專利名稱：一個(gè)簇毛麥6vs染色體特異的分子標(biāo)記6vs-spb及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和遺傳育種科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)特異追蹤簇毛麥6VS染色體的分子標(biāo)記及其用法。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)侨蛉蠹Z食作物之一，也是我國總產(chǎn)第一的糧食作物，是保障我國糧食安全的重要決定因素之一。小麥在其生育進(jìn)程中常會(huì)受到生物或非生物脅迫的影響。小麥白粉病是一種世界性小麥病害，近年來隨著我國農(nóng)田水利設(shè)施改善和水肥條件提高，其危害逐年加重。通過遠(yuǎn)緣雜交和染色體工程技術(shù)手段育成的小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位系對(duì)目前已發(fā)現(xiàn)的白粉病生理小種均表現(xiàn)高抗或免疫，其抗白粉病基因位于簇毛麥6V染 色體短臂上(6VS)，是目前對(duì)小麥白粉病抗譜最廣、抗性最強(qiáng)的基因。近年來T6AL. 6VS易位系在小麥抗白粉病新品種選育中得到廣泛利用，目前已育成20多個(gè)抗白粉病小麥新品種，推廣面積超過5000萬畝。T6AL. 6VS易位系是在普通小麥遺傳背景中由簇毛麥6V染色體短臂(6VS)替換了普通小麥6A染色體的短臂(6AS)，從而形成T6AL. 6VS易位染色體。由于簇毛麥與普通小麥親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，導(dǎo)致二者不發(fā)生染色體重組，T6AL. 6VS易位染色體始終以易位的形式出現(xiàn)在后代中。目前，未發(fā)現(xiàn)利用T6AL. 6VS易位系培育的新品種或新品系中出現(xiàn)染色體易位形式的改變。因此，簇毛麥6VS控制的性狀及其載有的DNA序列均以協(xié)同傳遞的方式出現(xiàn)在后代中。目前，部分研究已公布了部分與6VS上抗白粉病基因Pm21連鎖的相關(guān)分子標(biāo)記OPT171400,OPT171900 ,SCAR1400,SCAR1265,NAU/XiBao15902 和 NAU/XiBaol61586。但是，總體而言，這些標(biāo)記在標(biāo)記輔助選擇育種中都存在不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，一個(gè)原因是由標(biāo)記類型決定的，如RAPD標(biāo)記0PT1714(KI和0PT1719(i(i ;其次是由于PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件要求苛刻，PCR結(jié)果可重復(fù)性差造成的。這些缺點(diǎn)均不利于標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在小麥育種實(shí)踐中的應(yīng)用。EST (expressed sequence tag,表達(dá)序列標(biāo)簽)是指從植物不同組織來源的cDNA文庫中隨機(jī)挑選克隆，對(duì)其5’和3’端進(jìn)行測(cè)序獲得的短cDNA序列。EST-STS(sequence-tagged site, STS)標(biāo)記是直接依據(jù)已經(jīng)定位于基因組物理圖上的EST序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)基因組或者cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，從中尋找與目的基因連鎖或具有染色體特異性的EST標(biāo)記。由于EST-STS標(biāo)記直接來源于表達(dá)基因序列，保守性較高，特別有利于界定物種之間的差異。因此，基于比較基因組學(xué)原理，利用普通小麥EST圖譜，同樣可以開發(fā)普通小麥親緣物種簇毛麥特定染色體的特異性分子標(biāo)記。本發(fā)明就是基于上述思想指導(dǎo)下，利用比較基因組學(xué)原理，根據(jù)普通小麥bin-map圖譜上第6部分同源群短臂上的EST序列設(shè)計(jì)以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的EST-STS標(biāo)記，篩選簇毛麥6V染色體短臂(6VS)特異性分子標(biāo)記，用于快速檢測(cè)和追蹤普通小麥遺傳背景中T6AL. 6VS易位染色體及其控制的抗白粉病性狀，為小麥抗白粉病分子標(biāo)記輔助選擇育種提供新型、實(shí)用、高效的分子標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種特異追蹤簇毛麥6VS染色體的分子標(biāo)記及其用法，它利用比較基因組學(xué)原理，根據(jù)普通小麥bin-map圖譜上第6部分同源群短臂的EST序列，設(shè)計(jì)以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的EST-STS標(biāo)記引物，篩選簇毛麥6VS染色體特異性分子標(biāo)記，為抗白粉病小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位系在小麥抗白粉病新品種培育中的應(yīng)用提供一種新型、實(shí)用、高效的分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)。為了解決背景技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案它是根據(jù)普通小麥bin-Map圖譜第6部分同源群短臂的EST序列BE499423設(shè)計(jì)得到的，標(biāo)記引物擴(kuò)增出的一段約900bp的DNA條帶位于簇毛麥6VS染色體，可以特異地追蹤6VS染色體及其控制的抗小麥白粉病性狀，標(biāo)記引物序列為
6VS-SPBF :5’-TCATGCTTTAGCTGAGTTTGACCAGA-3’ (SEQ ID NO. I), 6VS-SPBR :5’ -GAACTTCCACAGCTTCTCATTTGAACAT-3’ (SEQ ID NO. 2)。本發(fā)明還公開了所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標(biāo)記6VS-SPB在追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體中的用途。用所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標(biāo)記6VS-SPB追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色的方法，是用該分子標(biāo)記引物對(duì)待測(cè)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出900bp條帶的材料，為含有小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體的材料。本發(fā)明所述分子標(biāo)記的具體用法為
(1)PCR反應(yīng)體系:IOmL反應(yīng)體系中含約10 20ng模板DNA，I XPCR buffer, I. 5mmolΓ1 MgCl2, 200mmol Γ1 dNTP，兩條引物終濃度各為0. 2mmol Λθ. 5U Taq DNA聚合酶，用無菌蒸懼水補(bǔ)充反應(yīng)體系至IOmL ；
(2)PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性20秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，32個(gè)循環(huán)；72°C延伸5分鐘；4°C保存；
(3)PCR產(chǎn)物檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，用銀染法染色。本發(fā)明在利用T6AL. 6VS易位系為親本進(jìn)行抗白粉病性狀的追蹤時(shí)，凡是擴(kuò)增出900bp條帶的材料，都含有小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體，并對(duì)白粉病表現(xiàn)高抗；凡是不能擴(kuò)增出900bp條帶的材料，都不具有T6AL. 6VS易位染色體，相應(yīng)丟失由6VS染色體控制的白粉病抗性。本發(fā)明具有以下有益效果
I、本發(fā)明的分子標(biāo)記6VS-SPB在鑒定簇毛麥6VS染色體時(shí)特異性強(qiáng)已開發(fā)的分子標(biāo)記0PT1714(i(i和0PT1719(i(i都非6VS特異性標(biāo)記，只有在親本間存在與6VS的多態(tài)性時(shí)，才可以利用，而使用6VS-SPB時(shí)，無論涉及何種親本，只要出現(xiàn)900bp條帶，就可以確定材料中含有6VS染色體。2、本發(fā)明的6VS染色體特異性EST-STS標(biāo)記相較SCAR標(biāo)記更易于識(shí)別PCR擴(kuò)增失敗導(dǎo)致的“假陰性”:本發(fā)明的標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，在普通小麥遺傳背景中，無論是否具有T6AL. 6VS易位染色體，都可以擴(kuò)增出兩條大于IOOObp的背景條帶，可用于判斷PCR擴(kuò)增是否成功，排除“假陰性”。


圖I :分子標(biāo)記 6VS-SPB 的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果。M DNA marker DL2000 ；1 :簇毛麥；2 普通小麥；3 :小麥-簇毛麥易位系T6AL. 6VS。箭頭所示為900bp的特異性條帶。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明具體實(shí)施方式
采用以下技術(shù)方案根據(jù)小麥bin-Map圖譜第6部分同源群的EST序列BE499423設(shè)計(jì)一對(duì)標(biāo)記引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出的一段900bp的DNA條帶，該條帶可位于簇毛麥6VS染色體，能特異地追蹤6VS染色體及其控制的抗小麥白粉病性狀。實(shí)施例
I、引物的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)美國農(nóng)部網(wǎng)站http://wheat. pw. usda. gov的信息,搜索定位于普通小麥第6部分 同源群的EST序列,利用Primer Premier 5. O軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。2、簇毛麥6VS染色體特異性EST-STS標(biāo)記的篩選
(I)PCR擴(kuò)增以簇毛麥、普通小麥、小麥-簇毛麥易位系T6AL. 6VS為材料(均為公知公用種質(zhì)材料，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所提供)，提取基因組DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，IOmLPCR 反應(yīng)體系中含約 10 20ng 模板 DNA，1XPCR buffer, I. 5mmol L-I MgC12, 200mmol L-IdNTP，兩條引物終濃度各為0. 2mmol L_1，0. 5U Taq DNA聚合酶，用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至IOmL ;PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性20秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，32個(gè)循環(huán)；72°C延伸5分鐘；4°C保存。(2) PCR產(chǎn)物的檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠(29:1)上進(jìn)行電泳分離，采用銀染法染色。(3)PCR結(jié)果分析本發(fā)明篩選到一個(gè)簇毛麥6VS染色體特異的分子標(biāo)記6VS-SPB，標(biāo)記引物是根據(jù)定位于小麥第6部分同源群短臂的EST序列BE499423設(shè)計(jì)，具體序列為
6VS-SPBF :5’ -TCATGCTTTAGCTGAGTTTGACCAGA-3’ (SEQ ID NO. I),
6VS-SPBR :5’ -GAACTTCCACAGCTTCTCATTTGAACAT-3’ (SEQ ID NO. 2)。以該標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能在普通小麥中擴(kuò)增到兩條大于IOOObp的DNA條帶，在簇毛麥中擴(kuò)增到一條約為900bp的DNA條帶，而在小麥-簇毛麥易位系T6AL. 6VS中，既能擴(kuò)增到兩條大于IOOObp條帶，也能擴(kuò)增到一條約900bp條帶(見圖I),表明900bp條帶可定位于簇毛麥6VS染色體，因此，分子標(biāo)記6VS-SPB能在小麥背景中特異性追蹤簇毛麥6VS染色體。
權(quán)利要求
1.一個(gè)簇毛麥6VS染色體特異的分子標(biāo)記6VS-SPB，其特征在于該分子標(biāo)記引物序列為6VS-SPBF :5’ -TCATGCTTTAGCTGAGTTTGACCAGA-3’，6VS-SPBR :5’ -GAACTTCCACAGCTTCTCATTTGAACAT-3’。
2.權(quán)利要求I所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標(biāo)記6VS-SPB在追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體中的用途。
3.一種用權(quán)利要求I所述的簇毛麥6VS染色體特異的分子標(biāo)記6VS-SPB追蹤小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色的方法，是用該分子標(biāo)記引物對(duì)待測(cè)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出900bp條帶的材料，為含有小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位染色體的材料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)特異追蹤簇毛麥6VS染色體的分子標(biāo)記6VS-SPB及其用法，它涉及分子生物學(xué)和遺傳育種科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該標(biāo)記引物是根據(jù)小麥第6部分同源群短臂的EST序列BE499423設(shè)計(jì)，具體序列為6VS-SPBF5’-TCATGCTTTAGCTGAGTTTGACCAGA-3’，6VS-SPBR5’-GAACTTCCACAGCTTCTCATTTGAACAT-3’，以標(biāo)記引物進(jìn)行PCR時(shí)能擴(kuò)增出一條900bp的特異性DNA條帶，能有效追蹤簇毛麥6VS染色體及其控制的抗小麥白粉病性狀，在小麥抗白粉病分子標(biāo)記輔助選擇育種中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102807985SQ20121029471
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月20日
發(fā)明者何華綱, 別同德, 朱姍穎, 洪好, 粱瑩, 孫衛(wèi)紅 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)