專利名稱：一株高效降解氟磺胺草醚的福氏志賀氏菌菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株福氏志賀氏菌菌株。
背景技術：
氟磺胺草醚(通用名稱f0meSafen，商品名稱虎威)，是由英國捷利康公司開發的二苯醚類觸殺除草劑，用于大豆、果樹、橡膠園等作物地闊葉雜草的防除，由于其良好的除草效果而得到廣泛應用。氟磺胺草醚在全國使用量及使用面積較大，其在大豆苗前、苗后使用可很快使雜草被葉部吸收，破壞其的光合作用，致雜草迅速枯萎而死。但這種除草劑在土壤中會持續作用很長一段時間，殘存于土壤中的藥物因其較大的植物毒性會對輪作產生破壞作用。微生物降解方法是土壤中二苯醚類除草劑的主要分解方式。目前氟磺胺草醚的降解也有所研究，GST(谷胱甘肽轉移酶)介導的巰基共軛對氟磺胺草醚的去毒作用在黃豆的應用中已非常成熟。但是，有關氟磺胺草醚的微生物降解，目前很少有資料報道。

發明內容
本發明提供了一株福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)菌株，可高效降解氟磺胺草醚，為二苯醚類除草劑的環境修復和降解機制研究提供理論和微生物資源基礎。本發明高效降解氟磺胺草醚的福氏志賀氏菌菌株為福氏志賀氏菌FB5 (Shigella flexneri FB^，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2010年12月06日，保藏號為 CGMCC No. 4410 ；本發明福氏志賀氏菌FB5為革蘭氏陰性菌，棒狀，細胞大小為(0. 5 μ m 0. 7 μ m) X (0. 9 μ m 1. 6 μ m)，無芽孢、無鞭毛(如圖1和圖2所示)，無菌膜；在無機鹽固體培養基上培養，菌落呈圓形，顏色為乳白色。本發明的福氏志賀氏菌FB5伏普試驗呈陰性，淀粉水解試驗呈陰性，明膠液化試驗呈陰性，七葉靈水解試驗呈陰性，硫化氫產生試驗呈陰性，脲酶試驗呈陰性，氧化酶試驗呈陰性，甲基紅試驗呈陰性。本發明的福氏志賀氏菌FB5不能利用水楊苷、山梨醇、乳糖或蔗糖為碳源；在含有氨芐霉素、狀觀霉素、氯霉素、阿莫斯林、鏈霉素、頭孢噻肟鈉或頭孢哌酮鈉的環境下可以生長，在含有四環素、卡那霉素或頭孢曲松鈉的環境下不能生長。本發明的福氏志賀氏菌FB5(Shigella flexneri FB5)通過16S rDNA序列比對分析，與志賀氏菌屬(Shigella)的16S rDNA序列的同源性最高，保守區相似性為99%，通過結合菌體形態特征、生長條件、生理生化鑒定結果確定福氏志賀氏菌FB5屬于志賀氏菌屬 (Shigella)，為福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)菌株。本發明的福氏志賀氏菌FB5可在添加了氟磺胺草醚的LB培養基、牛肉膏蛋白胨培養基和無機鹽培養基上生長，其中最適培養基為添加了氟磺胺草醚的LB培養基，培養基中氟磺胺草醚的最佳終濃度為500mg/L。福氏志賀氏菌FB5的最適生長溫度為37°C，最適合生長環境的PH值為7。本發明福氏志賀氏菌FB5能夠高效降解氟磺胺草醚，福氏志賀氏菌FB5在含500mg/L的氟磺胺草醚液體無機鹽培養基中，反應96h，對氟磺胺草醚的降解率達到 88. 32% ；本發明福氏志賀氏菌FB5對含有氟磺胺草醚殘留的土壤具有修復作用。本發明的福氏志賀氏菌FB5 (Shigella f lexneri FB5)屬于志賀氏菌屬 Shigella)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2010年12月06日，保藏號為CGMCC No.4410。


圖1為本發明福氏志賀氏菌FB5的掃描電鏡照片；圖2為福氏志賀氏菌FB5的透射電鏡照片；圖3為通過福氏志賀氏菌FB5和相近菌株的16S rDNA序列進行同源性比對構建的系統發育樹圖。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式高效降解氟磺胺草醚的福氏志賀氏菌菌株為福氏志賀氏菌FB5 Shigella flexneri FB^，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2010年12月06 日，保藏號為CGMCC No. 4410。本實施方式福氏志賀氏菌FB5 (Shigella flexneri FB5)為革蘭氏陰性菌，棒狀， 細胞大小為(0. 5 μ m 0. 7 μ m) X (0. 9 μ m 1. 6 μ m)，無芽孢、無鞭毛，無菌膜；在無機鹽
固體培養基上培養，菌落呈圓形，顏色為乳白色。參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版和《常見細菌系統鑒定手冊》對福氏志賀氏菌 FB5 (Shigella flexneri FB5)進行生理生化鑒定福氏志賀氏菌FB5伏普試驗呈陰性，淀粉水解試驗呈陰性，明膠液化試驗呈陰性，七葉靈水解試驗呈陰性，硫化氫產生試驗呈陰性，脲酶試驗呈陰性，氧化酶試驗呈陰性，甲基紅試驗呈陰性。本實施方式福氏志賀氏菌FB5可在添加了氟磺胺草醚的LB培養基、牛肉膏蛋白胨培養基和無機鹽培養基上生長，其中最適培養基為添加了氟磺胺草醚的LB培養基，培養基中氟磺胺草醚的最佳終濃度為500mg/L。其中無機鹽培養基(IOOOmL)由1. Og的NaCl、l. Og 的NH4NO3U. 5g的Κ2ΗΡ04、0· 5g的KH2PO4和0. lg、MgSO4 · 7H20和余量的蒸餾水組成。無機鹽培養基加熱充分溶解后與121°C高壓滅菌15min，冷卻至50 60°C后向其中加入氟磺胺草醚至終濃度為500mg/L。本實施方式福氏志賀氏菌FB5的最適生長溫度為37°C，最適合生長環境的pH為 7。
具體實施方式
二 本實施方式福氏志賀氏菌FB5 Shigella flexneri FB5)由中國黑龍江省訥河市受除草劑污染的土壤中篩選得到。篩選按以下步驟進行取5g黑龍江省訥河市受除草劑污染的土壤于三角瓶中，加入50mL生理鹽水，振蕩30s，用8層紗布過濾，取ImL過濾液加入到含100mg/L氟磺胺草醚的無機鹽培養基中，于30°C、180r/min下培養， 每隔7天提高氟磺胺草醚濃度100mg/L，直至氟磺胺草醚的濃度為500mg/L，得富集培養液； 取富集培養液100 μ L均勻涂布于氟磺胺草醚濃度為500mg/L的固體無機鹽培養基上培養， 30°C培養24h后挑取生長較好的菌落進行純化，即可得到福氏志賀氏菌FB5。對篩選得到的福氏志賀氏菌FB5進行分子鑒定，按以下步驟進行用熱破壁法提取菌株的總DNA，采用細菌的16S rDNA通用引物，以基因組DNA為模板進行PCR擴增。然后利用膠回收試劑盒(購自于大連寶生物工程有限公司)回收純化PCR產物，之后進行克隆、 轉化，篩選陽性克隆子菌落，經擴大培養后委托上海生工生物技術有限公司測序。福氏志賀氏菌FB5的16SrDNA序列長度為lMlbp，其序列提交至GenBank獲得的登錄號為HQ701686，測序結果與GenBank中的16S rDNA序列進行同源性比對，然后用軟件 DNAMAN的Observed Divergency構建系統發育樹(如圖3所示)，以確定菌株的種屬關系。 同源性分析結果表明，該序列與志賀氏菌屬(Shigella)的16S rDNA序列的同源性最高，保守區相似性為99 %，通過結合菌體形態特征、生長條件、生理生化鑒定結果確定福氏志賀氏菌FB5屬于志賀氏菌屬(Shigella)，為福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)。PCR引物購買自上海生工生物技術有限公司，其他試劑購自于大連寶生物工程有限公司。對本實施方式福氏志賀氏菌FB5降解氟磺胺草醚的降解率進行測定，具體方法如下將福氏志賀氏菌FB5接入含有500mg/L氟磺胺草醚的無機鹽培養基中，于30°C， 200r/min條件下培養，設置不接菌的無機鹽培養基為對照，做三個重復，培養后取樣， 按甲醇水無水乙酸=60 40 0.5的體積比，直接向培養液(視為水)中加甲醇和無水乙酸，充分混勻，用注射器吸取一定量過0. 45 μ m濾膜，用高效液相色譜檢測其殘留。色譜條件色譜柱Inertsil 0DS-3C18(4. 6X 250mm, 5 μ m)；柱溫室溫；流動相甲醇水 無水乙酸=60 40 0. 5;檢測波長220nm;流速0. 8mL/min;進樣量10yL。根據標準曲線計算出樣品中氟磺胺草醚的殘留量，根據以下公式求出其降解率氟磺胺草醚降解率 (% ) = [1_(處理實測殘留量/對照實測殘留量)]χιοο%。本實施方式福氏志賀氏菌FB5在含500mg/L的氟磺胺草醚液體無機鹽培養基中， 反應96h，降解率達到88. 32%，說明福氏志賀氏菌FB5為高效降解氟磺胺草醚的菌株。檢測本實施方式福氏志賀氏菌FB5對含有氟磺胺草醚殘留的土壤的修復作用，具體方法如下以氟磺胺草醚的后茬敏感作物玉米、高粱以及靶標雜草苘麻、稗草作為指示植物， 采用盆栽方式，挑選飽滿的作物及雜草種子，在恒溫培養箱中浸種催根Mh，設置不加氟磺胺草醚且不接福氏志賀氏菌FB5的為空白組，設置不加氟磺胺草醚只接福氏志賀氏菌FB5 的為對照組CK1，設置加氟磺胺草醚且不接福氏志賀氏菌FB5的為對照組CK2，設置加氟磺胺草醚且接福氏志賀氏菌FB5的為處理組，每個處理設置3個重復，待福氏志賀氏菌FB5分別處理5(1、10(1、15(1、20(1、25(1和30d后同時播種，對照組和處理組所施用的氟磺胺草醚的濃度為5mg/kg，福氏志賀氏菌FB5的接種量為109cfu/kg，置于光照溫室、2 30°C )培養 5d左右觀察，觀察作物及靶標雜草的出苗和生長發育情況，記錄濕重、干重、株高及根長等生物量，使用Excel，SPSS統計學軟件對所得數據進行分析。
本實施方式福氏志賀氏菌FB5的修復作用對后茬敏感作物玉米和高梁生長指標的影響分別見表1和表2。表lDimcan法分析福氏志賀氏菌FB5施用后對玉米生長指標的影響
No.濕重(g)干重(g)株高(mm)根長(mm)空白組1. 87 ±0. 13oA0. 36 ±0. 030οΑ148. 99 ±9. 76oA173. 67±17. 19oACKl1. 85±0. lloA0. 34 ±0. 035οΑ142. 12 ±8. 37oA169. 87±19. 22oACK21. 46 ±0. 17bA0.邪±0. 044cdCD103. 61 ±8. 53eE119. 85 ±18. 32dD處理5d1. 48 ±0. 072bA0. 26 ±0. 024cCD96. 57±7. 97ff116. 74 ±8. 43dD處理IOd1. 69 ±0. 37—0. 22±0. 012dD129. 26 ±8. 96bB151. 67±19. 81cC處理15d1. 61±0. 027—0. 29±0. 012bcBC119. 08±8. 16cC159. 48 ±17. 28bcBC處理20d1. 63 ±0. 32—0. 32 ±0. 021obAB111. 18±8. 50dD166. 81 ±22. 38obAB處理25d1. 51 ±0. 022—0. 32 ±0. 042oAB118. 47 ±4. 85cC162. 94 ±18. 06bABC處理30d1. 71 ±0. 021οΜ0. 34±0. 012oA127. 08 ±6. 84bB168. 09±21. 75obAB數據結果表明對照組CK2的干重和根長均顯著低于空白組，福氏志賀氏菌FB5處理20d、25d和30d后玉米的干重和根長均顯著高于對照組CK2，且均已恢復至空白組水平。 對照組CK2的濕重和株高均顯著低于空白組，而福氏志賀氏菌FB5處理10d、15d、20d、25d 和30d，濕重雖未顯著增加，但已恢復至空白組水平，株高雖與空白組有顯著性差異，但與對照組CK2相比均顯著增加。表2DimCan法分析福氏志賀氏菌FB5施用后對高粱生長指標的影響
No.濕重(g)干重(g)株高(mm)根長(mm)空白組2. 28 ±0. 33oA0. 42±0. 061°189. 19 ±5. 88oA108. 38 ±9. 44oACKl2. 45 ±0. 41oA0. 39±0. 052°187. 16±6. 29oA106. 25 ±8. 34oACK21. 37 ±0. 14cC0. 27±0. 011bB39. 95 ±3. 36fF59. 08 ±6. 83eD處理5d1. 36 ±0. 12cC0. 28±0. 02bB52. 10±5. 27dD65. 96±9. 71dD處理IOd1. 51 ±0. 081cBC0. 24 ±0. 042bB40. 69 ±5. 65fF85. 69 ±11. 09cC
權利要求
1. 一株高效降解氟磺胺草醚的福氏志賀氏菌菌株，其特征在于高效降解氟磺胺草醚的福氏志賀氏菌菌株為福氏志賀氏菌FB5 (Shigella f lexneri FB5)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2010年12月06日，保藏號為CGMCC No. 4410。
全文摘要
一株高效降解氟磺胺草醚的福氏志賀氏菌菌株，它涉及一株福氏志賀氏菌菌株。本發明提供了一株福氏志賀氏菌菌株，可高效降解氟磺胺草醚，為二苯醚類除草劑的環境修復和降解機制研究提供理論和微生物資源基礎。本發明高效降解氟磺胺草醚的福氏志賀氏菌菌株為福氏志賀氏菌FB5，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2010年12月06日，保藏號為CGMCC No.4410。本發明福氏志賀氏菌FB5能夠高效降解氟磺胺草醚，對含有氟磺胺草醚殘留的土壤具有修復作用。
文檔編號A62D3/02GK102174447SQ20111004779
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月28日 優先權日2011年2月28日
發明者劉麗萍, 劉亮, 劉春光, 劉爽, 楊峰山, 肖延臣 申請人:黑龍江大學