福氏志賀菌血清型檢測用引物和使用所述引物的多重擴增的制作方法
【專利摘要】本發明涉及福氏志賀菌血清型檢測用引物和使用所述引物的多重擴增，所述引物包括序列：SEQ?ID?Nos.2和3、SEQ?ID?Nos.4和5、SEQ?ID?Nos.6和7、SEQ?ID?Nos.8和9、SEQ?ID?Nos.10和11、SEQ?ID?Nos.12和13、SEQ?ID?Nos.14和15、SEQ?ID?Nos.16和17、SEQ?ID?Nos.18和19。所述的引物具有特異性，退火溫度一致。本發明還涉及利用所述引物進行多重擴增檢測的方法。本發明進一步涉及所述福氏志賀菌血清型檢測用引物在制備檢測劑中的應用。本發明進一步涉及包含上述引物的福氏志賀菌血清型檢測用試劑盒。
【專利說明】福氏志賀菌血清型檢測用引物和使用所述引物的多重擴增
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及福氏志賀菌檢測用引物和使用所述引物的多
重擴增。
【背景技術】 [0002]志賀菌(Shigella)是發展中國家細菌性腹瀉的主要致病菌。每年全球有164.7百萬人感染，導致11萬人死亡，大多是5歲以下的兒童(Kotloff，K.L.，J.P.Winickoff, B.1vanoff, J.D.Clemens，D.L Swerdlow, P.J.Sansonetti，G.K.Adak, andΜ.M.Levine.1999.Global burden of Shigella infections !implications for vaccinedevelopment and implementation of control strategies.Bull World Health Organ77:651-66)。在志賀菌的四群中，福氏是影響貧窮人群的主要流行群。
[0003]根據O抗結構的不同，福氏志賀菌分為不同的血清型。目前為止，至少16個血清型已被報道，分別是 la, Ib，Ic，Id，2a，2b，3a，3b，4a，4b，5a，5b，X，Xv，Y 和 6 (Simmons, D.A.，and E.Romanowska.1987.Structure and biology of Shigella flexneri 0 antigens.J Med Microbiol23:289-302 ;Stagg，R.M.，S.S.Tang, N.1.Carlin, K.A.Talukder,P.D.Cam, and N.K.Verma.2009.A novel glucosyItransferase involved in 0—antigenmodification of Shigella flexneri serotypelc.J Bacteriol 191:6612-7 ;Ye，C.，R.Lan, S.Xia，J.Zhang, Q.Sun，S.Zhang, H.Jing，L Wang, Z.Li，Z.Zhou, A.Zhao, Z.Cui，J.Cao, D.Jin, L Huang, Y.Wang, X.Luo, X.Bai，P.Wang, Q.Xu, and J.Xu.2010.Emergence ofa new multidrug-resistant serotype X variant in an epidemic clone of Shigellaflexner1.J Clin Microbiol 48:419-26)。
[0004]鑒定福氏痢疾桿菌及其它群痢疾桿菌的血清型主要采用免疫動物的抗血清與分離菌株進行玻片凝集反應，根據免疫凝集結果進行判定(Edwards, P.R., and W.H.Ewing.1dentification of Enterobacteriaceae.Burgess Publishing Company, Minneapolis,Minn, 126-131 (1972))。目前,福氏痢疾桿菌血清型診斷系統已經建立(Ewing,W.H.Edwardsand Ewing' s identification of Enterobacteriaceae,.Elsevier Science PublishingCo, Inc, New York.4th ed., 135-172 (1986)),多種商業化診斷血清亦廣泛應用。不同的血清型具有獨特的血清凝集譜(表1)，根據現有的診斷血清，大多數菌株能夠歸于目前已知的血清型。
[0005]最近，幾種新血清型被不斷報道。其中某些已經成為優勢血清型(Talukder etal.，2003)。2001年，在中國河南省出現一種新的血清型Xv，在隨后的幾年內(2002-2006)，它取代2a成為河南省優勢血清型，分別占分離福氏志賀菌的14 %，35 %，47 %，48 %，和27% (Ye et al.,2010) ? Xv血清型也在山西出現，分別占67% (2006)和33% (2007)。在甘肅、安徽和上海2007年的分離率分別是67%、54%和35% (Ye et al.，2010)。
[0006]血清型Xv能夠與單克隆抗體MASFIV-1和群7，8抗血清凝集(Ye et al.，2010)，因此它最初被稱為 4c 或 4x(Carlin & Lindberg, 1987 ；Pryamukhina & Khomenko, 1988) ?相對于X血清型，Xv血清型菌株在它的LPS上含有MASF IV-1 (或稱為E1037)抗原位點(YeC，Lan RiXia S，Zhang J，Sun Q，et al.(2010)Emergence of a new multidrug-resistantserotype X variant in an epidemic clone of Shigella flexner1.J Clin Microbiol48:419-426)。
[0007]此外，一些非典型血清型不斷被分離到，如Yv (也稱為4x，Y，或4s，本發明中命名為Yv)(Talukder KAiDutta DK,Safa A，Ansaruzzaman M，Hassan F，et al.(2001)Alteringtrends in the dominance of Shigella flexneri serotypes and emergence ofserologically atypical S.flexneri strains in Dhaka,Bangladesn.J Clin Microbiol39:3757-3759.Qiu S，Wang Z,Chen C，Liu N，Jia L，et al.(2011)Emergence of a novelShigella flexneri serotype 4s strain that evolved from a serotype X variantin China.J Clin Microbiol 49:1148-1150.Carlin NI，Rahman M，Sack DA, Zaman A，Kay B，et al.(1989)Use of monoclonal antibodies to type Shigella flexneri inBangladesh.J Clin Microbiol 27:1163-1166)，它能夠特異地與 MASFIV-1 單克隆抗體凝集(表 I) ;4av(也稱為 4 或 untypcal 4a，本發明中命名為 4av) (Talukder KA, Dutta DK,Safa A，Ansaruzzaman M，Hassan F，et al.(2001)Altering trends in the dominance ofShigella flexneri serotypes and emergence of serologically atypical S.flexneristrains in Dhaka,Bangladesn.J Clin Microbiol 39:3757-3759.Carlin NI，Rahman M，Sack DA，Zaman A,Kay B，et al.(1989)Use of monoclonal antibodies to type Shigellaflexneri in Bangladesn.J Clin Microbiol 27:1163-1166)，除了能夠與血清 4 型特異的MASFIV-2凝集外，還能夠與MASFIV-1單克隆抗體凝集(表1)。Foster等人發現了一種非典型血清型(7b)，它能夠與MASF IC和6抗血清發生反應(Foster RA, Carlin NI，Majcher M，Tabor H,Ng LK,et al.(2011) Structural elucidation of the 0-antigen ofthe Shigella flexneri provisional serotype 88—893:structural and serologicalsimilarities with S.flexneri provisional serotype Y394 (Ic).Carbohydr Res 346:872-876)(表1)，按照目前的血清型標準，它不能歸于目前已知的任何血清型。
`[0008]表1福氏志賀菌已知和非典型血清型凝集譜
[0009]
【權利要求】
1.一套福氏志賀菌血清型檢測用引物，其包括以下序列:SEQ ID Nos.2和3、SEQ IDNos.4 和 5、SEQ ID Nos.6 和 7、SEQ ID Nos.8 和 9、SEQ ID Nos.10 和 11、SEQ ID Nos.12和 13、SEQ ID Nos.14 和 15、SEQ ID Nos.16 和 17、SEQ ID Nos.18 和 19。
2.根據權利要求1所述的福氏志賀菌檢測用引物，其還包括以下序列:SEQID Nos.29和30。
3.—種多重擴增檢測方法，該方法包括利用權利要求1所述的引物進行擴增；優選所述擴增為聚合酶鏈式反應。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，所述擴增條件為:95°C預變性15min;94°C變性30s, 50~60°C退火90s，72。。延伸60s，共30個循環；最后72°C延伸IOmin0
5.根據權利要求3或4所述的方法，該方法進一步包括在所述擴增之后進行定性分析；優選所述的定性分析包括用凝膠電泳顯示所述擴增的產物。
6.權利要求1或2所述的福氏志賀菌血清型檢測用引物在制備檢測劑中的應用，所述的檢測劑用于檢測福氏志賀菌血清型，或者用于檢測包含福氏志賀菌的的鑒別診斷用樣品O
7.根據權利要求6所述的應用，所述的檢測劑用于對排泄物、腸積液、嘔吐物、土壤、水樣、食品或化妝品進行檢測。
8.一種福氏志賀菌檢測用試劑盒，該試劑盒包含權利要求1或2所述的引物。
9.根據權利要求8所述的檢測用試劑盒，該試劑盒還包括以下標記或未標記的探針: SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.21、SEQ ID N0.22、SEQ ID N0.23、SEQ ID N0.24、SEQ IDN0.25、SEQ ID N0.26、SEQ ID N0.27、SEQ ID N0.28。
10.權利要求1或2所述的引物、或權利要求3~5任一項所述的方法、或權利要求8或9所述的試劑盒在鑒定福氏志賀菌新的血清型中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103589778SQ201210288889
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月14日 優先權日:2012年8月14日
【發明者】孫強正, 王建平, 徐建國 申請人:中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所