專利名稱：一種轉移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物化學領域，特別涉及一種轉移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽，還涉及此多肽和多核苷酸重組質粒的制備和應用以及該多肽物質對Metastasis suppressor I ニ聚化抑制作用生物活性。
背景技術：
Inverse BAR (I-BAR)家族基因的表達產物蛋白能結合細胞膜，并能在細胞外刺激作用下對細胞膜的形態變化和細胞狀況做出調節[Frost, A.et al. (2009) Cell137(2) :191-196. ] οMetastasis suppressor I (以下簡稱 Mtssl) [Lee, Y. G. et al. (2002) Neoplasia4(4):291-294.]基因是I-BAR家族的重要成員，由于其在轉移性細胞中表達異常，且對 膜運動、細胞極性、胞內交織以及細胞移動具有調控功能[Mattila，P.K. et al. (2003)Journal of Biological Chemistry 278 (10):8452-8459.]。近期對人類惡性腫瘤樣本的研究顯示，在多種晚期膀胱癌和轉移性胃癌中發現Mtssl基因表達的缺失；由于和預后不良情況成反比，Mtssl基因表達的程度可做為某些癌癥患者無病生存率的診斷依據[Liu, K. et al. (2010)BMC Cancer 10:428.]。同時也有報道某些Mtssl基因過度表達以及染色體8q24. I上Mtssl基因位點擴增的腫瘤[Glassmann，A.et al. (2007)BMC Dev Biol 7:111·]。另タ卜，Mtssl 還是 Sonic hedgehog (Shh)響應基因之一 [Callahan, C. A. et al. (2004)Genes & Development 18 (22) : 2724-2729.],而Shh信號通路往往會促進作用腫瘤的發生[Bailey，J. M. et al. (2007) J Cell Biochem102(4) :829-839.]。盡管當前的數據暗示Mtssl基因異常表達與腫瘤進展相關，但Mtssl的生理功能及其信號通路對腫瘤進展的影響尚沒有得到充分闡明。Mtssl基因早先被認為與腫瘤轉移有關，在某些惡性腫瘤中表達降低[Lee，Y. G. et al. (2002)Neoplasia4 (4) : 291-294.]。該基因編碼全長759個氨基酸的蛋白，其N端帶有250個氨基酸組成的inverse Bin-Amphiphysin-Rvs (I-BAR)同源區，能形成扭曲的橢球形狀的ニ聚體結構，利用該結構形成的凸面結合細胞膜[Yamagishi, A. et al. (2004)Journal of Biological Chemistry279 (15) : 14929-14936. ]。I-BAR 家族蛋白在 N 端往往高度的保守，并且與細胞膜運動密切相關。研究表明Mtssl蛋白I-BAR區能結合PI (4，5)P2_富集的人工膜并引發絲狀偽足樣的膜突起[Saarikangas, J. et al. (2009)Curr Biol 19(2) :95-107. ] 此外，Mtssl I-BAR 能夠與小 GTP 酶 Rac 相互作用，結合細胞膜并交叉連接肌動蛋白細胞骨架[Bompard, G. et al. (2005) Journal of CellScience 118 (22) : 5393-5403. ]。Mtssl的C端還包括一個絲氨酸富集區(SRD)、ー個脯氨酸富集區(PRD)和ー個WASP同源2區(WH2)結構，這些位點能夠結合肌動蛋白單體[MattiIa, P. K. et al. (2003) J Biol Chem 278 (10) :8452-8459.]、皮層肌動蛋白[Lin, J. etal. (2005)Oncogene 24(12):2059-2066.]和 Daaml 等[Liu, ff. et al. (2011)Development138(10) :2035-2047.]細胞骨架調節相關蛋白。許多證據表明Mtssl的I-BARニ聚體在其構象形成和功能發揮發面具有重要作用；針對這一位點對進行阻斷，將有理由于了解Mtssl蛋白N端特殊的作用。在結構上，兩個Mtssl蛋白分子能夠借助其N端的I-BAR區域結合成ニ聚體的結構，這ー結構能結合細胞膜并促使膜形成偽足狀突起[Woodings, J. A. et al. (2003)Biochemical Journal 371:463-471.]。Mtssl蛋白ニ聚體發揮生物活性的機制尚未闡明，這就需要發現有針對性的相關抑制劑，用以研究ニ聚化作用能否影響Mtssl介導的細胞膜變化和內吞作用，以及ニ聚化作用與Mtssl蛋白對肌動蛋白細胞骨架調節之間的聯系。
發明內容
發明目的本發明的目的在于提供ー種能夠有效抑制Mtssl蛋白ニ聚化作用的多肽，編碼這些多肽物質的多核苷酸以及該多核苷酸重組載體。
技術方案本發明提供了一種轉移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽，包含SEQ ID No 2所示的氨基酸序列。作為改進，本發明提供的轉移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽，還包含SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的片段或類似物。作為進ー步改進，本發明提供的轉移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽，還包含SEQ IDNo 2所示的氨基酸序列的多肽的片段，或與SEQ ID No 2所示的氨基酸序列具有80%以上同源性的多肽。本發明還提供了ー種多核苷酸，它編碼包含SEQ ID No 2所示的氨基酸序列的堿基序列。作為改進，該多核苷酸編碼包含SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的多肽或其片段、類似物的堿基序列。該多核苷酸包含SEQ ID No :I所示的堿基序列。作為改進，該多核苷酸包括SEQ ID No :I的堿基序列或與SEQ ID No :I的堿基序列有80%以上的同源性。本發明還提供了 ー種重組質粒表達載體，它包含SEQ ID No 1所示的堿基序列；該重組質粒表達載體由上述的多核苷酸與外源表達載體質粒構建而成。本發明還提供了上述轉移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。該轉移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽通過與Mtssl蛋白I-BAR區結合,抑制Mtssl蛋白的ニ聚化作用，從而達到抑制腫瘤細胞內攝，干擾細胞膜形態變化以及干擾腫瘤相關信號傳導的效果。其中，多肽-蛋白的體外結合解離常數和抑制活性均在納摩爾級。有益效果本發明提供的轉移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽通過抑制Mtssl蛋白ニ聚化作用，抑制腫瘤細胞內攝，干擾細胞膜形態變化以及干擾腫瘤相關信號傳導，削弱由表皮生長因子EGF、血小板衍生因子TOGF或刺猬因子shh等腫瘤刺激因素引發的細胞增殖和生長，其中多肽-蛋白的體外結合解離常數和抑制活性均在納摩爾級。
圖I為轉染GFP標記的序列號2代表的多肽，在293T細胞中表達情況，用WesternBlot檢測的結果；其中目標蛋白分子量約38KD。圖2為純化的GST標記的序列號2代表的多肽，使用Commassie Blue染色的結果；其中目標蛋白分子量約35KD。圖3為GST柱結合的序列號2代表的抑制劑多肽與Mtssl蛋白結合能力的檢測結果；計算二者的解離常數在納摩爾級。圖4為GST標記的序列號2代表的抑制劑多肽抑制Mtssl ニ聚化能力的檢測結果；計算多肽的抑制活性在納摩爾級。
具體實施例方式
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根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、エ藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。試劑及儀器聚介: : PfuUltra II fusion HS DNA polymeraseStratagene 公司
單核苷酸混合物dNTPPromega公司
BamH I限制性內切酶NEB公司
SalI限制性內切酶NEB公司
3號酶切緩沖液NEB公司
T4 DNA連接酶和配套濃縮緩沖液Invitrogen公司
氨芐青霉素SIGMA公司
LB固體培養基GIBCO BRL公司 小牛血清BCSHyclone公司
DMEM高糖培養液Lonza公司
青霉素GffiCO公司
鏈霉素GIBCO公司
細胞轉染試劑SuperFectQiagen公司
S.O.C.培養基SIGMA公司
LB液體培_基Invitxogen公司
異丙基-beta-D-硫代半乳糖苷IPTGSIGMA公司
谷胱甘肽瓊脂糖凝膠 Glutathione Sepharose 4BAmerican Biosciences 公H]
化學發光底物Thermo公司
考馬斯亮藍BIO-RAD公司
鼠抗 anti-Myc 抗體(9E10)BD Biosciences 公'-同
鼠抗anti-Flag抗體SIGMA公司
Ilr \ i 凝膠 Protein A SepharoseGE Healthcare 公 ι
Mastercycler型DNA梯度熱循環儀eppendorf公司
細胞培養皿BD Falcon公司
Centricon YM-30 超濾管Millipore 公司
ImageStation 2000丨冬丨像糸統Kodak公'丨丨'j正常培養液為含10%小牛血清BCS的DMEM高糖培養液。實施例IGST標記的多肽編碼DNA質粒的構建。以鼠源重組DNA質粒P Mtssl-Myc-His 為模板，5’_CAGTTAGGATCCACCATCATCAGCGAC-3’和5’ -CAGTTAGTCGACCTAGATGCTCCGGTG-3’序列的多核苷酸為引物，進行PCR擴增。擴增反應條件為50 μ I反應體系，使用PfuUltra II fusion HS DNA polymerase及其配套IOx 緩沖液，dNTP 各 250 μ M，模板 DNA 20ng/μ 1，引物各 O. 5 μ Μ。在 Mastercycler 型 DNA梯度熱循環儀上按下列條件反應30個循環95°C，20s ；67.4°C,20s ;72°C，15s。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳和紫外成像確認分子量約250bp，使用苯酚、氯仿和異戊醇的混合液(25:24:1)抽提，水層加入終濃度約O. 3mol/L的NaAc和2倍量的無水こ醇混勻，高轉速離心5分鐘，得到的沉淀使用70%こ醇洗滌，室溫晾干后使用純水溶解。之后將上述PCR產物同時還有5 μ g載體質粒分別在37 °C下使用BamHl和Sal I限制性內切酶于3號酶切緩沖液中孵育消化60分鐘，目的是將PCR產物(即插入序列)以及載體的5’和3’兩端完全修飾以便進行粘性末端連接。酶切反應結束后分別使用瓊脂糖凝膠電泳割膠純化插入序列和載體，純化后的插入序列和載體DNA以3:1的摩爾比(4. 5nM:l. 5nM)于20 μ I總體積的緩沖液(由IOx配套濃縮緩沖液配制)中在O. I單位的Τ4 DNA連接酶催化下室溫反應2h。取I μ I連接反應液轉染DH5ci感受態細胞，接種至含氨芐青霉素的LB固體培養基，得到的陽性克隆經質粒純化后進行DNA測序最終確證質粒構建。 實施例2序列號2代表的抑制劑多肽，其多核苷酸重組質粒在真核/原核細胞中的表達和檢測。人胚腎細胞293Τ細胞的培養使用含10%小牛血清BCS的DMEM高糖培養液，加入終濃度為100units/ml的青霉素和100 μ g/ml的鏈霉素進行培養。DNA轉染前，將I. 5xl06細胞接種在IOOmm細胞培養皿中使用不含抗生素的正常培養液在37°C和5%C02條件下培養過夜。隨后制備轉染混合物=IOyg綠色熒光蛋白GFP標記的抑制劑多肽質粒DNA，300 μ IDMEM,60 μ I SuperFect0轉染混合物經室溫孵育5_10分鐘后加入3ml正常培養液混勻，用以替換細胞培養液培養細胞2-3h，隨后再更換成正常培養液培養48h進行表達，表達情況可以直接使用熒光顯微鏡檢測綠色熒光，或將細胞收集、裂解后取裂解液進行檢測。100 μ I DH5 α感受態細胞與IOOng谷胱甘肽轉移酶GST標記的質粒DNA混合后于4°C靜置30min后，立即放入42°C水浴熱休克45sec，再置于4°C下2min，隨后添加O. 9mlS.O. C.培養基，37°C下200rpm轉速培養lh。取20 μ I上述培養液，接種至含有氨芐青霉素的LB固體培養基，在37°C下培養過夜。得到的陽性克隆需要經瓊脂糖凝膠電泳確認分子量。挑取單個克隆在3ml含30 μ g/ml氨芐青霉素的LB液體培養基中37°C下200rpm轉速培養過夜，隨后再添加IOOml預熱過的LB液體培養基(含50 μ g/ml氨芐青霉素)200rpm轉速37°C下培養l-2h直到體系的0D_值達到O. 3-0. 4，此時加入終濃度O. 4mM的異丙基-beta-D-硫代半乳糖苷IPTG繼續培養90min。4°C下5000xg離心收獲細胞，在IOml含有PMSF的PBS緩沖液中超聲裂解，并收集上清液。在上清液中加入2ml的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠GlutathioneSepharose 4B50%磷酸鹽緩沖液(PBS)懸濁液，4°C下30rpm培養2h，棄上清，使用PBS洗滌沉淀，得到GST柱結合多肽。再使用含IOmM還原型谷胱甘肽的50mM Tris (pH8. O)洗脫，洗脫液用PBS在CentriconYM-30超濾管中4°C下離心超濾得到較純的GST標記多肽蛋白PBS溶液。檢測多肽的方法如下。以10%SDS_聚丙烯酰胺凝膠電泳分離多肽樣品。針對細胞裂解液，使用Western Blot方法，即把凝膠在350mA電流4°C下濕法電轉Ih至硝酸纖維膜，以兔抗GFP抗體的1: 500的5%脫脂牛奶稀釋液在4°C下孵育過夜，TBST緩沖液洗滌后在以辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 1:1000的5%脫脂牛奶稀釋液室溫孵育30分鐘，TBST緩沖液洗滌之后使用化學發光底物顯色并在ImageStation 2000圖像系統上曝光成像得到檢測數據(如圖I);針對純化的GST多肽，則使用考馬斯亮藍室溫染色過夜，再使用脫色液(含30%冰醋酸，40%甲醇，其余為水)室溫脫色2h得到檢測結果(如圖2)。實施例3GST柱結合的序列號2代表的抑制劑多肽與Mtssl蛋白結合能力的檢測。將pMtssI-Myc-His質粒轉染至293T細胞，表達后的細胞裂解液中加入不同濃度的GST柱結合多肽，在4°C下30rpm培養2h，取上清樣品，以8%十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離。使用Western Blot法,分別利用鼠抗anti-Myc抗體(9E10)和山羊抗鼠IgG處理之后再用化學發光 底物顯色并曝光成像得到結合能力數據，同時利用β -actin作為內部參照以確定加樣量(如圖3)。樣品中Mtssl-Myc數量越少，暗示GST柱結合多肽的結合能力越強。實施例4GST標記的序列號2代表的抑制劑多肽抑制Mtssl ニ聚化能力的檢測。將鼠源重組DNA質粒pFlag-Mtssl和pMtssl_GFP共轉染至293T細胞進行表達，48小時候收集細胞并裂解，裂解液按照200 μ I體積分裝7組，其中加入不同濃度的GST標記的抑制劑多肽溶液，在4°C下30rpm培養2h。取樣品上清，加入I μ I的兔抗GFP抗體以及20 μ I Protein A Sepharose的50%PBS懸池液混勻，在4°C下30rpm培養Ih,此時ニ聚化的Flag-Mtssl和Mtssl-GFP蛋白將形成免疫共沉淀。收集上清，以8%SDS_聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離。使用Western Blot法,分別利用鼠抗anti-Flag抗體和山羊抗鼠IgG處理之后再用化學發光底物顯色并曝光成像得到結合能力數據，同時利用β-actin作為內部參照以確定加樣量(如圖4)。樣品中Flag-Mtssl的量越多，暗示GST標記多肽的抑制ニ聚化能力越強。
權利要求
1.一種轉移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽，包含SEQ ID No :2所示的氨基酸序列。
2.一種多核苷酸，編碼包含SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的堿基序列。
3.根據權利要求2所述的多核苷酸，其特征在于包括SEQID No :1所示的堿基序列。
4.一種重組質粒表達載體，其特征在于它包含SEQ ID No : I所示的堿基序列。
5.權利要求I所述的轉移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述轉移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽與Mtssl蛋白I-BAR區結合，并抑制Mtssl蛋白的二聚化作用。
全文摘要
本發明提供了一種轉移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽，包含SEQ ID No2所示的氨基酸序列。本發明還提供了編碼該多肽的多核苷酸以及該多核苷酸重組載體。該轉移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽通過抑制Mtss1蛋白二聚化作用，從而達到抑制腫瘤細胞內攝，干擾細胞膜形態變化以及干擾腫瘤相關信號傳導的效果，其中多肽-蛋白的體外結合解離常數和抑制活性均在納摩爾級。
文檔編號C12N15/63GK102816225SQ20121029454
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月17日 優先權日2012年8月17日
發明者詹熙, 吉民, 曹萌 申請人:東南大學