736)，4和5為非還原電泳結果。
[0085]圖8為IdmG2a/k可以被SM03特異性識別，而其它抗體不能吸附(⑶20抗體(hAnt1-CD20)，CD147 抗體(hAnti_CD147)，TNF 抗體(Infliximab))。
[0086]圖9為流式細胞技術結果顯示抗獨特型鼠源IgG抗體IdmG2a/k可以有效的阻抑SM03吸附Raji細胞表面的⑶22抗原。
[0087]圖10為鼠源⑶22抗體RFB4，嵌合抗體SM03及運用框架重塑技術的人源化抗體SM06都可以與HRP標記的SM03抗體競爭吸附到抗獨特型鼠源IgG抗體IdmG2a/k
[0088]圖11為運用SM03單抗產品進行治療的紅斑狼瘡患者藥代動力學表現。SM03的血藥濃度由ELISA方法測得，IdmG2a/k作為固相捕捉抗體。
[0089]圖12為將鼠源IgD的跨膜區序列與“鼠源抗獨特型IgG抗體”的CH3區域融合得到的跨膜針對人CD22抗體的抗獨特型抗體IdGmD的重鏈氨基酸序列。
[0090]圖13為將IgG2a重鏈用鼠源IgD序列代替得到跨膜的針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體IdDmD的重鏈氨基酸序列。
[0091]圖14為通過附膜Fab-糖蛋白融合蛋白的形式表達跨膜的針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體IdGmFdA的重鏈氨基酸序列。
[0092]圖15為以Fab-GPI固定融合蛋白的形式表達“鼠源抗獨特型IgG”抗體的針對人CD22抗體的抗獨特型抗體IdGmFdG的重鏈氨基酸序列。
[0093]圖16為抗獨特型鼠源IgG抗體各種融合蛋白形式的轉染細胞系膜上表達情況。
[0094]從上至下的五個圖片依次為沒有加入SM03的SP2/0細胞體系、加入SM03至終濃度為I μ g/ml的SP2/0細胞體系、加入SM03至終濃度為0.1 μ g/ml和I μ g/ml的表達IdDmD的重組工程細胞體系、加入SM03至終濃度為0.1 μ g/ml,0.1 μ g/ml和I μ g/ml的表達IdGmFdA的重組工程細胞體系、加入SM03至終濃度為0.1 μ g/ml、0.1 μ g/ml和I μ g/ml的表達IdGmFdG的重組工程細胞體系。
[0095]圖17為SM03抗體介導針對跨膜表達各種抗獨特型鼠源IgG抗體融合蛋白轉染細胞系的補體依賴細胞毒反應(OTC)的比較(從上至下的三個圖片依次為IdGmD、IdGmFdA、IdGmFdG)
【具體實施方式】[0096]為了便于更全面的理解本發明描述，一些基本定義在此聲明定義如下:
[0097]本文中“免疫球蛋白”這一定義是指由一條或多條多肽鏈構成的，大部分由免疫球蛋白相關基因編碼的蛋白質分子。已破解的免疫球蛋白基因編碼包括kappa, lamda, alpha，gamma (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), delta, epsilon和mu這些恒定區基因，以及無數的免疫球蛋白可變區基因。完整的免疫球蛋白“輕鏈”(由214個氨基酸構成，分子量約25Kd)由氨基端的可變區基因(約110個氨基酸)和羥基端的kappa或Iamda恒定區基因編碼構成。類似地，完整的免疫球蛋白“重鏈”(由446個氨基酸構成，分子量約50Kd)由可變區基因編碼(約116個氨基酸)和前文所描述其中一個恒定區基因編碼構成，如gamma恒定區基因(約300個氨基酸)編碼構成IgG分子。
[0098]除非特別指明，本文中所用的“抗體”這一定義被廣泛用來指代完整抗體分子以及其衍生物。這些衍生物至少包含了一段來自免疫球蛋白輕鏈或重鏈的可變區片斷，并包含諸如F(ab’)2, Fab, Fab’，Fd, Fabc, scFv,雙抗體,單一抗體輕鏈,單一抗體重鏈,抗體鏈嵌合融合物，雙特異抗體以及其他類似分子這樣的抗體分子片斷。
[0099]本文中所用的“嵌合抗體”這一定義是指由非人類屬種生物的免疫球蛋白輕重鏈可變區與人類免疫球蛋白分子恒定區重組設計而成的蛋白分子。
[0100]本文中所用的“人源化”這一定義是指僅來自非人類屬種生物的免疫球蛋白分子可變區互補決定區(CDR)的部分保留，其余的主要可變區部分及全部恒定區部分均來為人源，經過重組設計而成的蛋白分子。
[0101]本文中所用的“獨特型”這一定義是指抗體分子上決定對抗原特異性的特殊片斷。獨特型片斷位于抗體Fab部分，對于它的描述通常基于抗體分子重鏈輕鏈的共同參與形成抗原結合部位。
[0102]本文中所用的“同種型”這一定義是指由免疫球蛋白分子的抗原特異性決定，根據重鏈類別和亞類，以及輕鏈型別所分的免疫球蛋白分子類型及其亞型。例如，IgG的四個同種型為 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4O
[0103]本文所描述的“⑶22抗體族”由鼠源抗體RFB4衍生而來。它所衍生的嵌合抗體(SM03)和人源化抗體(SM06)與原始鼠源抗體一樣，針對人CD22抗原上的B位點具特異性。運用SM03治療B細胞淋巴瘤和其他自身免疫疾病的臨床試驗已經起步。在臨床實踐中，為了滿足臨床上測定血清中所注射的“CD22抗體族”產品(如SM03單抗)含量的需求，構建并定性了一種抗獨特型抗體，作為ELISA試劑來測定患者血清中的“CD22抗體族”產品濃度。此外，所產生的抗獨特型抗體還可以用在ELISA方法中衡量HACA或HAHA反應，亦或作為對照抗體及用作診斷試劑估測患者血清中的競爭性抗體。
[0104]單鏈抗體形式的抗獨特型抗體由經SM03免疫的小鼠，并用噬菌體展示的方法產生。具體方法為從注射抗CD22嵌合抗體SM03的小鼠身上提取脾臟細胞，并分離mRNA，然后簡并側翼可變區引物擴增輕重鏈可變區序列。之后按照標準步驟將所得可變區序列引入scFv單鏈抗體噬菌體展示庫。經過幾輪用SM03和RFB4抗體進行的篩選淘汰后，選出針對SM03，RFB4和SM06具特異性的噬菌體，且所選噬菌體展示相應的可變區序列。在展示抗體可變區序列的噬菌體中，選擇對鼠源，嵌合和人源化“CD22抗體族”具有最高親和力的展示噬菌體。
[0105]抗獨特型抗體序列最初在大腸桿菌中以scFv單鏈抗體包含體的形式表達，之后會變性及再折疊；具活性的scFv單鏈抗體被用作ELISA試劑檢測臨床試驗中的血清SM03含量。簡要步驟如下，就是用再折疊的抗獨特型scFv單鏈抗體(scFv)包被ELISA酶標板，再將SM03治療的患者血清稀釋后加入，經過孵育，清洗，患者血清中的SM03抗體就會與所包被的抗獨特型scFv單鏈抗體結合,其特異性結合可以用HPR標記的羊抗人IgG-Fc特異性抗體(美國Jackson ImmunoResearch公司產品)顯色。然而，抗獨特型scFv單鏈抗體有不穩定的傾向，并且從細菌包含體中產生的方式會導致蛋白變性和再折疊的多樣性，使檢測結果一致性不高。此外，抗獨特型scFv單鏈抗體的不穩定性，使得它的儲存和隨后的驗證批次制備變得十分困難。
[0106]而另一方面，眾所周知，完整的免疫球蛋白分子能夠在合適的儲存條件下保持數月乃至數年的穩定性，其抗體活性和質量也不會發生明顯變化。為了創建穩定且結果一致的檢測方法來估測血清中的CD22抗體，以及HACA和HAHA反應，抗獨特型scFv單鏈抗體的可變區序列被用來構建一種完整地免疫球蛋白分子。由于“CD22抗體族”中的嵌合抗體和人源化抗體都具有人IgGl重鏈和kappa輕鏈的恒定區序列，它們因此可以被ELISA通常所用的HRP標記抗人IgG Fe特異性抗體(或類似的結合體)所識別。因此，所設計的抗獨特型抗體免疫球蛋白分子不應帶有會引起交叉反應的人IgG恒定區序列。鼠源IgG2a/kappa抗體(鼠源抗獨特型IgG抗體)恒 定區序列不會與抗人Fe抗體發生交叉反應，所以被選定來構建完整的抗獨特型抗體免疫球蛋白分子。需要注意的是，其它同種型或來自其它物種的恒定區序列也可采用。根據所設計的抗獨特型抗體免疫球蛋白，產生了產率達30ug/ml的表達細胞系。由于產生表達細胞系所采用的表達載體帶有可擴增的DHFR基因，這一產率可以在有需要的情況下按照一般的擴增-克隆方法進一步增加。然而，現階段產率已經足夠滿足產生一致批次的鼠源抗獨特型IgG抗體，并用于藥代動力學研究及HACA或HAHA檢測。簡要步驟如下，就是用鼠源抗獨特型IgG抗體包被ELISA酶標板，再加入用“CD22抗體族”抗體藥物治療的患者血清，經過孵育，不與“鼠源抗獨特型IgG抗體”吸附的蛋白會被清洗干凈。而血清中的抗⑶22抗體會特異性地與所包被的“鼠源抗獨特型IgG抗體”結合，并用HRP標記羊抗人IgG Fe特異性抗體顯色。由于“鼠源抗獨特型IgG抗體”的鼠源恒定區序列并不會檢測用的HRP標記抗體發生交叉反應，這一檢測方法并不會發生高本底信號的問題。這一檢測方法經驗證具有高度可重復性，靈敏度和特異性。同樣的方法被拓展應用到估測“CD22抗體族”的辨識度和親和力。應用“鼠源抗獨特型IgG抗體”作為陽性對照，建立血清樣本的HACA和HAHA的Biacore分析方法，實現患者血清抗抗體免疫反應也成為可能。另外，“鼠源抗獨特型IgG抗體”也可以被應用腫瘤組織切片免疫組織化學分析，研究“CD22抗體族”藥物對腫瘤細胞的穿透性和吸附性。能夠特異性結合目標抗體的“鼠源抗獨特型IgG抗體”的產生，為臨床意義上高靈敏度地評估注射目標抗體藥物的安全性和藥代動力學性質提供了原料試劑。本發明所構建的“鼠源抗獨特型IgG抗體”因此而獲證為一種具重要實用價值的診斷實驗試劑，用于研究接受SM03免疫治療的患者臨床樣本。
[0107]本發明的一個方面是為檢測“鼠源抗獨特型IgG抗體”對“CD22抗體族”對其抗原吸附的阻抑作用提供方法。另一個方面是為檢測“鼠源抗獨特型IgG抗體”捕捉并檢測所吸附的獨特型抗體的能力提供方法。更深一層含義為檢測“鼠源抗獨特型IgG抗體”對其獨特型抗體(抗CD22抗體)的吸附能力提供方法。然而，另一方面也是為檢測“CD22抗體族”在血清樣本中的含量提供方法。本發明也同樣指向一個用本專利所描述抗體進行檢測HAMA, HACA及HAHA反應的方法。
[0108]本發明的另一種應用是利用抗獨特型抗體構建非內化跨膜表達SM03-特異吸附片斷工程細胞系。所建細胞系能用來建立評估SM03單抗及其衍生物如RFB4，SM06等生物功效的檢測方法。這一方法的建立意味著用類似方法實現吸附可內化表面抗原的抗體生物學功效的檢測具有普遍意義。
[0109]以下實驗例證為說明本發明用途所列，但并不代表本發明的局限于此類應用。
[0110]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0111]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0112]實施例1、以單鏈抗體形式存在的針對人CD22抗體的抗獨特型抗體
[0113]本實施例運用噬菌體展示庫技術獲得抗SM03抗獨特型抗體的可變區輕重鏈序列，進一步制備得到針對人CD22抗體的抗獨特型單鏈抗體——噬菌體#3表達的可溶性ScFv0具體步驟如下:
[0114]1、利用注射SM03免疫接種的小鼠制備噬菌體展示庫
[0115]約6周大的雌性Balb/c小鼠被免疫接種，方法為按照標準免疫接種步驟(參看《InAntibodies:A Laboratory Manual》1988 年由美國 Cold Spring Harbor Laboratory 出版)腹膜內注射IOOug SM03單抗，并用200uL完全弗氏佐劑(美國Sigma-Aldrich公司產品)乳化。第二次及第三次免疫接種分別在相隔14天和35天后進行，方法均為腹膜內注射100ugSM03單抗(中國抗體制藥有限公司)，配合200uL不完全弗氏佐劑進行乳化(美國Sigma-Aldrich 公司產品)。
[0116]測定小鼠血清中的SM03抗體滴度后,免疫接種39天后的小鼠脾臟細胞被用來分離全RNA及制備cDNA(使用Superscript II試劑盒,美國Invitrogen公司產品)。然后根據相關文獻中合成簡并引物，利用PCR擴增免疫球蛋白可變區基因序列(Cheng et al.2005.Biochem Biophys Res Commun 338:1654-1660)。隨后，按照美國 Amersham 公司的重組曬菌體抗體系統產品指南，構建可變區片斷單鏈抗體(scFv)曬菌體展示庫。
[0117]參照相關文獻進行可變區片斷scFv單鏈抗體噬菌體展示庫和絲狀噬菌體的擴增后，用SM03單抗和鼠源CD22單抗RFB4 (Ancell, Cat: 171-820)進行篩選淘汰(McWhirteret al.2006.PNAS 103:1041-1046)。簡要步驟如下，將相同含量(100ug/ml)的SM03或鼠源RFB4抗體用碳酸氫鹽緩沖液(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3)進行包被，用生物篩選的方法篩選濃度為IO12的噬菌體。經過2小時輕微震蕩條件的室溫孵育，所吸附的scFv噬菌體用IOOuL的0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH2.2經10分鐘的孵育洗脫，再用IOuL的IM Tris-HCl,pH8.0的中和緩沖液中和。這一篩選過程重復四次，并紀錄每次篩選前后的噬菌體滴度。
[0118]在篩選過程存活的噬菌體經拯救，其吸附特異性用噬菌體-ELISA的方法進行評估，用抗CD22抗體RFB4，SMO3及SMO6 (中國抗體制藥有限公司)，以及其它對照抗體作為抗原進行進一步篩選。方法簡單描述如下，在96孔ELISA酶標板中，分別包被RFB4，SM03,SM06，嵌合抗TNF抗體以及BSA(使用50uL pH9.6的碳酸氫鹽包被緩沖液，包被量為Iug ;經4°C孵育過夜后，用200uL pH8.0的硼酸緩沖液進行沖洗；再同樣用硼酸緩沖液在37°C封閉1小時)，對SM03有最高吸附親和力的三個噬菌體克隆(IOOuL的上清液)被加入孔中37°C孵育1小時。經過5次pH8.0的硼酸緩沖液的沖洗，HRP標記的抗M13小鼠抗體(Amersham公司產品)經1:3000稀釋后加入。經過37°C孵育I小時后，使用IOOuL的O-對苯二胺(OPD)反應液(IOmgOPD溶于IOmL含8uL30%雙氧水溶液的檸檬酸磷酸鹽緩沖液，pH5.0)進行顯色。篩選結果如圖1所示，所選的三個scFv展示噬菌體(噬菌體#1_#3)都可以吸附RFB4，SM03和SM06 (鼠源，嵌合及人源化的CD22抗體)但不能吸附其他抗體(抗TNF抗體(英夫利昔單抗))或對照蛋白(BSA)。由于RFB4，SM03和SM06的序列相同部分只有目標抗體上的CDR部分，或抗原結合部位，這一結果說明所選的三個scFv展示噬菌體都對SM03的獨特型部分具有特異性。
[0119]2、可特異性吸附SM03抗原結合部分的scFv展示噬菌體可變區序列的測定
[0120]所選展示噬菌體的scFv編碼DNA序列用桑格測序法進行測序。對應抗體可變區的DNA序列非常類似，唯有在框架片斷或CDR3片斷的零星位置有部分差異。圖2展示了所選噬菌體所展示的輕重鏈序列中的CDR片斷序列，噬菌體#1_#3所展示的scFv的重鏈的3個⑶R完全相同，噬菌體#1_#3所展示的scFv的輕鏈的⑶Rl和⑶R2完全相同，唯有噬菌體#2所表達的輕鏈⑶R3區域有一個氨基酸(圖2中下劃線標記)。
[0121]3、展示的scFv序列的噬菌體#3能夠阻抑SM03抗體吸附Raji細胞
[0122]由于噬菌體#3顯示出了相對較高的吸附親和力，其單鏈序列被回復成DNA編碼并運用分子克隆技術構建了 scFv細菌表達載體。噬菌體#3所展示的scFv序列完整序列如圖3。噬菌體#3所展示的scFv序列編碼DNA (序列表中序列8)被連入pET3a載體(Novagen Cat:69418)載體并轉染入BL21 (DE3) pLys感應細胞進行表達。scFv的氨基端連有一個His-tag基因已便于表達后的提純。經過IPTG誘導表達，含有scFv的包含體經收集，變性(使用含6M鹽酸胍，20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，pH7.4的緩沖液)，折疊和用HItrapChelating HP分離柱按產品說明進行提純。簡要步驟如下，含His-tag的scFv經變性后，在Ni2+存在情況下吸附到HItrap Chelating HP分離柱。使用按照梯度逐步降低濃度的鹽酸胍緩沖液(含20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，pH7.4)進行沖洗直到沒有殘留的鹽酸胍存留。再以幾個柱床體積的5-40mM的咪唑緩沖液(含20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，pH7.4)進行沖洗。洗脫樣本合并，其中的蛋白可以用SDS-PAGE電泳的方法進行檢測。氨基酸序列測定結果表明，純化后所得蛋白為序列表中序列I的第I位氨基酸殘基的氨基端連上His-tag而得到的融合蛋白，該融合蛋白即為針對人CD22抗體的抗獨特型單鏈抗體，以下稱為噬菌體#3表達的可溶性scFv。
[0123]噬菌體#3表達的可溶性scFv可用來阻抑SM03抗體吸附Raji細胞表面表達的CD22抗原。實驗簡要步驟如下:將PBS清洗過的Raji細胞與SM03抗體共同孵育，同時加入不同濃度的噬菌體#3所表達的可溶性scFv，將僅加入SM03抗體的Raj i細胞作為對照，不加入任何試劑的Raji細胞作為空白對照(blank);經半小時室溫孵育及PBS清洗后，所有樣本中加入1:50稀釋的熒光標記的羊抗人IgG Fe特異性抗體作為二抗，室溫孵育半小時后經清洗，運用Beckman突光分析系統分析其突光信號。結果如圖4,表明加入100ug/ml的的組別，其流式細胞計數的結果顯示明顯的熒光信號下降，顯示噬菌體#3表達的可容性scFv可以有效得抑制SM03抗體吸附到Raji細胞表面的⑶22抗原。
[0124]實驗例2、利用實施例1中噬菌體#3表達的可溶性scFv進行SM03臨床試驗中的藥代動力學研究
[0125]由于實施例1中噬菌體#3表達的可容性scFv對SM03的特異性，因此可以用來發展相應的檢測方法來測定接受抗CD22抗體治療的患者血清中的抗體濃度，特別是協助臨床實踐所需的藥代動力學研究。用實施例1中噬菌體#3表達的可容性scFv包板96孔ELISA酶標板。經過BSA封閉，清洗，接受SM03治療的患者各個采血點血清經過稀釋后加入孔內。經過37°C孵育2小時和充分清洗,HRP標記羊抗人Fe抗體(Jackson Immunoresearch公司產品)經1:4000稀釋后加入孔內。酶標板再經過I小時的37°C孵育后，清洗5次，用TMB顯色液顯色，顯色信號按照標準ELISA檢測方法用450nm波長讀數，并以此計算所捕獲的SM03濃度。
[0126]圖5展示了 SM03的典型藥-時曲線，所用方法如上所述。患者血清樣本來自接受抗⑶22抗體SM03治療的惡性淋巴瘤患者，380mg/m2劑量組別，每周I次，連續給藥4周。血清樣本從給藥前后的不同時間點采集。
[0127]實施例3、以鼠源IgG2a/kappa免疫球蛋白分子形式存在的針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體IdmG2a/k
[0128]實施例1中噬菌體#3表達的可容性scFv制備需要細菌培養，誘導表達和包含體收集，蛋白變性折疊以及His-tag提純等一系列復雜的步驟。此外，scFv較不穩定且不易儲存。為了產生既保留實施例1中噬菌體#3表達的可容性scFv吸附特異性，又能被標準步驟提純及穩定易儲存的分子，實施例1中噬菌體#3表達的可溶性scFv重鏈可變區(VH)編碼DNA和輕鏈可變區(VK)編碼序列用PCR擴增并運用分子克隆技術整合進可擴增的表達載體pldmkappa-VK及pldmlgG-VH,它還包含了鼠源kappa輕鏈及IgG2a重鏈的恒定區部分序列(如圖6所示)。
[0129]該可擴增表達載體的構建方法是將編碼實例I中溶性scFv重鏈可變區(VH)編碼DNA和輕鏈可變區(VK)編碼序列連接到各自相應的鼠源kappa輕鏈及IgG2a重鏈可擴增表達載體的恒定區。其鼠源kappa輕鏈表達載體PIdmkappa-VK是一個約IOKb的表達載體。它源自于載體 pSVgpt(Mulligan&Berg 1981.PNAS 78:2072-2076),它包含了一個上游的 IgG增強子(Enhancer)，一個用來插入VK段的BamHI/Bglll和XbaI的克隆位點，和連著內含子(intron)的小鼠kappa輕鏈恒定區的基因序列。在輕鏈恒定區基因序列的下游，放置了一個用SV40啟動子表達的hygromycin選擇標記。輕鏈表達載體的構建方法如下^fpSVgpt的gpt選擇標記替換為hygromycin選擇標記,得到重組載體pSVhyg。在pSVhyg的EcoRI和BamHI的識別位點間插入319bp的Ig增強子并在BamHI位點前插入一個XbaI限制性內切酶識別位點，得到重組載體pSVhyg-1g。在pSVhyg-1g的BamHI和SacI識別位點間插入199bp的kappa增強子，得到重組載體pSVhyg_Ig_kappa。在pSVhyg_Ig_kappa的限制性內切酶SacI和BamHI識別位點間插入1.2Kb的連著內含子(intron)的鼠源kappa輕鏈恒定區片段，在BamHI和XbaI限制性內切酶位點之間連入噬菌體#3所展示的VK序列，得到鼠源kappa輕鏈表達載體P Idmkappa-VK。其中，319bp的Ig增強子核苷酸序列是自GeneBankAccession Number:K01901的5’末端的第I至第319脫氧核苷酸。199bp的kappa增強子核苷酸序列是自GeneBank Accession Number:K01325的5’末端的第I至199脫氧核苷酸。1.2Kb的內含子鼠源輕鏈恒定區片段的核苷酸序列是自GeneBank Accession Number:J00241的5’末端的第I至1209位脫氧核苷酸。
[0130]鼠源IgG2a重鏈表達載體pldmlgG-VH的構建方法大致相似，同樣為源自載體pSVgpt(Mulligan&Berg 1981.PNAS 78:2072-2076)的 IOKb 大小表達載體，它包含了一個上游的IgG增強子(Enhancer)，一個用來插入VH段的Xho I和HindIII克隆位點，和連著內含子(intixm)的小鼠IgG2a重鏈恒定區的基因序列。在重鏈恒定區基因序列的下游，放置了一個用SV40啟動子表達的gpt選擇標記。這一載體的構建方法如下:在pSVgpt的EcoRI和XhoI的識別位點間插入319bp的Ig增強子,得到重組載體pSVgpt-1g。在pSVgpt-1g的限制性內切酶HindIII和BamHI識別位點間插入2Kb的連著內含子(intron)的鼠源IgG2a重鏈恒定區片段，在XhoI和HindIII限制性內切酶位點之間連入噬菌體#3所展示的VH序列，得到鼠源IgG2a重鏈表達載體pldmlgG-VH。其中，319bp的Ig增強子和核苷酸序列是自GeneBank Accession Number:K01901的5’末端的第I至第319脫氧核昔酸。2Kb的連著內含子鼠源重鏈恒定區片段的核苷酸序列是自GeneBank Accession Number:J00228的5’末端的第I至2009位脫氧核苷酸。
[0131]這一表達載體可以被用來轉染多種哺乳動物宿主細胞系，包括但并不限于中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0或NSO，幼倉鼠腎(BHK)細胞系，人類胚胎腎細胞系293(HEK293)，非洲綠猴腎COS細胞系等等。本實施例中，選用了 SP2/0工程細胞系作為宿主，使用電擊穿孔轉染的方法按標準步驟進行了轉染。經過氨甲喋呤選擇，存活的克隆被用以檢驗其抗體表達。選擇陽性克隆進行擴增，經過數輪的擴增，表達抗體的重組工程細胞系被放大培養，其所產生的“鼠源抗獨特型IgG抗體”(以下稱為IdmG2a/k)也被收集并提純。同時，表達抗體的重組工程細胞系的RNA也被提取，經過RT-PCR方法和桑格測序法，得到IdmG2a/k的輕重鏈的cDNA編碼序列。經比對驗證，IdmG2a/k,其輕重鏈可變區序列與實施例1中噬菌體#3表達的可容性scFv的VH，VL片斷序列相同，同時帶有鼠源IgG2a重鏈及kappa輕鏈的恒定區。針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體IdmG2a/k的重鏈編碼DNA序列是序列表中的序列9，編碼序列表中序列2的氨基酸序列；IdmG2a/k的輕鏈編碼DNA序列是序列表中的序列10，編碼序列表中序列3的氨基酸序列。
[0132]表達IdmG2a/k的重組工程細胞系經過放大培養，其表達產生的抗體經過提取細胞培養上清，用蛋白A分離柱按標準步驟純化。純化的抗體可在PBS緩沖液中于4°C保存。圖7顯示了 IdmG2a/k的提純抗體在還原和非還原情況下的SDS-PAGE電泳圖樣。
[0133]重組工程細胞系表達的IdmG2a/k經純化可以用來按標準步驟包被ELISA酶標板。
[0134]在ELISA酶連板上每孔加入50uL 10ug/ml的IdmG2a/k，4°C過夜孵育進行包被。對包被完的酶標板，每孔加入不同濃度的60uLSM03抗體以及其它的非相關對照抗體，如抗⑶20抗體RituximaM美羅華，瑞士羅氏制藥公司產品)，抗⑶147抗體或者抗TNF抗體Infliximab(類克，瑞士 Cilag AG公司)。經過1.5小時室溫孵育，用PBS清洗3次后，加入1:5000稀釋的HRP標記的羊抗人Fe抗體(Jackson Immunoresearch公司產品)。再經過45分鐘室溫孵育后，其吸附可以用(PD顯色并用450nm波長讀數。結果顯示，重組工程細胞系表達的“鼠源抗獨特型IgG抗體”IdmG2a/k只能特異性吸附SM03，而非其它對照抗體(如圖8所示)。
[0135] 為了評估重組工程細胞系表達的IdmG2a/k與自然狀態下的⑶22抗原競爭吸附SM03抗體的能力，使用Raji (人類伯基特淋巴瘤)細胞系作為表面自然表達CD22抗原來源進行了流式細胞計數實驗。簡要步驟如下，0.5 X IO6個Raji細胞與lug/ml的SM03抗體及不同濃度的鼠源抗獨特型IgG抗體IdmG2a/k共同孵育，孵育條件為200uL的PBS-FA緩沖液(含1%胎牛血清FBS，0.01%疊氮化鈉的PBS溶液)4°C孵育30分鐘。用PBS清洗3次后，加入50倍稀釋的突光標記抗人Fe抗體(Jackson Immunoresearch公司產品)并繼續4°C孵育30分鐘。再用PBS清洗3次后，用含0.5%福爾馬林的PBS-FA緩沖液固定。經固定的細胞用PBS懸起,使用美國Becton Dickenson公司的FACScan分析系統進行流式細胞計數分析。結果顯示，抗獨特型抗體IdmG2a/k可以有效地按劑量抑制SM03吸附到其自然配體(圖 9)。
[0136]實施例4、利用實施例3的IdmG2a/k監測臨床實踐中的“⑶22抗體族”含量
[0137]1、實施例3的IdmG2a/k能特異性結合“⑶22抗體族”共有的抗原結合部位序列，能特異性地吸附鼠源，嵌合以及人源化的抗CD22抗體。
[0138]競爭性吸附檢測方法進一步表明，抗獨特型抗體的吸附位點位于抗原結合部位(ABS)序列，是鼠源抗體RFB4，嵌合抗體SM03及人源化抗體SM06唯一公有的序列。競爭性吸附檢測的方法簡要如下，在ELISA酶連板上每孔加入50uL 10ug/ml的實施例3的IdmG2a/k，4°C過夜孵育進行包被。次日用PBS清洗3次后，用200uL的3%BSA溶液室溫封閉2小時，再用PBS清洗5次。SM03抗體用HRP標記為SM03-HRP標記抗體(由天津天健生物科技有限公司標記)。1:4000稀釋后的SM03-HRP標記抗體，與不同濃度的競爭抗體，包括RFB4，SM03，SM06及其它一些非相關對照抗體(SM09、N005、N009)混合。混合后的抗體加入包被了實施例3的IdmG2a/k的ELISA酶連板。SM03-HRP標記抗體對所包被的抗獨特型抗體吸附水平之后可以用TMB顯色液顯色。
[0139]結果顯示，RFB4, SM03及SM06可以等效與SM03-HRP標記抗體競爭吸附到實施例3的IdmG2a/k，而其它的非相關抗體則沒有競爭吸附能力(如圖10所示)，表明實施例3的IdmG2a/k是特異性吸附到RFB4，SM03和SM06的共有序列，而非其它位點，這一共有序列即它們的抗原識別部位(ABS)。其中，對照抗體SM09、N005、N009 (中國抗體制藥有限公司)，針對非⑶22抗原，也不與抗⑶22抗體發生交叉反應。
[0140]2、利用實施例3的IdmG2a/k開發評估SM03臨床實驗中藥代動力學的標準檢測方法
[0141]隨著“鼠源抗獨特型IgG抗體”對“CD22抗體族”抗原結合部位吸附特異性的確認，開發了一種可已估測臨床實驗中患者血清中RFB4，SM03及SM06抗體含量的ELISA檢測方法。以下例證描述了估測SM03血清含量的檢測方法開發過程，這一方法也可推廣應用到“⑶22抗體族”的其它成員。簡要步驟如下所述，在96孔ELISA酶連板上每孔加入0.4ug/ml的實施例3的IdmG2a/k，包被條件為每孔50uLPBS，pH7.4，4°C孵育過夜；次日用1%BSA溶液室溫封閉2小時。接受SM03治療的患者血清樣本經稀釋一定倍數后，與不同濃度的外源SM03標準品復孔加入，稀釋液選用含0.1%的空白人血清PBS以去除血清對本底的影響。每孔加入50uL的樣品后室溫孵育2小時，經清洗后在加入1:4000稀釋的HRP標記羊抗人Fe抗體(Jackson Immunoresearch公司產品),室溫孵育I小時后清洗并加入TMB顯色。顯色信號用450nm波長的可見光讀板記錄。接受抗體治療患者外周血中殘留的SM03抗體濃度隨時間變化的情況可以通過與外源SM03標準品的比對而獲得。
[0142]圖11展示了一名接受SM03治療的患者的典型藥代動力學行為，所用檢測方法為前文所述的所開發的ELISA檢測方法。
[0143]實施例5、估測抗內化抗原抗體生物學功效的新型檢測方法
[0144]一、構建跨膜表達抗獨特型抗體吸附片斷的工程細胞系
[0145]在儲存生產治療性抗體的過程中，以質量控制的方式評估抗體的生物活性，以SM03為例，有兩個重要考量:吸附性質(詳細解讀為吸附親和力和特異性)及抗體介導生物學反應(如ADCC或⑶C)的能力。后者通常用生物學功效檢測的方式來估測。由于“⑶22抗體族”抗體均可吸附CD22抗原，而吸附后會很快發生內化現象，SM03抗體及其它抗CD22抗體，不能在體外實驗中順利介導CDC反應。“CD22抗體族”抗體在吸附到CD22表達陽性的細胞表面后，不會在細胞表面停留足夠的時間讓其Fe部分與補體(假設為Clq補體)充分作用，以致不能正確引發導致細胞凋亡的連鎖反應。這很可能是像SM03這樣的抗CD22抗體觀察不到可量度的CDC反應的原因。對于其他針對會發生快速內化現象表面抗原的抗體，如⑶33，Lewis (Y)抗原，恒定鏈(⑶74)來說，這一解釋也是可信服的。用以確認抗體吸附性質(特異性和親和力)的檢測方法證明了由抗體輕重鏈可變區構成的吸附片斷折疊，排序，配對都正確無誤，但卻不能提供抗體Fe部分可能發生的蛋白變異或缺失情況。而這些缺失或變異可能會阻礙抗體體內作用時發揮其正確的生物學功效。因此，開發以細胞檢測為基礎的通用檢測方法，來估測以會發生快速內化現象的抗原為目標的抗體生物學功能是可取的。
[0146]本發明中抗獨特型抗體的吸附片斷因此被重新設計，使其能夠在細胞表面表達為非內化附膜蛋白。這一創新通過以下幾種方式完成:
[0147]1、將抗獨特型抗體以跨膜IgD的方式表達
[0148]a.將鼠源IgD的跨膜區序列與“鼠源抗獨特型IgG抗體”的CH3區域融合得到跨膜的針對人CD22抗體的抗獨特型抗體IdGmD
[0149]用于與抗獨特型IgG抗體融合的鼠源IgD跨膜區(TM)的氨基酸序列如圖12中帶下劃線的序列所示。
[0150]為了構建能夠表達融合的IgG2a_TM(IgD)蛋白基因，化學合成了一段編碼“鼠源抗獨特型IgG抗體”部分羧基端序列的DNA序列。這一段DNA序列簡并了兩個限制性內切酶切點BsrGl和EagI，以協助將其克隆到相應的原始鼠源IgG2a恒定區序列中。。這段序列編碼了 41個氨基酸長度的原始鼠源IgG2a與IgD (TM)融合片斷。該序列被克隆到原IgG2a序列中(圖6)，代替了 IgG2a CH3域羧基端的一段序列使其不僅包含原序列還增加了鼠源IgD的TM序列。所表達的蛋白應為IgG2a免疫球蛋白的重鏈融合鼠源IgD的透膜片斷(完整構成為VH-CHl-hinge-CH2-CH3-TM)(重鏈如圖12所示)，將該跨膜的針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體命名為IdGmD。
[0151]選用SP2/0工程細胞系作為宿主，使用電擊穿孔轉染的方法按標準步驟進行了轉染。經過氨甲喋呤選擇，存活的克隆被用以檢驗其抗體表達。選擇陽性的克隆進行擴增，經過數輪的擴增，表達抗體的重組工程細胞系被放大培養，其所產生的跨膜抗體IdGmD也被收集并提純。同時，表達抗體的重組工程細胞系的RNA也被提取，經過RT-PCR方法和桑格測序法，得到IdGmD的輕重鏈的cDNA編碼序列。針對人CD22抗體的抗獨特型抗體IdGmD的重鏈編碼DNA序列是序列表中的序列11，編碼序列表中序列4的氨基酸序列(圖12的氨基酸序列);IdGmD的輕鏈編碼DNA序列是序列表中的序列10，編碼序列表中序列3的氨基酸序列。
[0152]b.將IgG2a重鏈用鼠源IgD序列代替得到跨膜的針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體 IdDmD
[0153]將原始“鼠源抗獨特型IgG抗體”的恒定區序列完全用附膜形態的鼠源IgD序列代替。帶透膜片斷TM序列的鼠源IgD完整氨基酸序列如圖13所示。
[0154]編碼附膜形態的鼠源IgD cDNA序列按照標準寡核苷酸合成的方法化學合成。引入了限制性內切點(XhoI和EagI)以方便克隆到原鼠源IgG2a表達載體相應的部位。該序列被克隆到原IgG2a表達載體中相應的部位(圖6)，用附膜IgD蛋白序列代替了鼠源IgG2a的恒定區序列，得到IdDmD的重組表達載體PIdDmD。所表達的蛋白包括IgD免疫球蛋白的重鏈帶IgD的透膜片斷(形態構成為VH-CHl-hinge-CH3-TM)。值得注意的是，鼠源IgD沒有CH2區域，從而其結構與IgG或人源IgD產別很大，如同圖13所示(跨膜區用下劃線標記)。
[0155]因為只是例證實驗，只有(b)部分描述的抗獨特型IgD-TM的表達載體DNA質粒經過內切酶線化。用小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0作為轉染宿主細胞。據相關文獻說明，SP2/0細胞只能產生內源性IgP而不能產生Iga。由于IgD免疫球蛋白分子的膜上表達需要Iga與IgP的共同作用，Iga的表達載體也與IgD-TM融合蛋白的表達載體PldDmD —同按照標準電擊穿孔轉染方法轉染到SP2/0宿主細胞。轉染了質粒的細胞用含氨甲喋呤的選擇性培養基按照DHFR系統標準方法進行選擇。經選擇存活的細胞用細胞ELISA檢測的方法測試其膜表面所表達的抗獨特型特異性。實驗簡要步驟如下，50uL 10ug/ml的SM03抗體加入到IO6轉染細胞(先用PB S沖洗3次)。將混合了抗體的細胞4°C孵育I小時后用PBS沖洗3次。然后加入50uL的經1:1000稀釋的HRP標記羊抗人IgG Fe抗體，4°C孵育I小時。再用PBS沖洗I次后，加入50uL顯色，膜表面的抗SM03 IgD陽性的細胞會有顯色反應。經過10分鐘室溫孵育后,加入50uL 0.18M的稀酸終止反應。將抗體_細胞混合物離心,收集上清液用波長450nm讀取吸光率。
[0156]選擇陽性的克隆進行擴增，經過數輪的擴增，表達抗體的重組工程細胞系被放大培養，其所產生的跨膜抗體IdDmD也被收集并提純。同時，表達抗體的重組工程細胞系的RNA也被提取，經過RT-PCR方法和桑格測序法，得到IdDmD的輕重鏈的cDNA編碼序列。針對人CD22抗體的抗獨特型抗體IdDmD的重鏈編碼DNA序列是序列表中的序列12，編碼序列表中序列5的氨基酸序列；IdDmD的輕鏈編碼DNA序列是序列表中的序列10，編碼序列表中序列3的氨基酸序列。
[0157]結果顯示，在膜表面表達抗SM03IgD需要同時將Iga轉染到小鼠骨髓瘤細胞。流式細胞計數實驗(該實驗方法同下述步驟2的流式細胞分析)的結果確證了 IgD的膜表面表達(圖16)。
[0158]2、通過附膜Fab-糖蛋白融合蛋白的形式表達跨膜的針對人CD22抗體的抗獨特型抗體 IdGmFdA
[0159]來自紅細胞膜表面的糖蛋白A跨膜區域與“鼠源抗獨特型IgG抗體”鼠源IgG2a鉸鏈區羧基端相融合。這一抗體片斷融合預期會在轉染細胞表面以通過糖蛋白A跨膜區固定在細胞表面的Fab方式表達。
[0160]用來融合抗SM03抗體片斷的糖蛋白A片斷(包括跨膜區序列)如圖14的帶下劃線的氨基酸序列所示。
[0161]將基因序列直接融合在鼠源Ig2a抗體鉸鏈區編碼最后一個氨基酸的基因序列后面，所表達的蛋白應該為“鼠源抗獨特型IgG抗體”重鏈Fd區域融合于糖蛋白A的跨膜區與包內區(片斷構成形式為=VH-CHl-鉸鏈區-糖蛋白A跨膜區+包內區，圖14)。
[0162]在細胞膜表面表達“鼠源抗獨特型IgG抗體” Fd片斷-糖蛋白A融合蛋白的表達載體經構建完成。簡要說明如下，鼠源IgG2a抗體CHl-鉸鏈區片斷融合于糖蛋白A羧基端片斷(包括跨膜區序列)的編碼DNA序列按照標準寡核苷酸合成方法經化學合成所得。所合成的序列包含了符合讀框的XhoI和EagI內切點。合成序列利用標準的分子生物學克隆技術插入抗SM03IgG2a抗體表達載體(圖6)基因序列中的相應位點，代替了原IgG2a抗體序列中的CH2-CH3區域編碼序列，得到IdGmFdA的重組表達載體pIdGmFdA。
[0163]“鼠源抗獨特型IgG抗體Tab片斷-糖蛋白A融合蛋白的表達載體pldGmFdA質粒DNA經線化轉染到小鼠SP2/0宿主細胞。經轉染質粒的細胞用氨甲喋呤按照標準方法利用DHFR基因選擇系統進行陽性克隆選擇。選擇陽性的克隆進行擴增，經過數輪的擴增，表達抗體的重組工程細胞系被放大培養，其所產生的跨膜抗體IdGmFdA也被收集并提純。同時，表達抗體的重組工程細胞系的RNA也被提取，經過RT-PCR方法和桑格測序法，得到IdGmFdA的輕重鏈的cDNA編碼序列。針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體IdGmFdA的重鏈編碼DNA序列是序列表中的序列13，編碼序列表中序列6的氨基酸序列；IdGmFdA的輕鏈編碼DNA序列是序列表中的序列10，編碼序列表中序列3的氨基酸序列。
[0164]選出的存活陽性克隆用來測定其抗獨特型Fab-糖蛋白A融合蛋白的細胞表面表達情況，所用方法依然為之前所述的細胞ELISA檢測方法。經ELISA檢測成功在細胞表面表達融合蛋白的細胞進一步進行流式細胞分析:SM03抗體作為一抗，FITC熒光標記的羊抗人IgG Fe抗體(Jackson Immunoresearch公司產品)作為檢測抗體(二抗)。簡要說明如下，5X IO5個轉染細胞與0.01,0.1或1μ g的SMO3在IOOuL的PBS-FA緩沖液(含1%胎牛血清FCS，0.05%疊氮化鈉的PBS溶液)中共同孵育。孵育條件為4°C，時間30分鐘，之后用PBS清洗3次以移除非吸附抗體。SM03對轉染細胞的吸附量用熒光FITC標記羊抗人IgGFe抗體(Jackson Immunoresearch公司產品)的檢測評估。用含20倍稀釋突光標記抗體的lOOuLPBS-FA緩沖液經4°C孵育30分鐘后，用PBS沖洗細胞3次，其熒光信號用FACScan系統進行分析。結果顯示，抗獨特型Fab-糖蛋白A融合蛋白IdGmFdA能夠有效地在轉染骨髓瘤細胞系的細胞表面表達(如圖16所示)。
[0165]3、以Fab-GPI固定融合蛋白的形式表達“鼠源抗獨特型IgG”抗體的針對人⑶22抗體的抗獨特型抗體IdGmFdG
[0166]GPI片斷由附在DAF疏水區域上的LDL受體衍生而來，這一片斷直接融合在“鼠源抗獨特型IgG抗體” IgG2a鉸鏈區之后。融合蛋白預期以通過GPI固定，附在細胞表面的Fab片斷方式表達。
[0167]由附在DAF疏水區上的LDL受體衍生的GPI片斷氨基酸序列如圖15中帶下劃線的氨基酸序列所示。[0168]將其編碼DNA序列直接融合在編碼鼠源IgG2a抗體鉸鏈區最后一個氨基酸基因序列之后；所表達蛋白應為“鼠源抗獨特型IgG抗體”重鏈Fd部分與GP1-DAF片斷融合(融合片斷構成為VH-CH1-GP1-DAF，如圖15所示)。
[0169]表達上述融合蛋白的表達載體已構建完成。簡要說明如下，編碼鼠源IgG2aCHl-鉸鏈區與GP1-DAF融合片斷的DNA序列按照標準寡核苷酸合成的方法經化學合成所得。序列中包含符合讀框的XhoI和EagI內切點(下劃線所示)。合成序列利用標準的分子生物學克隆技術插入“鼠源抗獨特型IgG抗體”表達載體(圖6)基因序列中的相應位點，代替了原IgG2a抗體序列中的CH2-CH3區域編碼序列，得到IdGmFdG的重組表達載體pIdGmFdG。 [0170]PldGmFdG質粒DNA經線化轉染到小鼠SP2/0宿主細胞。經轉染質粒的細胞用氨甲喋呤按照標準方法利用DHFR基因選擇系統進行陽性克隆選擇。選擇陽性的克隆進行擴增，經過數輪的擴增，表達抗體的重組工程細胞系被放大培養，其所產生的跨膜抗體IdGmFdG也被收集并提純。同時，表達抗體的重組工程細胞系的RNA也被提取，經過RT-PCR方法和桑格測序法，得到IdGmFdG的輕重鏈的cDNA編碼序列。針對人CD22抗體的抗獨特型抗體IdGmFdG的重鏈編碼DNA序列是序列表中的序列14，編碼序列表中序列7的氨基酸序列；IdGmFdG的輕鏈編碼DNA序列是序列表中的序列10，編碼序列表中序列3的氨基酸序列。
[0171]選出的存活陽性克隆用來測定其抗獨特型Fab-糖蛋白A融合蛋白的細胞表面表達情況，所用方法依然為之前所述的細胞ELISA檢測方法。經ELISA檢測成功在細胞表面表達融合蛋白的細胞進一步進行流式細胞分析:SM03抗體作為一抗，FITC熒光標記的羊抗人FcIgG抗體(Jackson Immunoresearch公司產品)作為檢測抗體(二抗)，具體方法同上述步驟2的流式細胞分析)。結果顯示，“鼠源抗獨特型IgG抗體”Fab片斷-GPI融合蛋白IdGmFdG能夠有效地在轉染骨髓瘤細胞系的細胞表面表達(如圖16所示)。
[0172]二、建立用以評估“⑶22抗體族”生物學功效的細胞檢測方法
[0173]將上述步驟一的在細胞表面表達相應的融合蛋白(IdDmD、IdGmFdA和IdGmFdG)的不同表現類型轉染細胞，經校正細胞濃度為2 X IO6個/毫升。在96孔板上每孔加入50uL細胞。加拿大Cedarlane公司的豚鼠血清(Guinea Pig Serum, GPS)凍干粉用I毫升的培養基配制成100%的GPS溶液。在加有轉染細胞的孔中加入含10%GPS的50uL不同濃度的SM03抗體。經過2小時，370C，5% 二氧化碳條件下的孵育，每孔加入20uL的美國Dojindo分子技術公司的CCK-8 (cell counting kit_8)試劑。3小時后，按照產品說明通過450nm可見光波長讀取細胞活率。結果顯示，諸如SM03這樣的“CD22抗體族”產品能夠針對在細胞表面表達“鼠源抗獨特型IgG抗體”Fab片斷-糖蛋白A融合蛋白IdGmFdA以及“鼠源抗獨特型IgG抗體"Fab片斷-GP1-DAF融合蛋白IdGmFdG的轉染細胞，有效介導補體依賴細胞毒反應(CDC反應，如圖17所示)。而對在細胞表面表達抗獨特型IgD-TM片斷蛋白IdDmD的轉染細胞則沒有明顯的CDC效應。原因可能為細胞表面的IgD在與“CD22抗體族”產品吸附后依然會發生內化現象，以至阻斷了 CDC反應；或者是由于抗獨特型-TM片斷蛋白的膜上表達量太少而未達到引發補體激活的臨界值。無論如何，在細胞表面表達“鼠源抗獨特型IgG抗體”吸附片段的三種不同轉染細胞，有兩種可以按劑量有效介導SM03引發CDC殺傷，顯示了這一策略能夠作為開發適宜生物學檢測方法，從而正確評估可內化抗原抗體生物學功效的普遍指導原則。
【權利要求】
1.一種抗體，包括3個抗體重鏈互補決定區和3個抗體輕鏈互補決定區；所述3個抗體重鏈互補決定區的氨基酸序列分別如序列表中序列I的第31-35位、第50-66位和第99-106位，所述3個抗體輕鏈互補決定區的氨基酸序列分別如序列表中序列I的第154-168 位、第 184-190 位和第 223-231 位。
2.根據權利要求1所述的抗體，其特征在于:所述抗體包括重鏈可變區和輕鏈可變區；所述重鏈可變區的氨基酸序列如序列表中序列I的第1-116位，所述輕鏈鏈可變區的氨基酸序列如序列表中序列I的第131-240位。
3.根據權利要求1所述的抗體，其特征在于:所述抗體為下述a)-h)中的一種: a)重鏈的氨基酸序列是序列表中的序列2，輕鏈的氨基酸序列是序列表中的序列3； b)將序列表中的序列2中除所述3個抗體重鏈互補決定區外的氨基酸序列進行氨基酸殘基的取代、缺失或添加，和/或將序列表中的序列3中除所述3個抗體輕鏈互補決定區外的氨基酸序列進行氨基酸殘基的取代、缺失或添加得到的針對人CD22抗體的抗獨特型抗體，優選為將所述序列2中除第1-117位的重鏈可變區外的氨基酸序列進行氨基酸殘基的取代、缺失或添加，和/或將所述序列3中除第1-111位的輕可變區外的氨基酸序列進行氨基酸殘基的取代、缺失或添加得到的針對人CD22抗體的抗獨特型抗體； c)序列表中的序列I所示的單鏈抗體，或在序列表中序列I的氨基端或羧基端加上組氨酸標簽得到的融合蛋白； d)將序列表中的序列I除所述3個抗體重鏈互補決定區和所述3個抗體輕鏈互補決定區外的氨基酸序列進行氨基酸殘基的取代、缺失或添加得到的針對人CD22抗體的抗獨特型抗體，優選為將所述序列表中序列I的第117-130位所示的連接肽序列進行氨基酸殘基的取代、缺失或添加得到的針對人CD22抗體的抗獨特型抗體； e)重鏈的氨基酸序列是序列表中的序列6;輕鏈的氨基酸序列是所述序列表中的序列3 ； f)重鏈的氨基酸序列是序列表中的序列7;輕鏈的氨基酸序列是所述序列表中的序列3 ； g)重鏈的氨基酸序列是序列表中的序列4;輕鏈的氨基酸序列是所述序列表中的序列3 ； h)重鏈的氨基酸序列是序列表中的序列5;輕鏈的氨基酸序列是所述序列表中的序列3。
4.編碼權利要求1-3中任一所述抗體的核酸分子。
5.根據權利要求4所述的核酸分子，所述核酸分子為下述I)-6)中任一所述的基因: 1)權利要求3中a)所述抗體的重鏈的編碼序列是序列表中的序列9，權利要求3中a)所述的抗體的輕鏈鏈的編碼序列是序列表中的序列10 ； 2)權利要求3中c)所述抗體的編碼序列是序列表中的序列8； 3)權利要求3中e)所述抗體的的重鏈的編碼序列是序列表中的序列13，權利要求3中e)所述抗體的輕鏈鏈的編碼序列是序列表中的序列10 ； 4)權利要求3中f)所述抗體的的重鏈的編碼序列是序列表中的序列14，權利要求3中f)所述抗體的輕鏈鏈的編碼序列是序列表中的序列10 ； 5)權利要求3中g)所述抗體的的重鏈的編碼序列是序列表中的序列11，權利要求3中g)所述抗體的輕鏈鏈的編碼序列是序列表中的序列10 ；. 6)權利要求3中h)所述抗體的的重鏈的編碼序列是序列表中的序列12，權利要求3中h)所述抗體的輕鏈鏈的編碼序列是序列表中的序列10。
6.1)、2)或3)的生物材料: . 1)含有權利要求4或5所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或重組細胞系； . 2)表達權利要求1-3中任一所述抗體的重組表達載體、重組微生物或重組細胞系； . 3)表達權利要求5所述核酸分子的重組表達載體、重組微生物或重組細胞系。
7.細胞膜表面表達權利要求1-3中任一所述抗體的重組細胞系。
8.1) -5)中任一種試劑: . 1)檢測人CD22抗體濃度的試劑，其活性成分為權利要求1-3中任一所述抗體； . 2)檢測由人CD22抗體引起的人抗鼠抗體反應試劑，其活性成分為權利要求1-3中任一所述抗體；. 3)檢測由人CD22抗體引起的人抗嵌合抗體反應試劑，其活性成分為權利要求1-3中任一所述抗體；. 4)檢測由人CD22抗體引起的人抗人抗體反應試劑，其活性成分為權利要求1-3中任一所述抗體；. 5)檢測人CD22抗體對腫瘤細胞的穿透性和/或吸附性試劑，其活性成分為權利要求1-3中任一所述抗體。
9.1) -3)中任一種試劑:. 1)檢測人CD22抗體生物活性的試劑，其活性成分為其活性成分為權利要求7所述的重組細胞系； . 2)檢測人CD22抗體介導的補體依賴細胞毒反應試劑，其活性成分為其活性成分為權利要求7所述的重組細胞系； .3)檢測人CD22抗體介導的抗體依賴細胞介導細胞毒反應的試劑，其活性成分為其活性成分為權利要求7所述的重組細胞系。
10.1)-8)中的任一應用: . 1)權利要求1-3中任一所述抗體在制備檢測CD22抗體濃度試劑中的應用； . 2)權利要求7所述的重組細胞系在制備檢測⑶22抗體生物活性試劑中的應用； .3)權利要求1-3中任一所述抗體在制備檢測由人CD22抗體引起的人抗鼠抗體反應試劑中的應用； . 4)權利要求1-3中任一所述抗體在制備檢測由人CD22抗體引起的人抗嵌合抗體反應試劑中的應用； . 5)權利要求1-3中任一所述抗體在制備檢測由人CD22抗體引起的人抗人抗體反應試劑中的應用； . 6)權利要求7所述的重組細胞系在制備檢測人CD22抗體介導的補體依賴細胞毒反應試劑中的應用； . 7)權利要求7所述的重組細胞系在制備檢測人CD22抗體介導的抗體依賴細胞介導細胞毒反應試劑中的應用；. 8)權利要求1-3中任一所述抗體在制備檢測人CD22抗體對腫瘤細胞的穿透性和/或吸附性試劑中的應用。·
【文檔編號】C12N15/63GK103588882SQ201210286457
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月13日 優先權日:2012年8月13日
【發明者】梁瑞安 申請人:中國抗體制藥有限公司