專利名稱：一種鰻弧菌減毒疫苗及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及疫苗學領域，具體的說是一種鰻弧菌減毒疫苗及其應用。
背景技術：
鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是一種革蘭氏陰性細菌,能感染包括奸類、貝類和魚類等水產養殖動物，誘發危害嚴重的弧菌病。在魚類中，已發現鰻弧菌可感染多種海水和淡水魚，包括虹鱒、牙鲆、大菱鲆、鰻鱺、大黃魚等。鰻弧菌是一種條件致病菌，其誘發的弧菌病容易發生在不良的養殖環境條件下，如高溫、高養殖密度等。在歐美，弧菌病防控多年來依靠滅活性多聯疫苗。在我國，目前還沒有商業化鰻弧菌疫苗。已報導的實驗室鰻弧菌疫苗主要包括滅活疫苗和亞單位疫苗，尚無減毒疫苗。減毒疫苗是通過對病原菌株人為突變，隨后篩選毒力降低的突變株而獲得。減毒疫苗的優點是能夠通過細菌自身殘留的毒力入侵宿主，從而模擬自然感染，誘發強大的宿主免疫反應?；谶@一特點，許多減毒疫苗可通過浸泡和口服的方式傳遞，從而避免了昂貴的注射途徑，因此在應用上有很好的市場價值。

發明內容
本發明目的在于提供一種鰻弧菌減毒疫苗及其應用。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種鰻弧菌減毒疫苗，減毒疫苗菌株為鰻弧菌C312在含逐漸升高濃度的利福平的培養基中培養，直至培養到培養基中利福平濃度為100ug/ml，所得轉化菌株為減毒疫苗菌株 C312RM。將鰻弧菌C312在含有I. 5ug/ml利福平的LB培養基中培養4 一 5天，挑取轉化子，將轉化子在含有3ug/ml利福平的LB培養基中培養4 一 5天選取轉化子，將轉化子在含有6ug/ml利福平的LB培養基中培養4 一 5天選取轉化子；如此重復，直至LB培養基中利福平濃度達100ug/ml，由此獲得的轉化子即為減毒疫苗菌株C312RM。所述減毒疫苗菌株C312RM與海藻酸鈉微球按體積比I :1. 67混合，作為海豚鏈球菌免疫口服藥物；或將減毒疫苗菌株C312RM于LB培養基中培養至OD6tltl=O. 8-1離心沉淀于海水中重懸作為海豚鏈球菌免疫浸泡藥物。本發明具有如下優點本發明的疫苗可經由口服或浸泡方式傳遞，因此避免了常規的注射傳遞模式，操作簡單，成本低廉，可以廣泛用于各種養殖條件，具有良好的應用前
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具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而非以任何形式對本發明進行限制。在本發明實施例中所涉及到的常規性實驗方法均采用如下方法
實施例I鰻弧菌減毒疫苗的構建方法將鰻弧菌C312在含有I. 5ug/ml利福平的LB培養基中培養4 一 5天，挑取一個轉化子，將轉化子在含有3ug/ml利福平的LB培養基中培養4 一 5天，挑取一個轉化子，再將轉化子在含有6ug/ml利福平的LB培養基中培養4 一 5天，挑取一個轉化子。如此逐漸升高利福平濃度，直至利福平濃度達100ug/ml，(在含逐漸升高濃度的利福平的培養基中培養梯度為，I. 5ug/ml、3ug/ml、6ug/ml、12ug/ml、24ug/ml、48ug/ml 和 100ug/ml),在此培養基中挑取一個轉化子，命名為C312RM。所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨·，O. 5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97. 5%蒸餾水。所述鰻弧菌C312保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 6250，保藏日期2012. 6. 21，分類命名為鰻弧菌(Vibrioanguillarum)。實施例2C312RM毒力檢測用半致死量(LD5tl)測定方法(具體方法參見文獻WangH，Hu Y，Zhang Wj Sun L. Construction of an attenuated Pseudomonas fluorescensstrain and evaluation of its potential as a cross-protective vaccine.Vaccine2009;27:4047 — 55)檢測C312RM與野生株C312的毒力，發現野生株C312的LD50為IO6CFU,而減毒轉化子C312RM的LD5tl為I. 5xl08CFU。因此，較之于野生株C312，減毒轉化子C312RM的毒力大幅下降，是一株減毒株。實施例3鰻弧菌減毒疫苗C312RM的應用步驟I)疫苗海藻酸鈉微球飼料和對照海藻酸鈉微球飼料的制備。在LB培養基中于28°C培養C312RM至OD6tltl為0. 8 — 1，然后離心(5000g，4°C ) lOmin。收集菌體，將其懸浮于普通海水中至終濃度為lxl09cfu/ml，即為C312RM懸浮液。將50ml海藻酸鈉(質量百分比3%)與30ml C312RM懸浮液或PBS (對照)混合，隨后加入2000ml石蠟、10ml S-80乳化劑(皆購于美國Sigma公司)以及50ml氯化鈣(0. 15M)(購于上海Sangon公司)；將含有15947和PBS對照的混合液分別離心(1000g，IOmin),收集沉淀；將含有15947和PBS的沉淀分別與IOOOg魚飼料(購于山東升索漁用飼料研究中心)混合，用F(II)-26雙螺桿擠條制粒機(華南理工大學，廣州)加工制成顆粒飼料(I. 5mmX 2. 0mm)，即為疫苗海藻酸鈉微球飼料和對照海藻酸鈉微球飼料。所述PBS組成成分按重量百分比計0. 8 % NaCl, 0. 02 % KCl, 0. 358 %Na2HPO4. 12H20, 0. 024% NaH2PO4。步驟2)疫苗浸泡液的制備。在LB培養基中于28°C培養C312RM至OD6tltl為0. 8 —I,然后離心(5000g，4°C)10min。收集菌體，將其懸浮于海水中至終濃度為2xl07cfu/ml，即為疫苗浸泡液。步驟3)C312RM作為口服疫苗的應用。將60條牙鲆(每條重約12. 6g)隨機分為2(每組30條)，分別命名為A和B。將A (樣品組)和B (對照組)組魚分別喂食上述步驟I)的疫苗海藻酸鈉微球飼料和對照海藻酸鈉微球飼料，持續3天。
步驟4)C312RM作為浸泡疫苗的應用。將60條牙鲆(每條重約12. 6g)隨機分為2(每組30條)，分別命名為C和D。將C (樣品組)和D (對照組)組魚分別在上述步驟2)的疫苗浸泡液和普通海水中浸泡6小時。步驟5)疫苗的免疫保護效應檢 測。在LB培養基中培養鰻弧菌C312至0D_為
O.8，然后離心(5000g，4°C，10min)。收集菌體，將C312懸浮于海水中至終濃度為IxlO8Cfu/ml,即為鰻弧菌懸液。在上述步驟3)和4)免疫后的第30天，將4組魚在鰻弧菌懸液中浸泡4h，隨后將4組魚置入正常海水中養殖。在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統計各組魚的總死亡數目A組，8條；B組，20條；C組，6條；D組，18條。利用下列公式計算相對免疫保護效率(RPS)RPS=IOOxd 一免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比)據此算出C312RM作為口服疫苗的免疫保護效率為60%，C312RM作為浸泡疫苗的免疫保護效率為67%。故本發明的鰻弧菌減毒菌C312RM可作為口服和浸泡疫苗而有效地保護牙鲆抵御鰻弧菌感染。
權利要求
1.一種鰻弧菌減毒疫苗，其特征在于減毒疫苗菌株為鰻弧菌C312在含逐漸升高濃度的利福平的培養基中培養，直至培養到培養基中利福平濃度為100ug/ml，所得轉化菌株為減毒疫苗菌株C312RM。
2.按權利要求I所述的鰻弧菌減毒疫苗，其特征在于將鰻弧菌C312在含有I.5ug/ml利福平的LB培養基中培養4 一 5天，挑取轉化子，將轉化子在含有3ug/ml利福平的LB培養基中培養4 - 5天選取轉化子，將轉化子在含有6ug/ml利福平的LB培養基中培養4 一5天選取轉化子；如此重復，直至LB培養基中利福平濃度達lOOug/ml，由此獲得的轉化子即為減毒疫苗菌株C312RM。
3.按權利要求I所述的鰻弧菌減毒疫苗的應用，其特征在于所述減毒疫苗菌株C312RM與海藻酸鈉微球混合，作為海豚鏈球菌免疫口服藥物；或將減毒疫苗菌株C312RM于LB培養基中培養至0D_=0. 8-1離心沉淀于海水中重懸作為海豚鏈球菌免疫浸泡藥物。
全文摘要
本發明涉及疫苗學領域，具體的說是一種鰻弧菌減毒疫苗及其應用。減毒疫苗菌株為鰻弧菌C312在含逐漸升高濃度的利福平的培養基中培養，直至培養到培養基中利福平濃度為100ug/ml，所得轉化菌株為減毒疫苗菌株C312RM。本發明的疫苗可經由口服或浸泡方式傳遞，因此避免了常規的注射傳遞模式，操作簡單，成本低廉，可以廣泛用于各種養殖條件，具有良好的應用前景。
文檔編號C12R1/63GK102793916SQ20121029248
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月16日 優先權日2012年8月16日
發明者孫黎, 于蘭萍, 胡永華 申請人:中國科學院海洋研究所