專利名稱：胎盤全細胞凍存、復蘇以及分離和擴增干細胞的方法
技術領域：
本發明涉及對胎盤全細胞進行處理的方法，具體涉及對胎盤全細胞凍存、復蘇處理，以及由復蘇后的胎盤全細胞分離和擴增干細胞的方法，特別涉及對胎盤全細胞進行凍存、復蘇，然后再從中分離和擴增間充質干細胞的方法。
背景技術：
間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)來源于發育早期的中胚層和外胚層，具有多向分化潛能、免疫調節和自我復制等特點，日益受到人們的關注。間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復，尤其對治療衰老和組織器官損傷修復有很大的臨床應用價值。 MSC在骨髓中蘊含豐富，但隨著年齡的老化，骨髓中的干細胞數目也會顯著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓MSC移植給異體可能引起免疫反應，且提取干細胞過程對患者的損傷性和在采集時遇到的其他問題，都直接影響了骨髓MSC的臨床應用，使得尋找骨髓以外其他可替代的間充質干細胞來源成為一個重要的問題。近期的研究顯示，胎盤組織中也含有間充質干細胞并且能成功分離。這種組織來源的間充質干細胞不僅保持了間充質干細胞的生物學特性，而且分離出來的干細胞更原始，有更強的增殖分化能力。其免疫細胞的功能活性低，大大減低了觸發免疫反應及引起移植物抗宿主病的風險。潛伏性病毒和微生物的感染及傳播幾率比較低。采集過程簡單，對產婦及新生兒無任何危害及損傷。以上原因足以令胎盤間充質干細胞成為骨髓間充質干細胞的理想替代物。但是，胎盤組織分離干細胞的方法和技術還不是完全成熟，而且每一份胎盤組織的處理和分離后的細胞培養都需要一定的時間和人員的消耗。因此將胎盤組織凍存并且在有需要的時候復蘇進行干細胞分離的做法相對更符合成本效益。因此，本領域需要一個簡單和高效的胎盤組織凍存、復蘇和間充質干細胞的分離和擴增的方法，以滿足醫藥、科研、臨床等領域的需求。

發明內容
本發明的目的是解決現有技術凍存、復蘇胎盤全細胞方法的缺陷，提供一種簡單有效的胎盤全細胞凍存的方法，以及相配套使用的凍存胎盤全細胞復蘇的方法，以及復蘇后間充質干細胞擴增的方法。本發明發現對胎盤全細胞使用特定操作步驟的凍存、復蘇以及分離和擴增，可簡單、有效地從胎盤組織例如胎盤全細胞分離原代間充質干細胞，并且可以對原代間充質干細胞在凍存過程中有效地進行保護。本發明基于此發現而得以完成。因此，本發明第一方面提供了處理胎盤全細胞的方法，該方法包括以下對胎盤離體新鮮組織全細胞進行分離和凍存的步驟
(I)胎盤組織清洗通過緩沖液(例如PBS緩沖液)清洗胎盤組織，使胎盤組織表面殘留血液沖洗干凈，胎盤表面無血液凝塊；(2)胎盤組織消化處理從步驟(I)得到的胎盤組織上剪下胎盤小葉，加入緩沖液(例如PBS緩沖液)并將小葉剪碎，加入消化酶溶液(例如其非限制性地包含胰酶)中，消化處理5-40分鐘(例如10-30分鐘，例如約20分鐘)；(3)胎盤組織過濾處理加入FBS溶液(Gibco)終止消化，將消化處理后的胎盤組織碎片轉移至過濾裝置，對胎盤組織碎片進行研磨，同時收集濾液，對濾液進行細胞清洗；(4)配制胎盤全細胞凍存液所述胎盤全細胞凍存液中包含人血白蛋白、DMSO(二甲基亞砜)和DMEM-F12，配好的凍存液放在1°C至7 V (例如約4°C )的溫度條件下低溫冷藏；(5)胎盤全細胞凍存將步驟⑶得到的胎盤組織過濾液離心后去除上清液，在0-15°C (例如1°C至TC，例如約4°C )的低溫環境下，加入步驟⑷得到的全細胞凍存液，·然后轉移至凍存容器中，凍存容器放入程序降溫裝置，先在1°C至TC (例如4°C)的溫度條件下低溫冷藏O. 2-2小時(例如約O. 5小時)，再在-10°C至_150°C (例如約_80°C )的溫度條件下冷凍O. 25-3天(例如約I天)，然后將凍存容器于液氮中冷凍，備用。根據本發明第一方面的方法，該方法還包括以下對凍存的胎盤離體新鮮組織全細胞進行復蘇的步驟(6)凍存胎盤全細胞復蘇將步驟(5)冷凍的胎盤全細胞從液氮中取出，解凍至20%-70%(例如50%)凍存液開始融化，利用間充質干細胞培養基清洗細胞，離心處理清洗DMS0，去除上清液，進行紅細胞裂解步驟，離心處理后去除上清液，觀察紅細胞裂解情況，如有需要再重復紅細胞裂解的步驟進行裂解，最后進行細胞清洗步驟，去除上清液。根據本發明第一方面的方法，該方法還包括以下對復蘇的胎盤全細胞進行間充質干細胞分離和擴增的步驟(7)細胞培養向步驟(6)得到的全細胞中補加適量的間充質干細胞培養基重懸細胞，接種至培養容器，再將培養容器放進培養箱中進行培養，培養至第4-7天(例如第5天，例如第6天，例如第7天)時將培養容器從培養箱中取出，進行第一次半換液，繼續培養，在第8-10天(例如第9天)時將培養容器從培養箱中取出，進行第二次半換液，繼續培養，在第11-13天(例如第12天)時將培養容器從培養箱中取出，加入5-20ml (例如10-18ml，例如15ml)間充質干細胞培養基，往后每1-4天(例如2-3天)進行一次全換液；(8)細胞傳代當培養容器中的貼壁細胞融合率達到40%_90%(例如80%)以后，利用消化酶(例如TrypLe Express)將貼壁細胞脫離容器底部,離心,抽走上清液,加入充質干細胞培養基重新懸浮細胞，再接種于培養容器進行傳代并進行擴增培養，此后每1-3天(例如每2天)換液一次，直至融合率達到70-90%(例如80%)后，即得胎盤間充質干細胞，必要時進行傳代；以及任選的下列一個或多個步驟(9)對針對步驟(8)所得胎盤間充質干細胞，檢測以下項目的至少一項細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；(10)將步驟⑶所得傳代后的胎盤間充質干細胞于液氮中冷凍，備用。根據本發明第一方面的方法，該方法包括
(A)以下對胎盤離體新鮮組織全細胞進行分離和凍存的步驟(I)胎盤組織清洗通過緩沖液(例如PBS緩沖液)清洗胎盤組織，使胎盤組織表面殘留血液沖洗干凈，胎盤表面無血液凝塊；(2)胎盤組織消化處理從步驟⑴得到的胎盤組織上剪下胎盤小葉，加入緩沖液(例如PBS緩沖液)并將小葉剪碎，加入消化酶溶液(例如其非限制性地包含胰酶)中，消化處理5-40分鐘(例如10-30分鐘，例如20分鐘)；(3)胎盤組織過濾處理加入FBS溶液終止消化，將消化處理后的胎盤組織碎片轉移至過濾裝置，對胎盤組織碎片進行研磨，同時收集濾液，對濾液進行細胞清洗；(4)配制胎盤全細胞凍存液所述胎盤全細胞凍存液中包含人血白蛋白、DMSO(二甲基亞砜)和DMEM-F12，配好的凍存液放在1°C至7°C (例如4°C )的溫度條件下低溫冷藏；
(5)胎盤全細胞凍存將步驟(3)得到的胎盤組織過濾液離心后去除上清液，在
0-15°C (例如1°C至TC，例如4°C )的低溫環境下，加入步驟(4)得到的全細胞凍存液，然后轉移至凍存容器中，凍存容器放入程序降溫裝置，先在1°C至TC (例如4°C)的溫度條件下低溫冷藏O. 2-2小時(例如O. 5小時)，再在-10°C至_150°C (例如_80°C )的溫度條件下冷凍O. 25-3天(例如I天)，然后將凍存容器于液氮中冷凍，備用；(B)以下對凍存的胎盤離體新鮮組織全細胞進行復蘇的步驟(6)凍存胎盤全細胞復蘇將步驟(5)冷凍的胎盤全細胞從液氮中取出，解凍至20%-70%(例如50%)凍存液開始融化，利用間充質干細胞培養基清洗細胞，離心處理清洗DMS0，去除上清液，進行紅細胞裂解步驟，離心處理后去除上清液，觀察紅細胞裂解情況，如有需要再重復紅細胞裂解的步驟進行裂解，最后進行細胞清洗步驟，去除上清液；(C)以下對復蘇的胎盤全細胞進行間充質干細胞分離和擴增的步驟(7)細胞培養向步驟(6)得到的全細胞中補加適量的間充質干細胞培養基重懸細胞，接種至培養容器，再將培養容器放進培養箱中進行培養，培養至第4-7天(例如第5天，例如第6天，例如第7天)時將培養容器從培養箱中取出，進行第一次半換液，繼續培養，在第8-10天(例如第9天)時將培養容器從培養箱中取出，進行第二次半換液，繼續培養，在第11-13天(例如第12天)時將培養容器從培養箱中取出，加入5-20ml (例如10-18ml，例如15ml)間充質干細胞培養基，往后每1-4天(例如2-3天)進行一次全換液；(8)細胞傳代當培養容器中的貼壁細胞融合率達到40%_90%(例如80%)以后，利用消化酶(例如TrypLe Express)將貼壁細胞脫離容器底部,離心,抽走上清液,加入充質干細胞培養基重新懸浮細胞，再接種于培養容器進行傳代并進行擴增培養，此后每1-3天(例如每2天)換液一次，直至融合率達到70-90%(例如80%)后，即得胎盤間充質干細胞，必要時進行傳代；以及任選的(D)下列一個或多個步驟(9)對針對步驟(8)所得胎盤間充質干細胞，檢測以下項目的至少一項細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；(10)將步驟⑶所得傳代后的胎盤間充質干細胞于液氮中冷凍，備用。根據本發明第一方面的方法，其中所述胎盤是胎盤的新鮮離體組織。
根據本發明第一方面的方法，其中步驟⑴所述胎盤組織是在生物安全柜內進行處理。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(I)所述緩沖液的使用量是根據胎盤大小調整。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(I)所述緩沖液沖洗胎盤組織的沖洗次數為1-5次，優選2-3次。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(2)所述剪下胎盤小葉的工具為手術剪，根據本發明第一方面的方法，其中步驟(2)所述胎盤小葉剪下后被轉移至培養平皿，所述培養平皿直徑為5-20cm的培養平皿，優選培養皿直徑為IOcm的培養平皿。 根據本發明第一方面的方法，其中所述PBS緩沖液是磷酸的鈉鹽和/或鉀鹽配制的，其PH為5. 0-8. O，優選pH為5. 5-76，優選pH為6. 0-7. O。在一個實施方案中，所述PBS緩沖液中磷酸根的濃度為O. 01-0. 5M，優選O. 02-0. 1M。在本發明下文試驗中，所用PBS緩沖液是磷酸鈉鹽，其中磷酸根的濃度為O. 025M，pH為6. 5。需要說明的是，本發明人發現，在上述范圍內的PBS緩沖液濃度和pH值對于本發明方法的效果影響不大。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(2)所述PBS緩沖液的加入量為10_40ml，優選25ml。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(2)所述消化酶溶液的加入量為10_40ml，優選25ml。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(2)所述PBS緩沖液的加入量與消化酶溶液的加入量比例為3:1-1:3，優選為1:1。根據本發明第一方面的方法，其中所述消化酶溶液是胰酶溶液，優選O. 1-0. 5%的胰酶溶液，優選O. 25%的胰酶溶液。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(2)中，消化處理的時間為5-40分鐘，優選10-30分鐘，優選20分鐘。本發明人發現在10-30分鐘的消化處理時間內，對組織塊的消化處理效果是最佳的，既可保證組織塊得到充分的消化處理，也能避免細胞被破壞，然而在消化處理時間低于IOmin例如為5min時,或者消化處理時間超過35min例如為40min時,如實施例2所述經3代傳代后，細胞純度低于75%。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(2)中，消化處理是在人體體溫附近的溫度范圍內進行的，優選34-40 V，優選36-38 V，優選37 °C。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(2)中，消化處理是在恒溫搖床里進行的。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(3)中，FBS溶液加入量為3-10ml，優選4_8ml,優選 5ml。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(3)中，FBS溶液優選為FBS(Gibco)溶液。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(3)中，過濾裝置為金屬過濾器，優選為100目-500目的金屬過濾器，優選為200目金屬過濾器。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(3)中，收集過濾完的液體是利用另一個
培養皿。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(3)中，對胎盤組織碎片進行研磨之后，力口入緩沖液(例如PBS緩沖液)清洗組織并繼續研磨，緩沖液分開2-3次加入，優選分開2次加入，緩沖液加入量為5-16ml,優選加入量為10ml。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(3)中，細胞清洗的具體步驟是用離心容器(50ml離心管)收集濾液，離心處理，去除上清液，加入緩沖液(例如PBS緩沖液)重懸細胞，再次離心處理，去除上清液，加入緩沖液(例如PBS緩沖液)重懸細胞，抽取小量樣本進行細胞計數，最后再離心處理并去除上清液，待后續步驟凍存處理。所述離心轉速為800-2000rpm,優選1400rpm,離心時間為優選10分鐘。根據本發明第一方面的方法，其中所述胎盤組織凍存液中包含人血白蛋白、DMSO和DMEM-F12。在一個實施方案中，所述胎盤組織凍存液中含有5-30重量份的人血白蛋白。在一個實施方案中，所述胎盤組織凍存液中含有10-20重量份的人血白蛋白。在一個實施方案中，所述胎盤組織凍存液中含有15重量份的人血白蛋白。在一個實施方案中，所述胎盤組織凍存液中含有5-20重量份的DMSO。在一個實施方案中，所述胎盤組織凍存液中含有7-15重量份的DMS0。在一個實施方案中，所述胎盤組織凍存液中含有10重量份的DMS0。在一個實施方案中，所述胎盤組織凍存液中含有40-80重量份的DMEM-F12。在一個實施方 案中，所述胎盤組織凍存液中含有50-70重量份的DMEM-Fl2。在一個實施方案中，所述胎盤組織凍存液中含有65重量份的DMEM-F12。在一個實施方案中，所述胎盤組織凍存液中含有約15重量份的人血白蛋白、約10重量份的DMSOJS 65重量份的DMEM-F12。上述實施方案中，胎盤組織凍存液中各組分含量的總和為100%。本發明人發現，含有約15重量份的人血白蛋白、約10重量份的DMSOJS 65重量份的DMEM-F12的胎盤組織凍存液(即其中人血白蛋白、DMS0、DMEM-F12的重量比是15:10:65)是特別優選的，比之于使該胎盤組織凍存液的任一成分含量變化10%以上的配方在保護胎盤組織不受冷凍過程破壞等效果方面具有顯著優勢，例如采用上述特別優選的15:10:65的比率，在下文實施例2中，經3代傳代后，細胞純度大于90% ;但當使用該胎盤組織凍存液的任一成分含量變化10%以上的配方時，在下文實施例2中，經3代傳代后，細胞純度低于80%。在本發明中，由于凍存液中還可能含有本領域技術人員通用的其它配液溶劑或溶質，因此上述以“重量份”表示的人血白蛋白和DMSO的量是一種相對量，其可以是毫克、克、千克等。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(5)中，根據本發明第一方面的方法，其中步驟(4)所述低溫環境為0-15°C，優選1°C至7°C，優選4°C。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(5)所述凍存容器為凍存管。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(5)所述每一凍存容器(凍存管)中加入的重懸細胞凍存液的體積為O. 5-3ml，優選1ml。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(4)所述的細胞在凍存容器中的密度以確保任一細胞均有足夠的DMSO提供保護為上限，所述密度是指單位空間內的細胞個體數，優選I X 107-4X IO8每毫升，優選4 X IO7-I X IO8每毫升。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(5)所述的程序降溫裝置是程序降溫盒。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(5)所述的低溫冷藏和低溫冷凍是將程序降溫裝置(例如程序降溫盒)放入冰箱實現的。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(5)所述的樣本冷藏流程為在1°C至7V的溫度條件下低溫冷藏O. 2-2小時。在一個實施方案中，所述低溫冷藏是在21至61的溫度條件下。在一個實施方案中，所述低溫冷藏是在3°C至5°C的溫度條件下。在一個實施方案中，所述低溫冷藏是在4°C的溫度條件下。在一個實施方案中，所述低溫冷藏時間為O. 3-1. 5小時。在一個實施方案中,所述低溫冷藏時間為O. 4-1小時。在一個實施方案中，所述低溫冷藏時間為O. 5小時。本發明人發現，在4°C的溫度條件下低溫冷藏O. 5小時是特別優選的，能夠確保DMSO和胎盤全細胞充分融合。上述其他冷藏溫度條件和冷藏時間也能使DMSO和胎盤全細胞融合，其融合效果可以滿足本發明的基本需求，但4°C的溫度條件下低溫冷藏O. 5小時的融合效果最充分，具有明顯優勢。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(5)所述的樣本冷凍流程為在-10°C至-150°C的溫度條件下冷凍O. 25-3天。在一個實施方案中，所述冷凍是在_30°C至_120°C的溫度條件下。在一個實施方案中，所述冷凍是在_50°C至_100°C的溫度條件下。在一個實施方案中，所述冷凍是在_80°C的溫度條件下。在一個實施方案中，所述冷凍時間為O. 4-2天。在一個實施方案中，所述冷凍時間為O. 8-1. 5天。在一個實施方案中，所述冷凍時間為I天。本發明人發現，在_80°C的溫度條件下冷凍I天是特別優選的，比之于使該冷凍流程的任一溫度、時間變化10%以上的冷凍流程在保護胎盤組織不受冷凍過程破壞等效果方面具有顯著優勢。 根據本發明第一方面的方法，其中步驟(6)所述解凍是在恒溫水浴中進行。根據本發明第一方面的方法，其中所述間充質干細胞培養基中包含FBS、L-Glutamine>Gentamicin和DMEM-F12。在一個實施方案中，所述間充質干細胞培養基中含有10-20%的FBS。在一個實施方案中，所述間充質干細胞培養基中含有約15%的FBS。在一個實施方案中，所述間充質干細胞培養基中含有O. 5-2%的L-Glutamine。在一個實施方案中，所述間充質干細胞培養基中含有約1%的L-Glutamine (L-谷氨酰胺)。在一個實施方案中，所述間充質干細胞培養基中含有O. 02-0. 1%的Gentamicin (慶大霉素)。在一個實施方案中，所述間充質干細胞培養基中含有約O. 05%的Gentamicin。在一個實施方案中，所述間充質干細胞培養基中含有80-90%的DMEM-F12。在一個實施方案中，所述間充質干細胞培養基中含有約84%的DMEM-F12。在一個實施方案中，所述間充質干細胞培養基中含有約15重量份的FBSJ^] I重量份的L-Glutamine、約O. 05重量份的Gentamicin和約84重量份的DMEM-F12。本發明人發現，含有約15重量份的FBSj^ I重量份的L-Glutamine、約O. 05重量份的Gentamicin和約84重量份的DMEM-F12的間充質干細胞培養基是特別優選的，比之于使該培養基的任一成分含量變化10%以上的配方在增加胎盤組織貼壁、減短貼壁細胞從組織爬出的時間等效果方面具有顯著優勢。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(6)所述間充質干細胞培養基是通過點滴法清洗細胞。點滴法可有效地將組織內的DMSO清洗出來，從而避免在復蘇過程中細胞存活率的流失。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(6)所述解凍獲得的細胞懸液與間充質干細胞培養基的體積比為1:2-1:5，優選體積比為1:3。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(6)所述離心處理是在離心容器(離心管)中進行。在一個實施方案中，離心轉速為800-2000rpm，優選1400rpm。在一個實施方案中，尚心時間為5-20分鐘，優選10分鐘。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(6)所述紅細胞裂解步驟是加入PBS重懸細胞，向細胞懸液中再加入紅細胞裂解液，常溫條件下培養。在一個實施方案中，紅細胞裂解液為Roche紅細胞裂解液。在一個實施方案中，細胞懸液與裂解液的比例為1:1至1:5，優選比例為1:2至1:3。在一個實施方案中，常溫條件為在0-30°C，優選15-25°C。在一個實施方案中，培養時間為5-20分鐘，優選10-15分鐘。本發明人發現，利用Roche紅細胞裂解液對樣本里面的紅細胞進行裂解，細胞懸液與裂解液的比例為1:2到1:3，在15-25°〇培養10-15分鐘具有最佳的裂解效果，實驗結果證明其有效的清除大部分的紅細胞，避免了在細胞培養時出現紅細胞污染。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(6)所述如有需要重復紅細胞裂解步驟的判斷標準是，紅細胞是否大部分被清楚，即如果紅細胞大部分未被清除，重復紅細胞裂解的步驟，如果紅細胞已經被大部分清除，則不再重復紅細胞裂解步驟，直接進入之后的步驟。紅細胞大部分被清除是指紅細胞被清除50%以上，優選紅細胞被清除70%以上，優選紅細胞被清除90%以上。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(6)所述細胞清洗的步驟是加入PBS重懸細胞并抽取小量樣本進行細胞計數，放進離心機進行離心以清洗細胞。在一個實施方案中，離心轉速為800-2000rpm，優選1400rpm。在一個實施方案中，離心時間為5_20分鐘，優選10分鐘。·根據本發明第一方面的方法，其中步驟(7)所述接種至培養容器的步驟是以
1-10X IoVcm2的密度將細胞懸液接種到培養容器，優選密度為2-5X104/cm2。在一個實施方案中，細胞懸液接種量為5-20ml，優選15ml。在一個實施方案中，其中步驟(7)所述接種至培養容器的步驟是以2-5X IOVcm2的密度將15ml的細胞懸液接種到培養容器中。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(7)所述培養容器為T25細胞培養瓶。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(7)所述培養箱中CO2濃度為3-7%，優選濃度為5%，培養箱溫度控制在人體體溫附近范圍內，優選34-40°C，優選36-38°C，優選37°C。根據本發明第一方面的方法，在步驟(9)中，所述細胞活性檢測是利用臺盼藍染色法計數凍存前后活細胞的數目。根據本發明第一方面的方法，在步驟(9)中，所述細胞污染檢測利用少量細胞培養，檢測細胞是否受到真菌和細菌的污染。在一個實施方案中，所述細胞污染檢測是利用病原學方法，檢測細胞是否受到選自下列的一項或多項的感染乙肝兩對半、丙肝、艾滋病毒、巨細胞病毒、EB 病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-l/2Ab、CMV-IgM和 EBV-IgA、TRUST。根據本發明第一方面的方法，在步驟(9)中，所述遺傳病檢測是利用分子遺傳學的方法，檢測凍存細胞是否存在遺傳病。根據本發明第一方面的方法，在步驟(9)中，所述HLA-ABC/DR配型是檢測細胞HLA-ABC/DR 表型。根據本發明第一方面的方法，在步驟(10)中，所述胎盤間充質干細胞是經程序降溫過程凍存于液氮中。根據本發明第一方面的方法，在步驟(10)中，所述胎盤間充質干細胞存在于細胞凍存液中。在一個實施方案中，該細胞凍存液包含DMEM-F12、二甲基亞砜和人血白蛋白。在一個實施方案中，該細胞凍存液包含約65份的DMEM-F12、約10份的二甲基亞砜、約15份的人血白蛋白。在一個實施方案中，該細胞凍存液包含50%低糖DMEM培養液、40%FBS、10% 二甲基亞諷。根據本發明第一方面的方法，該方法包括以下步驟(I)胎盤組織清洗胎盤組織是在生物安全柜內進行處理，根據胎盤大小使用適量PBS緩沖液對胎盤組織進行沖洗2-3遍，使胎盤組織表面殘留血液沖洗干凈，胎盤表面無血液凝塊；(2)胎盤組織消化處理使用手術剪從步驟(I)得到的胎盤組織上剪下胎盤小葉，把小葉轉移到培養皿上，加入25ml PBS緩沖液并把胎盤小葉盡量剪碎，加入25ml O. 25%胰酶(Gibco)(胰酶跟PBS緩沖液體積比例為1:1)并混勻組織，把培養皿放進37°C的恒溫搖床里消化20分鐘；(3)胎盤組織過濾處理往培養皿里加入5ml FBS (Gibco)并混勻以達到終止消化的目的，把消化過后的胎盤組織碎片轉移到200目金屬過濾器上，對胎盤組織碎片進行研磨并利用另一培養皿收集過濾完的液體，分開兩次往金屬過濾器加入IOml的PBS緩沖液清 洗組織并繼續研磨，將收集的濾液轉移至50ml離心管，以速度1400rpm離心10分鐘，去除上清液并加入PBS緩沖液重懸細胞，以速度1400rpm離心10分鐘，去除上清液，加入PBS緩沖液重懸細胞，抽取小量樣本進行細胞計數，以速度1400rpm離心10分鐘以達到清洗細胞的效果；(4)配制胎盤全細胞凍存液所述胎盤全細胞凍存液中包含15重量份的人血白蛋白、10重量份的DMSO ( 二甲基亞砜)和65重量份的DMEM-F12，配好的凍存液放在4°C冰箱保存直至使用；(5)胎盤全細胞凍存將步驟(3)得到的胎盤組織過濾液離心后去除上清液，在4°C的低溫環境下，加入步驟(4)得到的全細胞凍存液，然后以每一管每毫升4X107到IX IO8的細胞密度加入凍存管里，此過程需在4°C的低溫條件下進行，將凍存管放入程序降溫盒里，先在4°C的溫度條件下低溫冷藏O. 5小時，再-80°C的溫度條件下冷凍I天，然后將凍存管于液氮中冷凍，備用。進一步地，可以包括與凍存方法配套使用的復蘇方法(6)凍存胎盤全細胞復蘇將步驟(4)冷凍的胎盤全細胞從液氮中取出，放在恒溫水浴里解凍至一半凍存液開始融化，利用間充質干細胞培養基(其例如包含15% FBS+1%L-Glutamine+0. 05% Gentamicin+84%DMEM-F12)進行點滴法清洗胎盤全細胞，解凍獲得的細胞懸液與間充質干細胞培養基的體積比為l:3(lml:3ml)，將混合有間充質干細胞培養基的細胞懸液轉移到離心管，以速度1400rpm離心10分鐘清洗DMS0，去除上清液，加入PBS緩沖液重懸細胞，并以I份細胞懸液比2-3份紅細胞裂解液的比例加入紅細胞裂解液(Roche),在15-25°C的環境下培養10-15分鐘，放進離心機以速度1400rpm離心10分鐘進行離心，離心后去除上清液，觀察紅細胞裂解情況，如有需要再重復紅細胞裂解的步驟進行裂解，最后加入PBS緩沖液重懸細胞并抽取小量樣本進行細胞計數，放進離心機以速度1400rpm離心10分鐘進行離心以清洗細胞，去除上清液。進一步地，可以包括復蘇后間充質干細胞分離和擴增的方法(7)細胞培養向步驟(6)得到的全細胞中補加適量的間充質干細胞培養基重懸細胞，轉移到T25培養瓶，再將T25培養瓶放進CO2濃度為5%的37°C培養箱中進行培養，培養至第6天時將T25培養瓶從培養箱中取出，進行第一次半換液，繼續培養，在第9天時將T25培養瓶從培養箱中取出，進行第二次半換液，在第12天把平皿里面的培養基抽走，加入15ml間充質干細胞培養基繼續培養，往后每2天進行一次全換液；(8)細胞傳代當T25培養瓶里面的貼壁細胞融合率達到80%左右，可利用消化酶(TrypLE Express)將貼壁細胞脫離T25培養瓶底部，離心后移除上清液，并加入間充質干細胞培養基重新懸浮細胞，接種于T25細胞培養瓶進行傳代，并進行擴增培養；此后每兩天換液一次直至融合率達到80%后，即得，必要時再進行傳代。進一步地，可以針對以上步驟(8)所得胎盤間充質干細胞，檢測以下項目的至少一項細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型。進一步地，可以將以上步驟(8)所得傳代后的胎盤間充質干細胞于液氮中凍存，備用。進一步地，可以將傳代后的細胞于液氮中凍存并記錄相關胎兒信息，并進行細胞的生物學特性及多向分化潛能鑒定，以及對細胞進行分子遺傳學診斷，保存細胞的所有相 關數據，建立胎盤干細胞的數據庫并與凍存細胞進行關聯。因此本發明在一個方面中，提供了建立胎盤干細胞數據庫的方法，其包括本發明第一方面分離和擴增胎盤間充質干細胞的步驟，以及如下步驟將傳代后的細胞于液氮中凍存并記錄相關胎兒信息，并進行細胞的生物學特性及多向分化潛能鑒定，以及對細胞進行分子遺傳學診斷，保存細胞的所有相關數據，建立胎盤干細胞的數據庫并與凍存細胞進行關聯。此外，在本發明的第一方面，提供了對胎盤全細胞凍存、復蘇以及復蘇后干細胞分離和擴增的方法。因此本發明第二方面提供了一種胎盤間充質干細胞。根據本發明第二方面的胎盤間充質干細胞，其是根據本發明第一方面任一實施方案所述方法獲得的。根據本發明第二方面的胎盤間充質干細胞，其細胞純度大于90%，例如大于95%。在一個實施方案中，所述胎盤間充質干細胞經3代以上傳代后，細胞純度大于90%，例如大于 95%。下面對本發明作進一步的說明。本發明所引用的文獻，以及該文獻中所引用的文獻，它們的全部內容通過弓I用并入本文。 在本發明中，本發明任一方面的任一技術方案中，其任一技術特征同樣適用于本發明的任一方面的任一實施方案，只要它們不會引起矛盾，并且這種相互適用在必要時可以作適當的修改。在本發明中，術語“胎盤間充質干細胞”是指來源于胎盤的間充質干細胞。因此在本發明中，特別是涉及本發明的語境中，術語“胎盤間充質干細胞”可以與“胎盤干細胞”、“干細胞”、“間充質干細胞”互換使用，除非另有明確指明。在本發明中，術語“PBS緩沖液”或者“PBS”是指磷酸鹽緩沖液。本領域技術人員熟知在本發明情形下使用的PBS的一般性配方和配制方法以及它們的一般性質例如pH值或pH范圍。在本發明中，術語“胎盤”是指新生兒胎盤，特別是指產后4小時之內的胎盤。間充質干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)例如人類的間充質干細胞最早是從骨髓中分離出來的，來源于中胚層的一類具有多向分化潛能和自我更新能力的組織干細胞，在體內和體外特定條件下具有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、內皮細胞、神經細胞、肌細胞、肝細胞等多種成體細胞分化的能力(Caplan Al. Mesenchymal stem cells. JOrthop Res. 1991, 9:641-650. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC,et al. Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999; 284:143-147)。最新的研究表明間充質干細胞具有免疫調節和造血支持作用，而且易于外源基因導入表達。因此間充質干細胞不但是組織工程化骨、軟骨和心肌構建中的種子細胞，基因治療中重要的載體細胞，而且由于間充質干細胞促進造血重建和抑制移植物抗宿主反應功能，在造血干細胞移植和器官移植中具有廣泛的應用前景。間充質干細胞具有體外貼壁生長的特性，利用這種特性，人們已經成功從肝臟、腎臟、胰腺、肌肉、軟骨、皮膚、外周血等多種組織中分離培養出間充質干細胞。目前所報道的間充質干細胞主要來源于骨髓，采用密度梯度離心法獲得。雖然分離方法簡便，但供者取髓需要經歷一個比較痛苦的手術，并在取材過程中及取材后會有很高的感染機會；由于人體骨髓中MSC的含量極其稀少，每IO5 IO6個單個核細胞中大約只有I個，而且隨著年齡的增加，骨髓中間充質干細胞的數量、增殖和分化能力均顯著下降，使其在研究和應用尤其是臨床應用中受到限制。起源于胚胎發育期胚外中胚層的胎盤是由
最新的研究表明胎盤中含有豐富的干細胞，從胎盤中分離培養出這些多能干細胞將為實驗研究和臨床應用開辟一個嶄新而豐富的來源。現有的分離干細胞從而建立干細胞庫的方法尚有諸多缺點，例如純度不足、和/或數量不高，進而顯示出這些方法尚不能滿足人們的期待。例如CN 101270349A(中國專利申請號200810061267. 6，
公開日2008年9月24日)公開的題為“胎盤間充質干細胞分離和體外擴增培養方法”的發明；CN 101693884A (中國專利申請號200910117522. 9，
公開日2010年4月14日)公開的題為“一種從胎盤、胎盤或脂肪組織中分離提取干細胞的方法”的發明；CN 102146359A(中國專利申請號201110005964. 1，
公開日2011年8月10日)公開的題為“從胎盤中提取原始間充質干細胞及無血清擴增的方法”的發明。這些方法在提取物的純度和/或回收率方面是有待進一步改善的。由于臍血中含有豐富的造血干細胞，人們建立臍血庫將臍血造血干細胞這一重要的生物資源儲存起來，為多種血液系統疾病和免疫系統疾病提供一種治療手段。同樣胎盤間充質干細胞作為一種更加重要的干細胞資源，我們運用常規的細胞凍存方法將其冷凍在-196攝氏度的深低溫液氮中長期保存，建立胎盤干細胞庫，為日后的干細胞治療保存種子。根據本發明的方法，胎盤組織凍存液的配方和樣本冷凍的流程能成功并有效的對胎盤全細胞在冷凍的過程中進行保護。根據本發明的方法，利用點滴法將培養基加入復蘇的凍存胎盤全細胞，不但可以將全細胞中的DMSO清洗出來，還可以避免使用離心的步驟，從而避免在離心過程中細胞的流失，進而達到有效提高復蘇細胞的存活率的效果。根據本發明的方法，其中間充質干細胞培養基配方能成功并有效的對胎盤間充質干細胞進行體外擴增。根據本發明的方法，其中換液時間的設定縮短了貼壁細胞達到指定融合率的時間。本發明操作簡單，方便實用，能有效保護凍存的胎盤全細胞，避免復蘇過程中細胞存活率流失，能得到大量的間充質干細胞，分化性能好，具有向成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、內皮細胞、神經細胞等細胞分化的能力。與現有方法的比較目前MSC主要采用手術法抽取供者骨髓或灌流法分離胎盤，貼壁培養獲得。該法分得細胞數量少，而且供者在取髓中和取髓后均有感染的可能。本發明成功自胎盤中分離獲得大量純度較高的間充質干細胞，并運用此法建立胎盤干細胞庫來儲備這種極具應用前景的干細胞。該法簡便易行，且由于胎盤與臍血一樣，細胞成份較幼稚，來源廣泛，方便易得，因此本發明的方法在干細胞的臨床應用上將具有廣泛的前景。
具體實施例方式通過下面的實施例可以對本發明進行進一步的描述，然而，本發明的范圍并不限于下述實施例。本領域的專業人員能夠 理解，在不背離本發明的精神和范圍的前提下，可以對本發明進行各種變化和修飾。本發明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現本發明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但是本發明仍然在此作盡可能詳細的描述。實施例I、胎盤全細胞凍存、復蘇以及復蘇后干細胞分離和擴增的方法胎盤組織凍存方法包括以下步驟(I)胎盤組織清洗胎盤組織是在生物安全柜內進行處理，根據胎盤大小使用適量PBS緩沖液對胎盤組織進行沖洗2-3遍，使胎盤組織表面殘留血液沖洗干凈，胎盤表面無血液凝塊；(2)胎盤組織消化處理使用手術剪從步驟(I)得到的胎盤組織上剪下胎盤小葉，把小葉轉移到培養皿上，加入25ml PBS緩沖液并把胎盤小葉盡量剪碎，加入25ml O. 25%胰酶(Gibco)(胰酶跟PBS緩沖液體積比例為1:1)并混勻組織，把培養皿放進37°C的恒溫搖床里消化20分鐘；(3)胎盤組織過濾處理往培養皿里加入5ml FBS(Gibco)并混勻以達到終止消化的目的，把消化過后的胎盤組織碎片轉移到200目金屬過濾器上，對胎盤組織碎片進行研磨并利用另一培養皿收集過濾完的液體，分開兩次往金屬過濾器加入IOml的PBS緩沖液清洗組織并繼續研磨，將收集的濾液轉移至50ml離心管，以速度1400rpm離心10分鐘，去除上清液并加入PBS緩沖液重懸細胞，以速度1400rpm離心10分鐘，去除上清液，加入PBS緩沖液重懸細胞，抽取小量樣本進行細胞計數，以速度1400rpm離心10分鐘以達到清洗細胞的效果；(4)配制胎盤全細胞凍存液所述胎盤全細胞凍存液中包含15重量份的人血白蛋白、10重量份的DMSO ( 二甲基亞砜)和65重量份的DMEM-F12，配好的凍存液放在4°C冰箱保存直至使用；(5)胎盤全細胞凍存將步驟(3)得到的胎盤組織過濾液離心后去除上清液，在4°C的低溫環境下，加入步驟(4)得到的全細胞凍存液，然后以每一管每毫升4X107到IX IO8的細胞密度加入凍存管里，此過程需在4°C的低溫條件下進行，將凍存管放入程序降溫盒里，先在4°C的溫度條件下低溫冷藏O. 5小時，再-80°C的溫度條件下冷凍I天，然后將凍存管于液氮中冷凍，備用。與凍存方法配套使用的復蘇方法包括以下步驟(6)凍存胎盤全細胞復蘇將步驟(4)冷凍的胎盤全細胞從液氮中取出，放在恒溫水浴里解凍至一半凍存液開始融化，利用間充質干細胞培養基(其例如包含15% FBS+1%L-Glutamine+O. 05% Gentamicin+84%DMEM-F12)進行點滴法清洗胎盤全細胞，解凍獲得的細胞懸液與間充質干細胞培養基的體積比為l:3(lml:3ml)，將混合有間充質干細胞培養基的細胞懸液轉移到離心管，以速度1400rpm離心10分鐘清洗DMSO，去除上清液，加入PBS緩沖液重懸細胞，并以I份細胞懸液比2-3份紅細胞裂解液的比例加入紅細胞裂解液(Roche),在15-25°C的環境下培養10-15分鐘，放進離心機以速度1400rpm離心10分鐘進行離心，離心后去除上清液，觀察紅細胞裂解情況，如有需要再重復紅細胞裂解的步驟進行裂解，最后加入PBS緩沖液重懸細胞并抽取小量樣本進行細胞計數，放進離心機以速度1400rpm離心10分鐘進行離心以清洗細胞，去除上清液。復蘇后間充質干細胞分離和擴增的方法包括以下步驟(7)細胞培養向步驟(6)得到的全細胞中補加適量的間充質干細胞培養基重懸細胞，轉移到T25培養瓶，再將T25培養瓶放進CO2濃度為5%的37°C培養箱中進行培養，培養至第6天時將T25培養瓶從培養箱中取出，進行第一次半換液，繼續培養，在第9天時將T25培養瓶從培養箱中取出，進行第二次半換液，在第12天把平皿里面的培養基抽走，加入 15ml間充質干細胞培養基繼續培養，往后每2天進行一次全換液；(8)細胞傳代當T25培養瓶里面的貼壁細胞融合率達到80%左右，可利用消化酶(TrypLE Express)將貼壁細胞脫離T25培養瓶底部，離心后移除上清液，并加入間充質干細胞培養基重新懸浮細胞，接種于T25細胞培養瓶進行傳代，并進行擴增培養；此后每兩天換液一次直至融合率達到80%后，即得，必要時再進行傳代。在以上步驟的測試中，復蘇后的胎盤全細胞在培養的第8天開始有貼壁細胞出現，培養至第20天細胞融合率達到80%，經3代傳代后，細胞純度大于80%。在以上步驟的測試中，胎盤組織凍存液中包含15重量份的人血白蛋白、10重量份的DMSO ( 二甲基亞砜)和65重量份的DMEM-F12，該凍存液的三種組分中，任意一種比率在偏離上述配比20%以上時，凍存液不能在冷凍的過程對胎盤組織有效保護，具體表現為凍存胎盤組織復蘇后分離的間充質干細胞計數明顯下降。在以上步驟的測試中，樣本冷凍的流程為在4°C的溫度條件下低溫冷藏O. 5小時，再_80°C的溫度條件下冷凍I天，該冷凍流程的任意溫度在偏離上述溫度60%以上時，以及時間在偏離80%以上時，冷凍過程中胎盤組織沒有得到有效保護，具體表現為凍存胎盤組織復蘇后分離的間充質干細胞計數明顯下降。在以上步驟的測試中，間充質干細胞培養基中包含15重量份FBS、1重量份L-Glutamine,O. 05重量份Gentamicin和84重量份DMEM-F12。該培養基的四種組份中，其中的任意三種比例固定時，另一種的比率在偏離上述配比10%以上時，傳代至T25培養瓶后，在第17天融合率均未達到75%。例如當使用的間充質干細胞培養基中包含I重量份L-Glutamine,O. 05 重量份 Gentamicin 和 84 重量份 DMEM-F12，以及 12 重量份 FBS、13. 5 重量份FBS、16. 5重量份FBS、或18重量份FBS時，四種情況下，傳代至T25培養瓶后，在第17天融合率均在53-74%之間。在以上步驟的測試中，換液時間為細胞培養的第6天進行第一次半換液，第9天進行第二次半換液，在第12天把平皿里面的培養基抽走，加入15ml間充質干細胞培養基繼續培養，往后每2天進行一次全換液，其中的任意換液時間在偏離上述時間10%以上時，貼壁細胞未在20天內達到融合率80%。例如換液時間為細胞培養的第10天第一次半換液，或往后為每4天一次全換液，兩種情況下，貼壁細胞在第22-25天達到80%。在以上步驟的測試中，消化液為O. 25%的胰酶溶液，消化時間為20分鐘。在培養液中胰酶含量偏離上述含量20%以上時，或在消化時間偏離上述時間20%以上時，組織里的全細胞不能高效分離，分離是否高效根據抽取小量樣本的細胞計數判斷。在以上步驟的測試中，細胞懸液與裂解液的比例為1:2到1:3，在15-25°C培養10-15分鐘以達到最佳的裂解效果。實驗結果證明以上的方法能有效的清除大部分的紅細胞，避免在細胞培養時出現紅細胞污染，其中細胞懸液與裂解液的比例在偏離上述比例50%以上時，或培養溫度偏離上述溫度20%以上時，或培養時間偏離上述時間20%以上時，紅細胞裂解率不足50%。貼壁細胞未在20天內達到融合率80%。例如換液時間為細胞培養的第10天第一次半換液，或往后為每4天一次全換液，兩種情況下，貼壁細胞在第22-25天達到80%。實施例2、胎盤全細胞凍存、復蘇以及復蘇后干細胞分離和擴增的方法 參考實施例I的方法進行。復蘇后的胎盤全細胞在培養的第7天開始有貼壁細胞出現，培養至第19天細胞融合率達到80%。經3代傳代后，細胞純度大于90%。實施例3、胎盤全細胞凍存、復蘇以及復蘇后干細胞分離和擴增的方法參考實施例I的方法進行。復蘇后的胎盤全細胞在培養的第8天開始有貼壁細胞出現，培養至第21天細胞融合率達到80%。經3代傳代后，細胞純度大于85%。實施例4、胎盤全細胞凍存、復蘇以及復蘇后干細胞分離和擴增的方法參考實施例I的方法進行。復蘇后的胎盤全細胞在培養的第8天開始有貼壁細胞出現，培養至第21天細胞融合率達到80%。實施例5、胎盤全細胞凍存、復蘇以及復蘇后干細胞分離和擴增的方法參考實施例I的方法進行。復蘇后的胎盤全細胞在培養的第7天開始有貼壁細胞出現，培養至第20天細胞融合率達到80%。實施例6、胎盤MSC的傳代培養及其凍存將實施例1-5任一項獲得的細胞進行消化，消化后取I X IO6細胞加入到Iml細胞凍存液(含65份DMEM-F12+10份二甲基亞砜+15份人血白蛋白)中，經過程序降溫最后進入到液氮罐中凍存。實施例7、胎盤MSC的牛物學特件鑒定I、細胞牛長及其形杰學特點通過實施例I和實施例6的分離培養，胎盤單個核細胞培養72小時后在顯微鏡下可明顯見到梭形貼壁細胞，10天左右會形成渦輪狀細胞克隆，消化傳代后會形成80%左右融合的貼壁層。培養過程中，發現這種細胞形態相對均一，增殖速度快，貼壁速度快，易被胰酶消化，傳代至5-15代，其形態及生長特點亦無明顯改變。2、流式細胞術鑒定MSC表面標志分別取第3、6、9、12、15代細胞，流式細胞術檢測細胞表面標志，動態觀察培養過程中細胞表面標志的變化。消化收集細胞，計數后取8X IO6個細胞，分裝16管；PBS洗一次，1500rpm離心IOmin ;棄上清，殘留100 200 μ 1，吹打混勻細胞；加入PE標記的⑶14、CD29、CD31、CD34、CD44、CD54、CD73、CD80、CD86、CD166 抗體以及 FITC 標記的 CD45、CD105、HLA-ABC, HLA-DR、UEA-I抗體各10 μ 1，并設一管為空白對照；在4°C下，避光反應30 min ；PBS洗一次，1500rpm離心IOmin ;直接標記的細胞棄上清，加入200 μ I PBS吹打混勻細胞，200 μ I的1%多聚甲醛固定，置4°C待測，3天內上流式細胞儀檢測。流式細胞儀檢測細胞的表面標志，動態觀察第3、6、9、12、15代的細胞，無明顯改變。不表達造血細胞表面標志即⑶14、⑶31、⑶34 (HSPC及內皮細胞陽性)、⑶45 (白細胞陽性)、CD54 (ICAM-I)、CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2)、HLA-DR(MHC-II 類分子)持續陰性，CD29 和⑶44 (纖維蛋白和透明脂酸鹽的受體，基質細胞表達)、⑶73 (即SH-3、4)、⑶105 (即SH-2)、CD166 (間充質細胞表達)、HLA-ABC (MHC-I類分子)和UEA-I (內皮細胞的表面標志)持續為陽性。經3代以上傳代后，細胞成分均一，純度在95%以上。3、流式細胞術檢測胎盤MSC的細胞周期細胞長至80%左右融合時，消化收集細胞約I X IO6個，PBS洗一次，加入70%的乙 醇固定，4°C待測。檢測時，先離心去乙醇，再用PBS洗一次，加入RNase I 500u，37°C反應30min，PBS洗一次，加入碘化丙啶(PI，終濃度50 μ g/ml) 1ml，室溫避光反應20min，上機檢
測細胞DNA含量。經測定第3代和第6代細胞的DNA含量，細胞周期分析，G0ZG1期、S期和G2M期所占比例分別為96. 35%,96. 66%，I. 11%,O. 09%，和2. 54%,3. 25%。結果表明體外培養的細胞具有典型的干細胞增殖特點，即只有少數細胞處于活躍的增殖期(I. 11%、0. 09%)，大部分的細胞處于靜息期(96. 35%、96. 66%)。4、胎盤MSC生長曲線的繪制及對數生長期倍增時間的測定取對數生長期細胞，消化計數，以10% FBS的LG-DMEM培養基制成細胞懸液(2X 104/ml)，24孔板中每孔接種O. 5ml, 37°C，5%C02,飽和濕度下培養。每天取3復孔，臺盼藍染色后計數活細胞數，計算平均值，連續觀察7天。以培養時間為橫軸，細胞數為縱軸，繪制細胞生長曲線。以Patterson公式計算細胞在對數生長期的倍增時間，即Td=Tlg2/Lg(Nt/No)，Td :倍增時間(h)，T :細胞由No增至Nt所用的時間(h)，N :細胞數。通過每天細胞計數的結果繪制細胞生長曲線，計算倍增時間。由細胞生長曲線可以看出，細胞在第2-4天處于指數生長期。根據公式計算出第5代細胞在指數生長期的倍增時間在18-30小時范圍內。5、胎盤MSC多向分化潛能的鑒定(I)成骨誘導3代以上MSC，按I X IO5/孔接種六孔板，放于37°C、5%C02、飽和濕度下，MSC培養基中培養24h后，換用含10%經篩選FBS的DMEM-HG并加入地塞米松O. I μ Μ、抗壞血酸磷酸鹽50μΜ、β-磷酸甘油10mM，放于37°C、5%C02、在飽和濕度下培養，每3天半量換液，共誘導2-4周。堿性磷酸酶染色鑒定成骨細胞形成，Von Kossa染色鑒定骨結節形成。在含10%經篩選FBS的DMEM-HG，加入地塞米松O. I μ Μ、抗壞血酸磷酸鹽50 μ Μ、β -磷酸甘油IOmM培養I周，細胞形態發生明顯的改變，由紡錘形的成纖維細胞樣變為多角形，類似于神經元細胞樣，細胞周邊出現長絲狀突出，并可向周圍延伸。繼續培養2周以上后，細胞基質中出現鈣化斑，礦化物逐漸出現，并且開始形成多層小結結構，至培養4周后，可見明顯鈣化結節。2周時堿性磷酸酶染色呈強陽性反應，達到95%以上，而未加以誘導的對照組則大部分為陰性，只有不到5%顯示為弱陽性，表明細胞已向成骨細胞轉化。vonKossa染色可將骨結節中沉積的鈣染成黑色，誘導組可見大量的黑色骨結節，有明顯的立體結構，而對照組在任何時間都沒有陽性反應。(2)成脂肪誘導3代以上MSC，按I X IO5/孔接種于六孔板，放于37°C、5%C02、飽和濕度下，在MSC培養基中培養24h后，換用含10%經篩選FBS的高糖DMEM，并加入地塞米松I μ Μ、消炎痛60 μ M、IBMX O. 5mM、胰島素5 μ g/ml，放于37°C，5%C02，飽和濕度下培養，每3天半量換液，共誘導2周，油紅染色鑒定脂滴形成。在含10%經篩選FBS的DMEM-HG，加入地塞米松I μ Μ、消炎痛200 μ M、IBMX O. 5mM、胰島素10 μ g/ml培養3天，細胞即發生形態改變，由紡錘形的成纖維細胞樣逐漸收縮變短，90%以上細胞成為立方形或多角形；連續培養7天，鏡下可見細胞內有微小脂滴出現，隨著培養時間的延長，脂滴逐漸增大并融合，至培養2周時，可見融合成團的脂滴充滿整個細胞。油紅O染色可見細胞內產生的脂肪被特異性染成紅色。 _2] (3)成軟骨誘導3代以上細胞，按照每管2X IO5細胞分裝到15ml聚丙烯離心管，低速離心使細胞在試管中形成微團，在含2. 5%FBS的DMEM-HG中加入胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉各6. 25 μ g/ml, BSA I. 25 μ g/ml,丙麗酸納 ImM/L,抗壞血酸憐酸 37. 5 μ g/ml, TGF-β : 50ng/ml，放于37°C、5%C02、飽和濕度下培養，每3天半量換液，連續培養2周。誘導2周后將細胞微團打散涂片，阿辛藍(Alcian blue)染色可見II型膠原形成細胞外基質呈藍色，對照組無藍染。通過以上一系列數據指標的檢測，顯示出應用本發明方法分離得到的MSC，具有向成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞分化的能力，證實本發明方法獲得的MSC具有干細胞特性。實施例8、胎盤干細胞庫的津立I、細胞活件的檢測利用臺盼藍染色法計數凍存前后活細胞的數目。2、細胞污染的檢測利用少量細胞培養，檢測細胞是否受到真菌和細菌的污染。利用病原學方法，檢測細胞是否受到乙肝兩對半、丙肝、艾滋、巨細胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg, HbsAb, HBcAb,HbeAg, HbeAb, HCVAb, HIV_l/2Ab、CMV-IgM 和 EBV-IgA、TRUST 感染。3、遺傳病的檢測利用分子遺傳學的方法，檢測凍存細胞是否存在遺傳病。4、HLA-ABC/DR 配型檢測細胞HLA-ABC/DR表型，并記錄在案。5、細胞來源的調杳記錄胎兒及其父母的詳細資料，并記錄在案。6、胎盤干細胞數據庫的津立在保存正常的胎盤干細胞后，建立胎盤干細胞的數據庫，其中包括前五項資料，并建立與凍存細胞的關聯。
權利要求
1.處理胎盤全細胞的方法，該方法包括 (A)以下對胎盤離體新鮮組織全細胞進行分離和凍存的步驟 (1)胎盤組織清洗通過緩沖液(例如PBS緩沖液)清洗胎盤組織，使胎盤組織表面殘留血液沖洗干凈，胎盤表面無血液凝塊； (2)胎盤組織消化處理從步驟⑴得到的胎盤組織上剪下胎盤小葉，加入緩沖液(例如PBS緩沖液)并將小葉剪碎，加入消化酶溶液(例如其非限制性地包含胰酶)中，消化處理5-40分鐘(例如20分鐘)； (3)胎盤組織過濾處理加入FBS(Gibco)溶液終止消化，將消化處理后的胎盤組織碎片轉移至過濾裝置，對胎盤組織碎片進行研磨，同時收集濾液，對濾液進行細胞清洗； (4)配制胎盤全細胞凍存液所述胎盤全細胞凍存液中包含人血白蛋白、DMSO(二甲基亞砜)和DMEM-F12，配好的凍存液放在1°C至7 V (例如4°C )的溫度條件下低溫冷藏； (5)胎盤全細胞凍存將步驟(3)得到的胎盤組織過濾液離心后去除上清液，在0-15°C (例如1°C至TC，例如4°C )的低溫環境下，加入步驟(4)得到的全細胞凍存液，然后轉移至凍存容器中，凍存容器放入程序降溫裝置，先在1°C至TC (例如4°C)的溫度條件下低溫冷藏0. 2-2小時(例如0. 5小時)，再在-10°C至_150°C (例如_80°C )的溫度條件下冷凍0. 25-3天(例如I天)，然后將凍存容器于液氮中冷凍，備用； 任選地，進一步進行(B)以下對凍存的胎盤離體新鮮組織全細胞進行復蘇的步驟 (6)凍存胎盤全細胞復蘇將步驟(5)冷凍的胎盤全細胞從液氮中取出，解凍至20%-70%(例如50%)凍存液開始融化，利用間充質干細胞培養基清洗細胞，離心處理清洗DMS0，去除上清液，進行紅細胞裂解步驟，離心處理后去除上清液，觀察紅細胞裂解情況，如有需要再重復紅細胞裂解的步驟進行裂解，最后進行細胞清洗步驟，去除上清液； 任選地，進一步進行(C)以下對復蘇的胎盤全細胞進行間充質干細胞分離和擴增的步驟 (7)細胞培養向步驟(6)得到的全細胞中補加適量的間充質干細胞培養基重懸細胞，接種至培養容器，再將培養容器放進培養箱中進行培養，培養至第4-7天(例如第5天，例如第6天，例如第7天)時將培養容器從培養箱中取出，進行第一次半換液，繼續培養，在第8-10天(例如第9天)時將培養容器從培養箱中取出，進行第二次半換液，繼續培養，在第11-13天(例如第12天)時將培養容器從培養箱中取出，加入5-20ml (例如10_18ml，例如15ml)間充質干細胞培養基，往后每1-4天(例如2-3天)進行一次全換液； (8)細胞傳代當培養容器中的貼壁細胞融合率達到40%-90%(例如80%)以后，利用消化酶(例如TrypLe Express)將貼壁細胞脫離容器底部,離心,抽走上清液,加入充質干細胞培養基重新懸浮細胞，再接種于培養容器進行傳代并進行擴增培養，此后每1-3天(例如每2天)換液一次，直至融合率達到70-90%(例如80%)后，即得胎盤間充質干細胞，必要時進行傳代； 以及任選的下列一個或多個步驟 (9)對針對步驟(8)所得胎盤間充質干細胞，檢測以下項目的至少一項細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型； (10)將步驟(8)所得傳代后的胎盤間充質干細胞于液氮中冷凍，備用。
2.根據權利要求I的方法，其中所述胎盤組織凍存液中包含約15重量份的人血白蛋白、約10重量份的DMSOJS 65重量份的DMEM-F12。
3.根據權利要求I的方法，其中步驟(2)中，消化處理的時間為10-30分鐘。
4.根據權利要求I的方法，其中步驟(5)中，利用間充質干細胞培養基清洗胎盤全細胞米用的是點滴法。
5.根據權利要求I的方法，其中所述間充質干細胞培養基中包含FBS、L-Glutamine,Gentamicin 和 DMEM-F12。
6.根據權利要求I的方法，其中 所述間充質干細胞培養基中含有10-20%的FBS ； 所述間充質干細胞培養基中含有0. 5-2%的L-Glutamine ； 所述間充質干細胞培養基中含有0. 02-0. 1%的Gentamicin ;和/或 所述間充質干細胞培養基中含有80-90%的DMEM-F12。
7.根據權利要求I的方法，其中步驟(6)所述紅細胞裂解步驟是加入PBS重懸細胞，向細胞懸液中再加入紅細胞裂解液，細胞懸液與裂解液的比例為1:1至1:5，優選比例為1:2至1:3，常溫條件為0-30°C，優選15-25°C，培養時間為5_20分鐘，優選10-15分鐘。
8.根據權利要求I的方法，該方法包括以下步驟 (1)胎盤組織清洗胎盤組織是在生物安全柜內進行處理，根據胎盤大小使用適量PBS緩沖液對胎盤組織進行沖洗2-3遍，使胎盤組織表面殘留血液沖洗干凈，胎盤表面無血液減塊； (2)胎盤組織消化處理使用手術剪從步驟(I)得到的胎盤組織上剪下胎盤小葉，把小葉轉移到培養皿上，加入25ml PBS緩沖液并把胎盤小葉盡量剪碎，加入25ml 0. 25%胰酶(Gibco)(胰酶跟PBS緩沖液體積比例為1:1)并混勻組織，把培養皿放進37°C的恒溫搖床里消化20分鐘； (3)胎盤組織過濾處理往培養皿里加入5mlFBS(Gibco)并混勻以達到終止消化的目的，把消化過后的胎盤組織碎片轉移到200目金屬過濾器上，對胎盤組織碎片進行研磨并利用另一培養皿收集過濾完的液體，分開兩次往金屬過濾器加入IOml的PBS緩沖液清洗組織并繼續研磨，將收集的濾液轉移至50ml離心管，以速度1400rpm離心10分鐘，去除上清液并加入PBS緩沖液重懸細胞，以速度1400rpm離心10分鐘，去除上清液，加入PBS緩沖液重懸細胞，抽取小量樣本進行細胞計數，以速度1400rpm離心10分鐘以達到清洗細胞的效果; (4)配制胎盤全細胞凍存液所述胎盤全細胞凍存液中包含15重量份的人血白蛋白、.10重量份的DMSO ( 二甲基亞砜)和65重量份的DMEM-F12，配好的凍存液放在4°C冰箱保存直至使用； (5)胎盤全細胞凍存將步驟(3)得到的胎盤組織過濾液離心后去除上清液，在4°C的低溫環境下，加入步驟(4)得到的全細胞凍存液，然后以每一管每毫升4X IO7到IXlO8的細胞密度加入凍存管里，此過程需在4°C的低溫條件下進行，將凍存管放入程序降溫盒里，先在4°C的溫度條件下低溫冷藏0. 5小時，再_80°C的溫度條件下冷凍I天，然后將凍存管于液氮中冷凍，備用； 所述凍存方法中還可以選擇與冷凍配套使用的復蘇步驟 (6)凍存胎盤全細胞復蘇將步驟(4)冷凍的胎盤全細胞從液氮中取出，放在恒溫水浴里解凍至一半凍存液開始融化，利用間充質干細胞培養基(其例如包含15% FBS+1%L-Glutamine+O. 05% Gentamicin+84%DMEM-F12)進行點滴法清洗胎盤全細胞，解凍獲得的細胞懸液與間充質干細胞培養基的體積比為1:3 (1ml :3ml)，將混合有間充質干細胞培養基的細胞懸液轉移到離心管，以速度1400rpm離心10分鐘清洗DMSO，去除上清液，加入PBS緩沖液重懸細胞，并以I份細胞懸液比2-3份紅細胞裂解液的比例加入紅細胞裂解液(Roche),在15-25°C的環境下培養10-15分鐘，放進離心機以速度1400rpm離心10分鐘進行離心，離心后去除上清液，觀察紅細胞裂解情況，如有需要再重復紅細胞裂解的步驟進行裂解，最后加入PBS緩沖液重懸細胞并抽取小量樣本進行細胞計數，放進離心機以速度1400rpm離心10分鐘進行離心以清洗細胞，去除上清液； 所述凍存方法中還可以選擇復蘇后間充質干細胞分離和擴增的步驟 (7)細胞培養向步驟(6)得到的全細胞中補加適量的間充質干細胞培養基重懸細胞，轉移到T25培養瓶，再將T25培養瓶放進CO2濃度為5%的37°C培養箱中進行培養，培養至第6天時將T25培養瓶從培養箱中取出，進行第一次半換液，繼續培養，在第9天時將T25培養瓶從培養箱中取出，進行第二次半換液，在第12天把平皿里面的培養基抽走，加入15ml間充質干細胞培養基繼續培養，往后每2天進行一次全換液； (8)細胞傳代當T25培養瓶里面的貼壁細胞融合率達到80%左右，可利用消化酶(TrypLE Express)將貼壁細胞脫離T25培養瓶底部，離心后移除上清液，并加入間充質干細胞培養基重新懸浮細胞，接種于T25細胞培養瓶進行傳代，并進行擴增培養；此后每兩天換液一次直至融合率達到80%后，即得，必要時再進行傳代； 以及任選的下列一個或多個步驟 (9)針對以上步驟(8)所得胎盤間充質干細胞，檢測以下項目的至少一項細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型。
(10)將以上步驟(8)所得傳代后的胎盤間充質干細胞于液氮中凍存，備用。
9.建立胎盤干細胞數據庫的方法，其包括權利要求1-8任一項所述方法的步驟，以及如下步驟將傳代后的細胞于液氮中凍存并記錄相關胎兒信息，并進行細胞的生物學特性及多向分化潛能鑒定，以及對細胞進行分子遺傳學診斷，保存細胞的所有相關數據，建立胎盤干細胞的數據庫并與凍存細胞進行關聯。
10.一種胎盤間充質干細胞，其是根據權利要求1-8任一項所述方法獲得的。
全文摘要
本發明涉及胎盤全細胞分離、凍存和復蘇以及復蘇后干細胞分離和擴增的方法，其包括如下步驟對胎盤組織進行消毒和清洗；從組織剪下胎盤小葉，消化處理20分鐘；配制胎盤組織凍存液備用；將消化處理得到的全細胞和凍存液加入凍存管中，在4℃的溫度條件下低溫冷藏0.5小時，再-80℃的溫度條件下冷凍1天，然后液氮中冷凍備用；需要時將胎盤全細胞從液氮中取出，恒溫水浴解凍，利用間充質干細胞培養基進行點滴法清洗，利用紅細胞裂解液清除紅細胞，復蘇的胎盤全細胞可通過細胞培養和細胞傳代擴增間充質干細胞。本發明方法可有效保護凍存胎盤組織，且方便復蘇使用，尤其適合復蘇后分離和擴增間充質干細胞。
文檔編號C12N5/0735GK102807966SQ201210292509
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月16日 優先權日2012年8月16日
發明者林卓衡, 朱業峰, 陳俊峯, 周丹 申請人:博雅干細胞科技有限公司