專利名稱：一種細胞腫大病毒dna疫苗及其構建和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學及免疫學領域，具體的說是一種細胞腫大病毒DNA疫苗及其構建和應用。
背景技術：
細胞腫大病毒(Megalocytivirus)隸屬于虹彩病毒科,是該科中三個魚類病毒中的一種。虹彩病毒(包括細胞腫大病毒)是大型雙鏈DNA病毒，具有二十面體衣殼。其中細胞腫大病毒近年來在東亞及歐洲流行，感染多種硬骨魚類，給養殖漁業帶來極大災害。在我國，已報導受細胞腫大病毒危害的養殖魚種包括石斑魚、大菱鲆、鱖魚、真鯛等。目前對細胞腫大病毒病的防治沒有有效的方法。DNA疫苗是一種基因疫苗，其構建原理是將疫苗抗原基因克隆于一個真核表達載體，將該載體導入受免動物后疫苗抗原在機體內表達，從而誘發保護性免疫應答。較之于其它形式的疫苗，DNA疫苗的優點是無毒性、穩定性高、可長期儲存以及既能誘發體液免疫也能誘發細胞免疫。這些特點使得DNA疫苗具有良好的應用和發展前景。

發明內容
本發明目的在于提供一種細胞腫大病毒DNA疫苗及其構建和應用。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種細胞腫大病毒DNA疫苗，以細胞腫大病毒0RF13序列為抗原基因克隆至真核表達載體，表達誘發即為質粒PCN13DNA疫苗。具體為步驟I)以細胞腫大病毒為模板，采用Fl和Rl為引物進行PCR擴增，PCR產物純化后與PCR克隆載體pBS-T于室溫連接2 — 4小時，連接混合液轉化到大腸桿菌DH5 α后于LB固體培養基上培養18 — 24小時，轉化子提取質粒，即為質粒pBS13 ；步驟2)將質粒pCN3用Sma I酶切，回收5. 4kb片段，同時將pBS13用EcoRV酶切回收O. 3kb片段；將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2 — 4小時，連接液轉化大腸桿菌DH5 α后于LB固體培養基上培養18 — 24小時，轉化子提取質粒，即為DNA疫苗質粒PCN13。所述引物Fl 為 5' -GATATCGCCACCATGGACTATATTGCTGAGC-3' ;R1 為 5' -GATATCTTGTGTTTTATAATACAGCTTG-3'。細胞腫大病毒DNA疫苗的應用，所述DNA疫苗在制備預防或治療細胞腫大病毒藥物中的應用。本發明具有如下優點I.高保護率。本發明的疫苗對細胞腫大病毒的免疫保護效率達70%以上。2.長效。本發明的疫苗的保護效應可持續至少兩個月。3.安全。本發明的疫苗沒有任何細胞毒性。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而非以任何形式對本發明進行限制。在本發明實施例中所涉及到的常規性實驗方法均采用如下方法I.質粒提取、DNA(PCR)產物純化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的無內毒素質粒提取試劑盒。2.質粒、DNA連接液轉化進入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor LaboratoryPress 2001)；3.所有限制性內切酶和連接酶皆購自于“北京，紐英倫生物技術有限公司”。實施例I :細胞腫大病毒DNA疫苗的構建方法。本發明的DNA疫苗基于一個細胞腫大病毒基因，即0RF13 (Lu L, Zhou S，ChenCj Weng S，Chan S，and He JG. Complete genome sequence analysis of an iridovirusisolated from the orange-spotted grouper,Epinephelus coioides. Virology2005;339:81-100)。步驟I) DNA疫苗質粒pCN13的構建方法以及DNA疫苗制備液的制備以已報導的細胞腫大病毒(ZhangM, Xiao Z, Hu Y, Sun L. Characterization ofa megalocytivirus from cultured rock bream, Oplegnathus fasciatus(Temminck &Schlege), in China. Aquae Res. 2012;43:556 - 64。)為模板，采用 Fl 和 Rl 為引物進行 PCR擴增，PCR 條件為:94。C 60s 預變性模板 DNA，然后 94。C 40s，50。C 60s，72。C 90s, 5個循環后改為94° C40s，64° C 60s, 72° C 90s，20個循環后再在72° C延伸反應lOmin，PCR產物用天根DNA產物純化試劑盒純化后與PCR克隆載體pBS_T (購自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室溫連接2 - 4小時，連接混合液轉化到大腸桿菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)、40 μ g/ml 5_溴_4_氯_3_卩引哚-β _D_乳糖苷(X_gal)和
24μ g/ml異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養基上培養18 — 24小時，挑出白色轉化子，提取質粒，命名為質粒PBS13。將質粒pCN3 (pCN3 構建過程參見 Jiao XD, Zhang M, Hu YH, Sun L. Constructionand evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tardaantigens. Vaccine2009;27:5195-202.)用Sma I酶切，回收5. 4kb片段，同時將pBS13用EcoRV酶切回收0. 3kb片段。將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2 — 4小時，連接液轉化大腸桿菌DH5a后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固體培養基上培養18 — 24小時，挑取轉化子，提取質粒，命名為PCN13，即為DNA疫苗質粒。將pCN13懸浮于PBS中至濃度為400 μ g/ml,即為DNA疫苗制備液。所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97. 5%蒸餾水。所述引物序列為Fl 5/ -GATATCGCCACCATGGACTATATTGCTGAGC-3/ ；Rl 5/ -GATATCTTGTGTTTTATAATACAGCTTG-3';實施例2 :細胞腫大病毒DNA疫苗的應用
步驟I)疫苗的免疫注射。將200條大菱鲆(每條重約IOg)隨機分為4組(50條/組)，分別命名為A、B、C和D。將A和C組(免疫組)的每條魚肌肉注射50 μ I上述步驟I)的DNA疫苗制備液，將B和D組(對照組)的每條魚肌肉注射50 μ I PBS。步驟2)疫苗的免疫保護效應檢測。將細胞腫大病毒在GF細胞系(購于美國ATCC公司)中擴增、提取(具體方法參考Zenke K, Kim KH. Functional characterization of theRNase III gene of rock bream iridovirus. Arch. Virol. 2008; 153:1651-6)0 將提取的病毒懸浮于PBS中至105COpieS/ml，即為病毒懸液。在步驟2)免疫注射后的第30天，用病毒懸液腹腔注射步驟2)的A和B組魚，每條魚的注射量為100 μ I ;在步驟2)免疫注射后的第60天，用病毒懸液腹腔注射步驟2)的C和D組魚，每條魚的注射量為100μ I。在以后的30天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統計各組魚的總死亡數目Α組，13條；Β組，47條；C組，14條；D組，48條。利用下列公式計算相對免疫保護效率(RPS)RPS=IOOxd 一免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比)據此算出
DNA疫苗在免疫后一個月時針對細胞腫大病毒的免疫保護效率為72%，在免疫后兩個月時的免疫保護效率為71%。故本發明的DNA疫苗能夠高效并較長期性地保護大菱鲆抵御細胞腫大病毒感染。
權利要求
1.ー種細胞腫大病毒DNA疫苗，其特征在干以細胞腫大病毒0RF13序列為抗原基因克隆至真核表達載體，表達誘發即為質粒PCN13DNA疫苗。
2.按權利要求I所述的細胞腫大病毒DNA疫苗，其特征在于 步驟I)以細胞腫大病毒為模板，采用Fl和Rl為引物進行PCR擴增，PCR產物純化后與PCR克隆載體pBS-T于室溫連接2 — 4小時，連接混合液轉化到大腸桿菌DH5 α后于LB固體培養基上培養18 — 24小時，轉化子提取質粒，即為質粒PBS13 ； 步驟2)將質粒pCN3用Sma I酶切，回收5. 4kb片段，同時將pBS13用EcoRV酶切回收O.3kb片段；將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2 — 4小時，連接液轉化大腸桿菌DH5 α后于LB固體培養基上培養18 — 24小吋，轉化子提取質粒，即為DNA疫苗質粒PCN13。
3.按權利要求2所述的細胞腫大病毒DNA疫苗，其特征在于所述引物Fl為5'-GATATCGCCACCATGGACTATATTGCTGAGC-3/ ;R1 為 5' -GATATCTTGTGTTTTATAATACAGCTTG-3'。
4.按權利要求I所述的細胞腫大病毒DNA疫苗的應用，其特征在于所述DNA疫苗在制備預防或治療細胞腫大病毒藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及免疫學領域，具體的說是一種細胞腫大病毒DNA疫苗及其構建和應用。其構建方法利用真核表達載體pCN3構建DNA疫苗質粒pCN13。其應用方法將pCN13通過肌肉注射導入受免魚。本發明所得細胞腫大病毒DNA疫苗通過一次免疫即可誘發高效和長期的免疫保護效應。
文檔編號C12N15/34GK102847169SQ201210292458
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月16日 優先權日2012年8月16日
發明者張敏, 孫黎 申請人:中國科學院海洋研究所